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新城病
(Newcastle disease virus;NDV)
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作者: 林 德 田
詳細內容:
目的
新城病病毒分離及鑑定標準操作程序(以下簡稱本標準)所制定之內容係提供實驗室處理相關病材、操作病毒之各種生物活性及診斷鑑定時所必須之程序,以確保實驗室操作人員之安全性,及維持對本病診斷鑑定之精確性與快速性。
 
名詞定義
1. 新城病病毒:
  新城病病毒(Newcastle disease virus;NDV是副粘液病毒科(Paramyxoviridae) Rubulavirus 屬新城病病毒所引起。禽類副粘液病毒(paramyxovirus ; PMV)在血清學的分類上可分為 PMV-1 (paramyxovirus type 1) PMV-9 (paramyxovirus type 9)9個血清型;ND 病毒屬於 PMV-1 型。
   
2. 新城病:
  本病自 1926 年首次發現以來,已廣佈於全球大部份國家,因此世界各地區雞隻大都以疫苗來進行防疫本病。ND病毒依其對雞感染的病原性高低和臨床症狀可分為5個病原型包括:(1)強毒內臟型:具有高病原性,常見胃腸出血病變,(2)強毒神經型:呈現高度死亡率,通常有呼吸及神經症狀,(3)中間毒型:呈現呼吸症狀,偶有神經症狀,但具低死亡率,(4)弱毒型或呼吸道型:呈現輕微或無臨床症狀的呼吸道感染及(5)無症狀腸道型:沒有臨床症狀的腸道感染型。本病不易區別其病原型,即使病毒感染無特定病原(SPF)雞也會出現前述重疊的病狀,其中弱毒株感染時會因其他病原重複感染或環境情況不良而加劇本病臨床症狀,且病毒感染不同宿主也有不同的反應,使得 ND在臨床診斷上頗為困難,因此若單靠臨床症狀來診斷本病常無法得到正確的診斷結果。我國對新城病的定義是大腦內接種致病性指數(intracerebral pathogenicity index;ICPI)在1.5以上或融合蛋白(F protein)氨基酸序列第113116 個位置具有3個以上鹼性氨基酸且第117個位置為苯丙氨酸 (phenylalanine)
 
材料與設備
1. 實驗室:符合國家安全標準2級及3 級實驗室
2. 離心機:KOKUSAN, H-103N
3. 桌上型離心機:KM-15200, KUBOTA
4. 鐵胃:STOMACHE80
5. 離心管:50 mL15 mL容量底部V字型,微量離心管
6. 紗布塊及細紗網
7. 血球震盪器
8. 微量天平及倒立螢光顯微鏡(Nikon)
9. 96孔微量測定盤(V字型)
10. 1日齡與6週齡SPF(specific pathogen free)
11. 注射針(0.5 mL1 mL5 mL、及10 mL容量,含針)
12. 9-11日齡SPF雞胚胎蛋
13. 8爪及12爪微量分注器及單爪微量吸管(100 μL)
14. 外科剪刀及鑷子
15. 檢蛋器與孵卵器
16. 強碘酊:7 g 游離碘、5 g 碘化鉀及100 mL 85%乙醇配製而成
17. 70%酒精與酒精棉
18. 生理鹽水(0.85%)
19. 磷酸緩衝溶液(PBS)(pH 7.0~7.4):0.5 M NaCl、0.5 M Na2HPO4、1.0 M NaH2PO4 加蒸餾水至總容量1000 mL
20. 1% 雞紅血球懸浮液
21. Alsver's solution
22. 核酸萃取相關試劑:Trizol solution、chloroform(Sigma)、isopropanol(Sigama)、 75% 乙醇及DEPC(Merck) PCR反應試劑:dNTP、Prozyme buffer、Rnasin、AMV Transcriptase、primer、Promezyme(DNA polymerase)Template RNA酵素結合免疫吸附試驗相關試劑:Ortho-phenylenediamine(OPD)Sigma 3,3'5,5'-Tetramethyl Benzidine (TMB)PIERCE 雙氧水(Merck)、硫酸液(Merck)、脫脂奶粉(Marvel)
23. TEN緩衝溶液:0.01 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1.00 M EDTA,調pH值為7.6
24. ELISA相關試劑:
  已被覆NDV抗原測定盤
10 mL NDV陽性對照血清
10 mL正常雞對照血清
10 mL山羊抗雞之免疫球蛋白(IgG,HtL)過氧化氫脢結合物溶液
40 mL稀釋緩衝溶液(Dilution buffer)
10 mL ABTS過氧化氫基質溶液
2.5 mL 5×
停止液(1:5方式稀釋為操作液)
20 mL 20×
洗滌液(1:20方式稀釋為操作液)
25. ELISA相關設備:
  1-20 mL微量分注器
0.2 mL、1.0 mL
5.0 mL容量吸管
8
爪或12爪的微量分注器
未被蓋抗原抗體之96孔微量測定盤
去離子蒸餾水
96孔盤分光判讀器
96孔盤洗滌盤
 
臨床診斷
1. 臨床症狀
(1) 一般症狀
臨床症狀的嚴重程度因病毒株及感染鳥類的年齡、免疫狀況、種別等因素而異,由幾乎無明顯的呼吸症狀到非常嚴重的沈鬱、產蛋量下降、呼吸頻率增加、大量下痢後死亡或存活者出現神經症狀。嚴重病例之死亡率可達100%。潛伏期通常為56天,亦可能為215天。
   
(2) 強毒內臟型
病程甚短,臨床上一發病就開始死亡,病雞出現食慾廢絕,體溫上升至4243 ℃。病雞會出現精神沉鬱、嗜眠、逆毛及排出帶有白色的濃綠色下痢便,聚集在角落不動。眼、喉及臉部常見水腫,並由喉頭發出囉音及奇音或開口呼吸,無法起立及抽搐,一般經13日病程後就死亡。病程較長者開始出現斜頸、歪頭及腳麻痺。急性型之死亡率在90% 100%
   
(3) 強毒神經型
主要症狀為沉鬱、呼吸症狀、下綠色便及神經症狀等。產蛋降低或停止,肉垂及肉冠呈暗紫色,中雞以下的症狀較嚴重。病程經過較為慢性,成雞死亡率約5%,小雞死亡率為5080%
   
(4) 中間毒型
輕微的呼吸症狀及下痢,產蛋下降或停止。其死亡率低。
   
(5) 弱毒型
主要造成中等程度或不顯性的呼吸道感染,其死亡率極低。
   
(6) 無症狀腸道型
無臨床症狀或無病理學上變化。
   
2. 病理變化
(1) 肉眼病理變化
A、 強毒內臟型病變
主要的病變在消化道(腺胃及腸管)的出血、潰瘍及壞死等病變。腺胃出血病變易出現於食道或腺胃移行部,有時全面性出血;腸管淋巴組織易出現出血、潰瘍及壞死等病灶;脾臟有時會出現白色壞死點;出現呼吸症狀之病例可見氣管粘膜增厚、充出血及滲出液增加。結膜充出血及眼瞼與顏面腫賬;卵巢異常;共泄腔充出血;華氏囊肥厚、水腫及充出血。心冠狀溝點狀出血。
   
B、 強毒神經型病變
主要的病變在呼吸道,包括氣管粘液增加、粘膜增厚、氣囊輕度混濁、增生增厚及肺炎之病變。
   
3. 組織病理變化
(1) 全身各淋巴組織如脾、胸腺、華氏囊、盲腸扁桃、消化道及呼吸道之粘膜固有層、腦之血管周圍的淋巴球會崩壞及消失,並有巨噬細胞之增生。脾、胸腺及消化道的病灶伴有纖維素滲出。氣管上皮細胞增生。
(2) 急性病例的中樞神經系統可見血管周圍性淋巴細胞的增殖、神經細胞的壞死及小神經膠質細胞反應。
(3) 病程較長者血管周圍的浸潤細胞由漿細胞轉為淋巴球,大腦、中腦、視葉、延腦及小腦出現壞死灶。
 
初代分離培養病材採集與處理
1. 病材採集:
(1) 由病死雞中採取口、鼻拭子及肺、腎、腸(包括腸內容物)、脾、腦、肝及心臟等組織臟器。所採取之組織臟器可以分開或混合,但腸管則通常分開放置。
(2) 活雞採樣包括氣管及共泄腔拭子,共泄腔拭子一定要包含有糞便。小型脆弱的禽類可能受限於拭子太大而不容易採取,則以收集排出之新鮮糞便代之。
(3) 採取的試材應放置在磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline;PBS)內,pH 7.0 7.4,含抗生素。所加抗生素之濃度可依試材種類,如組織及氣管拭子添加penicillin(2,000 U/mL)streptomycin(2 mg/mL)gentamicin(50 μg/mL),但糞便及共泄腔拭子則須使用5倍濃度以上抗生素。添加抗生素後必須調整pH值為7.0 7.4
(4) 糞便及組織研製成1020﹪(w/v)乳劑,並裝入無菌袋及經鐵胃擊碎組織臟器試材。
(5) 組織臟器試材懸浮液經 3000 g 離心10分鐘取其上清液,此上清液放置在室溫12小時後應馬上進行雞胚胎接種試驗,如存放在4 ℃不可超過4天。
   
2. 病毒分離與增殖:
(1) 9-11日齡SPF雞胚胎蛋,在燈光透視下選擇近氣室邊緣,以強碘酊擦拭打洞,再以70%酒精棉擦拭蛋孔,以備接種試材乳劑。
(2) 糞便或組織等試材乳劑上清液,此上清液經0.45 μm過濾膜濾過後之濾液接種於9 11日齡SPF雞胚尿囊腔內,每個雞胚各接種0.2 mL,同一試材至少接種2個蛋。接種後在35 37 ℃恆溫箱中靜置觀察4 7天。24小時內死亡之雞胚胎丟棄。
(3) 將死胚蛋與未死亡胚蛋放置在4℃,待10小時以上降溫後抽取尿囊液,同時取少量尿囊液與1%雞紅血球液混合並進行血球凝集試驗,以檢測血球凝集素活性之有無,若呈陰性反應則應再盲目繼代增殖2次。
 
病毒鑑定
1. 血球凝集試驗(參閱附件一)
(1) 0.85% NaCl 溶液分裝至96孔微量測定盤中每一孔,每孔加入0.025 mL
(2) 每行第一孔放置0.025 mL病毒懸浮液(如含病毒的尿囊液)。
(3) 0.025 mL病毒液進行2倍連續稀釋。
(4) 每孔加0.025 mL NaCl溶液。
(5) 最後每孔再加入0.025 mL1﹪RBC(red blood cell)溶液(v/v)
(6) 放置於血球震盪器中輕輕振盪混合,室溫(25℃)中靜置40分鐘,或4 ℃60分鐘,直到RBC沉降至底部。
(7) 將盤子傾斜觀察RBC淚滴狀流下之有無,以決定血球凝集現象。病毒力價之計算係以判讀血球完全凝集孔中(不產生淚滴狀流下現象)最高稀釋倍數即成為1單位血球凝集力價(hemagglutination unit, HAU),所以該稀釋力價倍數的倒數為受檢測病毒的血球凝集力價。
   
2. 間接螢光抗體法
(1) 10 m.o.i NDV病毒感染力價感染96孔細胞培養皿內未長滿的BHK細胞。
(2) 感染後24小時左右細胞開始出現細胞病變,倒掉病毒液並直接加入冰冷的固定液(丙酮:甲醇:水=4:4:2)在4℃下固定10分鐘後倒掉固定液,室溫下任其風乾封入塑膠袋中並保存在零下70℃備用。
(3) 無感染NDVBHK細胞,處理同上步驟。
(4) 檢測NDV抗體時,每孔加入100uL檢測血清?span class="font-12e">A37℃下感作90分鐘,以PBS-Tween溶液清洗三次,在加入以1﹪BSA溶液稀釋之FITC標示的二次抗體?span class="font-12e">A37℃下感作90分鐘後,再以PBS-Tween溶液清洗四次,每次震盪5分鐘,倒乾清洗液後即可在螢光顯微鏡下觀察。
   
3. 病毒斑點測定法
(1) 將BHK-21細胞培養於24孔培養皿中,待細胞形成單層後倒掉培養液,每孔加入0.1Ml病毒稀釋液(連續10倍稀釋)。
(2) 移置含CO2之37℃細胞培養箱中培養隔夜,並加入一滴0.1﹪中性紅溶液,再移置細胞培養箱中隔夜觀察。
(3) 判讀:活細胞會吸收中性紅染料而成紅色,死細胞則呈透明斑點。
(4) 判讀後之細胞培養皿抽去上層液,加入10﹪福馬林固定細胞3分鐘,再以PBS溶液洗淨自然乾燥。
   
4. 血球凝集試驗(參閱附件一)
(1) 將0.85﹪NaCl溶液分裝至96孔微量測定盤中每一孔每孔加入0.025 mL。
(2) 每行第一孔放置0.025 mL病毒懸浮液(如含病毒的尿囊液)。
(3) 取0.025 mL病毒液進行2倍連續稀釋。
(4) 每孔加0.025 mL NaCl溶液。
(5) 最後每孔再加入0.025 mL的1﹪雞RBC(red blood cell)溶液(v/v)。
(6) 放置於血球震盪器中輕輕振盪混合,室溫(25℃)中靜置40分鐘,或4℃、60分鐘,直到RBC沉降至底部。
(7) 將盤子傾斜觀察RBC淚滴狀流下之有無,以決定血球凝集現象。病毒力價之計算係以判讀血球完全凝集孔中(不產生淚滴狀流下現象)最高稀釋倍數即成為1單位血球凝集力價(hemagglutination unit, HAU),所以該稀釋力價倍數的倒數為受檢測病毒的血球凝集力價。
   
5. 血球凝集抑制試驗(參閱附錄二)
(1) 取0.85﹪NaCl分裝至96孔微量測定盤中,每一孔0.025 mL。
(2) 加入0.025 mL血清至測定盤中每行的第一孔。
(3) 自第一孔起,取0.025 mL量進行2倍連續稀釋。
(4) 每孔加4 HAU的病毒抗原0.025 mL並輕輕混合後,靜置於室溫中30分鐘或4℃中60分鐘。
(5) 加0.025 mL 1﹪雞RBC懸浮液至每一孔,放置在血球震盪器上混合均勻,靜置在20℃ 30分鐘或4℃中60分鐘,對照之雞血球懸浮液完全沉降至底部。
(6) HI力價判定:形成4 HAU抗原完全抑制之最高血清稀釋倍數即為HI力價。陰性對照血清的力價不應大於1/4,陽性對照血清力價應和已知力價相同,否則應重做或修正之。
 
病原性指數試驗
1. 雞胚之平均死亡時間(mean death time in eggs, MDT)
(1) 抽取新鮮ND病毒液以滅菌生理鹽水連續10倍稀釋成10-6至10-9,每一稀釋倍數濃度分別接種0.1mL至5個9至10日齡SPF雞胚尿囊腔,然後放置在37℃孵卵器中。
(2) 每一稀釋倍數接種後剩餘的病毒存放在4℃,8小時後再各接5個雞胚蛋,同樣置37℃中。每曰次照蛋檢查,連續7日,記錄雞胚死亡時間。
(3) 造成接種雞胚全部死亡的最高稀釋倍數為最小致死劑量(minimum lethal dose,MLD),MDT即為最小致死劑量殺死胚胎的平均時間。MDT小於60小時為強毒株,60至90小時為中間毒株,大於90小時為弱毒株。
   
2. 大腦內接種致病性指數(intracerebral pathogenicity index,ICPI)
(1) 無菌ND病毒液(HA力價須高於16倍者)以滅菌生理鹽水稀釋10倍,取該稀釋液0.05Ml分別大腦內接種於10隻1日齡SPF(specific pathogenic free)小雞,接種後每24小時觀察一次,連續觀察8日並記錄之。
(2) 正常雞之記錄值為0,病雞為1,死亡雞為2,ICPI即為全部8日內每日每隻雞的平均數值,所以ICPI值1.5以上則為強毒型新城病,而弱毒株的值則接近0.0(表1)。
   
3. 靜脈內接種致病性指數(intravenous pathogenicity index,IVPI)
(1) ND病毒液(HA力價須高於16倍以上者)以生理鹽水10倍稀釋,取該稀釋液0.1Ml分別靜脈內接種於10隻6週齡SPF雞,接種後10日內每日觀察雞死亡(記錄值為3.0),重症(記錄值為2.0)和發病(記錄值為1.0)正常雞(記錄值為0)情形,並計算其平均數值,弱毒株和一些中間毒株之IVPI值近似0,而強毒株的IVPI約為2.0以上(表2)。
 
病毒核酸序列分析
1. 病毒RNA萃取
(1) 病材之臟器組織作成10倍孔劑。取100 uL病材孔劑加入1mL Trizol萃取液充份混合30秒並靜置室溫5分鐘。
(2) 加入200 uL氯仿(chloroform)以手上下倒置混合15秒後靜置室溫3分鐘,置於4℃下12,000 rpm離心15分鐘。
(3) 取上清液與等量isopropanol充分混合靜置室溫10分鐘再置於4℃下12,000 rpm離心15分鐘。
(4) 倒棄上清液加入1 mL 75﹪乙醇後於4℃下14,000 g 離心5分鐘後去上清液。
(5) 置56℃烘箱或真空乾燥去除水份後加入60至80 uL DEPC(diethypyrocarbonate)處理水溶解,迅即進行RT-PCR過程。
   
2. 病毒核酸之增幅
(1) 引子( primer)設定:參閱GeneBank設定F gene特異性引子。
   
(2) 反轉錄聚合鏈反應(RT-PCR)操作過程:
(a) 首先配製PCR反應液包括dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCPT mixtures 1.25 mM)16uL、10倍Dynazyme buffer 10 uL,RNasin(40 U/ uL)0.4 uL、AMV transcriptase(8 U/ uL)0.3 uL、primer 1 uL(0.5ug/ uL)、DNA polymerase 1 uL 及 template RNA(即樣品RNA)13 uL, 加無菌蒸餾水至100 uL為最終反應體積。
(b) 以溫度循環控制器中進行PCR,其反應條件為42℃ 40分鐘單一循環。94℃ 40秒,45℃ 1 分鐘,72℃ 1分鐘進行35循環。72℃延長7分鐘。
   
3. 核酸序列分析
(1) 將八-2.步驟合成之PCR產物進行自動核酸序列分析、分析融合蛋白氨基酸序列,第113-116個位置若具有3個以上鹼性氨基酸且第117個位置為phenylalanine之氨基酸即判定為新城病。
(2) RT-PCR產物電泳分析:取RT-PCR產物2ul之loading dye混合後,灌入2﹪洋菜膠中進行電泳分析。在迷你電泳槽(Mupid-II,Cosmo)中加庄TAE buffer(40 mM Tris-acetate, 1mM EDTA),?span class="font-12e">H100伏特電壓進行電?span class="font-12e">A25分鐘,並置於UV燈下觀察,以Polaroid type 667相紙顯影記錄結果。
 
酵素連接免疫吸附法
1. 取出96孔檢測盤(已被覆NDV抗原)
2. 取稀釋緩衝溶液分注到每一孔,每一孔加入50 uLA1A3,及H11孔之測定盤分別置入50 uL檢測血清及陰性血清感作,置放於室溫感作30分鐘。
3. 檢測盤之洗滌,倒棄 (2) 之感作液,每孔加300 uL洗滌液(Washing solution)
4. Soak 3分鐘,並倒置檢測盤,以完全去除殘留之洗滌液。
5. 重覆 (4) 之步驟2次以上,以去除檢測盤非特異性的物質。
6. 檢測盤每孔加入100 uL已稀釋之抗雞IgG過氧化氫酵素結合物,並在室溫中感作30分鐘。
7. 倒棄洗滌液,並加入洗滌液300 uL
8. Soak 3分鐘,並重複洗滌過程2. (6) (7)
9. 倒棄洗滌液,並加入100 uL基質溶液(substrate solution),並在室溫中感作15分鐘。
10. 每孔加入100 uL停止液(stop solution),以終止反應以備進行判讀。
11. 判讀以405-410 nm波長之ELISA判讀器進行分析,紀錄A1A3H11之陽性對照血液之平均吸光值。紀錄A2H10H12之陰性對照血清之平均吸光值。
12. 計算檢測血清陽性之吸光值
SP(Sample to positive)=(檢測血清吸光值-平均正常陰性血清對照組吸光值)/(平均陽性血清對照組吸光值-平均陰性血清對照組)
 
附錄

附錄一、血球凝集試驗
 



附錄二、血球凝集抑制(HI)試驗

表1腦內病原指數試驗計分例。

 

 

表2靜脈內病原指數試驗計分例。

 

  1﹪雞紅血球懸浮液之製備流程:
  3週齡以下之SPF雞採下之全血與2:1體積之比例與Alsver's solution混合,以阻止血液凝固,輕輕充份混合。
  經細紗網過濾,以去除血液中大的凝塊,再加適量的滅菌生理鹽水,充份混合。
1000 rpm離心10分鐘,倒掉上清液,再加入適量滅菌生理鹽水,輕輕懸浮紅血球。
  重複前述步驟,1000 rpm離心10分鐘,倒掉上清液,再加入適量滅菌生理鹽水,輕輕懸浮紅血球。
  1500 rpm離心15分鐘,倒掉上清液,將血球調成1﹪雞紅血球懸浮液。
  將製備好之1﹪雞紅血球懸浮液放置於4℃冰箱中。
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