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十二、傳 染 性 可 利 查
(Infectious coryza)
友善列印
作者: 呂榮修
詳細內容:
一)

病名及病原:

  1.病名:傳染性可利查 (Infectious coryza)
2.病原:是由雞副嗜血桿菌所引起 (Haemophilus paragallinarum)。
   
(二)

疾病簡介:

    本病係雞的急性傳染病,感染雞流鼻涕,氣管囉音等呼吸症狀,並有流淚、眼下竇與顏面腫脹及產蛋率驟降為主徵。本病呈世界性分布,在台灣自從 1964 年由呂榮修等確認本病之存在後,每年都有流行。本病對中雞以上雞齡的雞較常發生,如發生在中雞其成長會受阻,同時對蛋雞及種雞會引起長期之產蛋率驟降,甚至死亡,又加以病程之漫長,且常與 CRD 併發又因藥物療效不彰而造成更大損失。
   
(三) 典型之臨床症狀及病理變化:
    病雞之症狀常見流水樣性鼻涕,臉部尤其是眼下竇腫脹,公雞多見肉垂腫脹,眼有結膜炎及流淚,由氣管發出囉音及開口呼吸、食慾減退、臉色蒼白、產蛋率降低、排綠色便。一般病程約 2 週,甚至有 4 週以上者,如與 CRD 伴發者症狀更為複雜。
  本病主要病變多在鼻腔,眼下竇及氣管粘膜之卡他性炎症,肉眼上在鼻腔眼窩下竇充滿水樣乃至粘稠液,粘膜呈潮紅浮腫性腫脹,下顎部皮下組織有漿液浸潤。顯微病變則以鼻腔、眼窩下竇及氣管有粘膜性及腺性上皮的脫落及增生,粘膜有水腫、充血、異嗜球浸潤。這些病變大概在感染後 7-10 天最嚴重,至 14-21 日後逐漸恢復。
   
(四)

應採病材:

    本病原菌之分離需由早期發病雞集來採樣,病雞可直接從眼下竇腫脹部位以碘酒消毒後,以普通肉羹培養液注入眼下竇內,再抽出滲出液培養,或病雞殺死後以碘酒及酒精棉消毒眼腫脹部位之皮膚,然後以無菌之剪刀或解剖刀切開皮膚,用無菌棉花拭子插入眼下竇採樣。通常在發病早期可由眼下竇分離到純粹的 H. paragallinarum 菌。亦可由氣管及氣囊來進行病原菌分離,惟分離率較由眼下竇分離者低。H. paragallinarum 之抵抗力甚弱,在雞體外無法存活超過 5 小時。因此如無法在此時間內進行病菌分離,需先將滲出物或感染組織先凍結以待稍後對雞人工感染再分離細菌。
   
(五) 綜合診斷:
    本病病性激烈,傳播甚速,且有眼窩下竇及顏面腫脹等之特殊症狀,而容易診斷,但最後仍須要病原菌分離予以確認。
1.病原分離及同定
    一般係以血液瓊脂來分離本病原菌。培養基可以如 Bacto-tryptose-blood-agar base (Difco 產品)等之瓊脂加上 10% 脫纖血而製備。任何動物之脫纖血皆可使用。病材拭子在培養基上劃線培養後,再交叉劃一直線培養 Staphy-lococcus hyicus 等菌株以供應 H. paragallinarum 所需之 v 因子。本菌需在 5%CO2 下 37℃ 培養。另外亦可準備一些可直接用來分離 H. paragallinarum 的培養基,而不需另外劃線培養 S. hyicus 等菌株。這些已含有 v 因子的培養基有 Haemophilus maintenance medium(HMM) 及 Supplementic test medium agar(TM/SN)。但這些培養基的缺點是雜菌會大量生長,另外亦無法觀察到嗜血桿菌特徵的衛星生長現象 (Satellitic growth)。以 Tryptic agar base(Difco) 或 Brain heart infusion agar (Difco),加 1%β-Nicotinamide dinucleotide 還原型 (Sigma Gr.ade Ⅱ)1% 及雞血清 3-5% 可供為本菌分離及繼代用。
  本菌為革蘭氏陰性桿菌,在血液瓊脂培養基上培養 24-48 小時後 ( 置含 5%CO2 恆溫箱中 ),會形成直徑 0.3mm 以下的小露珠狀菌落,此種菌落發育係沿著交叉劃線的 S. hyicus 等菌株稱為衛星狀發育。另外本菌亦具氧化脢活力,具有鹼性磷酸脢,不會製造,不會利用尿素或凝膠。本菌與其他類似菌株之鑑定如表一所示:
 
表一、雞副嗜血桿菌與其他類似細菌之鑑定
生化反應
H. paragallinarum H. avium P. avium P. volantim Pasreurella spceies A

Catalase
Growth in air
ODC3
β-galactosidase
Acid form
Arabinose
Galactose
Maltose
Mannitol
Sorbltol
Sucorose
Trehalose

-2
-
-
+

-
-
+
+
v
v
-

+
+
v
v

v
+
v
v
v
+
+
+
+
-
-

-
+
-
-
-
+
+
+
+
v
+

-
+
+
+
v
+
+
+
+
-
v

+
+
v
v
-
+
+
1.所有菌株皆為革蘭氏陰性桿菌,v 因子,但不需 x 因子。
2."+"= 陽性 (>90%); "-"= 陰性 (>90%); "v"= 反應不定。
3.ODC=Ornithine decarboxylase。
2. 血清學診斷
  常用來檢查雞傳染性可利查抗體的血清學方法有平板凝集試驗 (SPA),瓊脂擴散法 (AGP),及血球凝集抑制 (HI) 試驗。( 見附錄 2,3,4)
   血球凝集抑制試驗為血清型特異性,因此在田間應用並不實際。由於血清型 A 菌株可凝集雞紅血球,因此用於檢查血清型 A 抗體的 HI 試驗較簡單,而血清型 C 則需以 Hyaluronidase 處理,雞紅血球亦需以 glutaraldehyde 固定後才能實施。目前已有成品化診斷試劑可供檢查。
   
(六) 確診依據:
    依其顏面腫脹、眼下竇腫脹等及本病依其呼吸症狀如流鼻汁及產蛋低下,以初步診斷後,再作病原學診斷分離細菌,並須以血清型分類予以確診。
   
(七) 參考文獻:
 
1. Blackall, P. J. An evaluation of methods for the detection of carbohydrate fermentation in avian Haemophilus specise. J. Microbiol. Methods 1:275-281.1983.
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6. Eaves, L. E., D. G. Rogers, and P. J. Blackall. Comparison of hemagglutinin and agglutinin schemes for the serological classification of Haemophilus paragallinarum and with the proposal of a new hemagglutinin serovar. J. Clin. Microbiol.27:1510-1513.1989.
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9. Iritani, Y., K. Katagiri, and K. Tsuji. Slide agglutination test of Haemophilus gallinarum antigen treated by trypsin to inhibit spontaneous agglutination. Avian Dis.22:793-797.1978.
10. Kilian, M. A rapid method for the differentiation of Haemophilus strains. The porphyrin test. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B Microbiol. Immunol.82:835-842.1974.
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21. Yamamoto, R., and D. T. Somersett. Antibody response in chickens to infection with Haemophilus gallinarum. Avian Dis.8:441-453.1964.
   
(八) 附錄:
  附錄 1.:傳染性可利查培養基
培養基
材料
製造法
1.雞肉汁 雞肉
蒸餾水

a.雞肉 500g+ 蒸餾水 1000ml
b.4℃ 一晚靜置
c.室溫放置後、煮開
d.沸騰後再煮 30 分
e.冷卻後以濾紙濾過
f.-20℃ 凍結保存

2.新鮮酵母抽出液 乾燥酵母
KH PO (0.2M)
NaOH
a.乾燥酵母 25g+0.2M KH PO
b.80-85℃、20分 加溫抽出
c.抽出後、遠心分離 (3000-5000rpm、20 分 )
d.上清液 pH 修正為 pH7.0
e.濾過滅菌 (0.45μm)
f.小分裝、-20℃ 保存
3.CMI broth 雞肉汁
poly pepton-S
poly pepton
氯化鈉
NaOH
雞血清
新鮮酵母抽出液
100%CMI( 種菌、攻擊用菌培養用 )
a.雞肉汁
 poly pepton-S
 poly pepton
 NaCl
100% 加溫溶解
1%
0.1%
0.5%
b.調整至 pH7.2(7.0~7.2)
c.121℃、10 分鐘滅菌
d.使用時添加 3% 雞血清

a.雞肉汁
 poly pepton-S
 poly pepton
 NaCl
20% 加蒸餾水成為 100%
1%
0.1%
0.5%
b.調整至 pH7.2(7.0~7.2)
c.121℃、10 分鐘滅菌
d.冷卻後加雞血清及新鮮酵母抽出液各 1%
4.CMI 瓊脂培地 Noble Agar (Difco) CMI 瓊脂培地 ( 以 100ml 為單位 )
a.100%CMI broth(pH7.2)
b.加瓊脂 1.5%
c.121℃、10 分鐘滅菌
d.冷卻至 37℃ 前後時加雞血清 5%
5.雞血清   濾過滅菌後、非化、-20℃ 凍結保存
   
  附錄 2.:雞傳染性可利查的紅血球凝集抑制反應
  A 型菌 HI 反應
   I.A 型菌 HA 抗原的製造法 ( 無處理抗原 )
  1.材料: Hpg 221 株  
  100% CMI broth
  20% CMI broth
    PBS  
  1% NaN  
  TGC 培養基  
  CMI 瓊脂平板  
  2.方法:      
  凍結乾燥或凍結保存的 Hpg 221 株塗抹於 CMI 瓊脂平板
   CO 恒溫器,37℃,18-24 小時培養
     ∣
  確認有螢光菌落接種於 100% CMI broth,在 37℃,18-24 小時培養
     ∣
  20% CMI broth 培養 (1ml/100ml 接種 ),37℃,18-24 小時培養
     ∣
  無菌試驗 (TGC 培養基、CMI 瓊脂平板 ),集菌,用 PBS 遠心分離洗淨 (1000g,30min)
     ∣
  懸浮於培養量之 1/20 量的 PBS,加 NaN 使最終濃度成 0.01%。
     ∣
  4℃ 放置 2-3 日使不活化。
     ∣
  濃度調整-菌懸浮液的濃度調整為 McFarand 標準液列 No.2 的 10 倍濃度
     ∣
  4℃ 保存 1-3 週
    註 1:菌量通常以 108 個 ml 之菌量再 1/20 濃縮。
    註 2:抗原價以 80-160 倍為最佳。
   Ⅱ. HI 反應
HA 抗原:
A 型菌 221 株 HA 抗原
血   球:
新鮮雞紅血球液 (0.5%)
稀 釋 液:
PBS( 生理食鹽水亦可 )
反 應 盤:
塑膠微量盤
  血球凝集反應 (HA test)
  紅血球凝集抑制反應 (HI test)
  C型菌HI反應
   I. C 型菌處理 HA 抗原的製法
    A. Hyaluronidase 處理 HA 抗原的製作
1.材料: Hpg C 型菌株  
  100% CMI broth 10ml
  20% CMI broth 1500ml×5-7 支
    PBS  
  1% NaN  
    Hyaluronidase(SIGMA 公司、type I-S)
2.方法:    
  凍結乾燥或凍結保存的 Hpg 株塗抹於 CMI 瓊脂平板
   CO2 恒溫器,37℃,18-24 小時培養
     ∣
  確認有螢光菌落,取 1 菌落接種於 100% CMI broth,在 37℃,18-24 小時培養
     ∣
  20% CMI broth 培養 ( 接種 1ml/1000ml 培養基 ),在 37℃,18-24 小時培養
     ∣
  無菌試驗 (TGC 培地、CMI 瓊脂平板 ),集菌,以 PBS 遠心分離洗淨 (1000g,30min)
     ∣
  懸浮於培養量的 1/100 量的 PBS
     ∣
  與 200 單位 /ml 的 Hyaluronidase 等量混合,在 37℃ 水浴槽 2 小時感作
     ∣
  遠心分離、集菌、洗淨
     ∣
  懸浮於 PBS,並調整濃度 ( 菌濃度調為 McFarand 標準液列 No.1 的 20 倍濃度 )
     ∣
  加 NaN 使其最終濃度成為 0.01%
     ∣
    4℃ 保存
  Ⅱ.固定雞紅血球的調製法
   1.Formalin 固定紅血球液 (HU-HA 抗原用 );Weinbach 的變法
 
以 Alsever 液採取的雞紅血球 (5℃,一晚保存 )
     ∣
以 120-150 網目金屬網過濾
     ∣
以 PBS 3 次遠心洗淨
     ∣
以 PBS 製成 10% 血球懸浮液
     ∣
加等量 0.3%Formalin 液慢慢攪拌加入-用試藥特級 Formalin
     ∣
在 37℃,3 小時攪拌感作
     ∣
加 1/5 量的 Formalin 原液,在 37℃,20 小時攪拌感作
     ∣
遠心洗淨 ---最小以血球量 10 倍量的 PBS 洗淨
     ∣
以 PBS 製成 10% 血球懸浮液
     ∣
     ∣- 10% 雞固定紅血球液 ( 除去雞血清中正常凝集素用 )
     ∣  添加 NaN    0.1%
     ∣  牛血清白蛋白   0.05%
     ∣
     ∣- 1% 雞固定紅血球液 ( 供 HA 反應及 HI 反應用 )
     ∣  添加 NaN    0.1%
        牛血清白蛋白   0.05%
   2. Glutaraldehyde 固定雞紅血球液 (KSCN- 超音波處理 HA 抗原用 )
 
10% 血球懸浮液的製法如上述
     ∣
以含 2%Glutaraldehyde 的 PBS 液等量混合
     ∣
4℃,3 小時攪拌感作
     ∣
遠心洗淨 3 次以上
     ∣
10% 血球懸浮液 ( 加 NaN3 使最後濃度成為 0.1%)
  Ⅲ.HI 反應
 

  C 型菌的 HA 反應依所使用的抗原種類而其方法不同。

HU 處理抗原法
抗 原:
Hyaluronidase 處理 HA 抗原
血 球:
Formalin 固定雞紅血球液 (1%)
稀 釋 液:
含 0.01% 牛血清白蛋白的 PBS( 生理鹽水亦可 )
反 應 盤:
V 字型塑膠凝集盤
血清處理:
10%Formalin 固定雞紅血球被檢血清以 10%Formalin 固定雞紅血球液稀釋 5 倍於 37℃ 水浴槽攪拌 30 分鐘。
遠心分離後之遠心上清液即為 5 倍稀釋血清,供為抗體價之測定用。

KSCN- 超音波處理抗原法
抗   原:
HSCN- 超音波處理抗原
血   球:
固定雞紅血液 (1%)
稀 釋 液:
含 0.01% 牛血清白蛋白的 PBS
反 應 盤:
微量塑膠盤
血清前處理:
被檢血清以 10%Glutaraldehyde 固定雞紅血球液 5 倍稀釋, 在室溫感作 2 小時,再於 4℃ 攪拌 24 小時後,在室溫感作 1 小時。遠心分離後之遠心上清液即為 5 倍稀釋血清,供為抗體價之測定用。如有吸收不完全的情形,再用等量 10% 固定雞紅血球液遠心除去上清液,以此血球沉渣再吸收血清一次就可。
 
HA 反應


HI 反應
 
HI 反應術式
HU 處理抗原法

1. HA 反應
 V 型塑膠凝集盤

2. HI 反應

(1)
血清處理 ( 吸收正常凝集素 )
被檢血清 0.1ml( 或 0.05ml) 加10%Formalin 固定雞紅血球懸浮液 0.4ml( 或0.2ml),37℃30-60 分感作( 此時紅血球不得沉澱,須要振盪 ) 後,經 2000rpm10 分鐘遠心其上清液即為 5 倍稀釋供為 HI 抗體測定。
(2)
HI 反應 *
用 V 型塑膠凝集盤
 

3. 使用抗原檢定

   
  附錄 3.:平板凝集試驗
  其施行方法如下:
  細菌抗原先以磷酸鹽緩衝液 (PBS,pH7.0) 調整濃度至 10 號 MacFarland nephelometer 管的兩倍。然後將 0.01ml 血清與 0.05ml 抗原在一玻片上混合,玻片迴轉 3 分鐘後,在一暗色背景及螢光燈上判讀。如果抗原在 3-5 分鐘內呈現凝集則判定為陽性。雞在感染或免疫後 10-14 天即可以平板凝集試驗測得抗體。在自然感染雞至少持續 1 年。在免疫雞至少可持續 11 週。
   
  附錄 4.:瓊脂擴散法
  實施方法如下:
  約 50 倍個平板凝集試驗的抗原量經超音波或反覆凍結融解打破菌體後用為抗原。在一玻片上反覆上一層 8%NaCl 及 0.01%merthiolate 以 PBS(pH7.4) 泡製之 1%Bacto-agar。瓊脂以打洞器打出中間一孔,周圍 6 孔環狀排列,每個孔直徑 4mm,孔距為 4mm。中間一孔加入 0.03ml 抗原,周圍 6 孔則加入 0.03ml 血清。此玻片塞入溼匣中於 37℃ 或室溫置放,於 24-72 小時後檢查沈降線。陽性反應可見 1-3 條沈降線。雞在感染後或免疫後 2 週即可以瓊脂擴散法測得抗體,並至少持續 11 週。
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