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九﹑電子顯微鏡技術
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作者: 黎南榮
詳細內容:
一) 病材輸送條件
  1. 一般負染色之病材必須新鮮經冷凍保存再經乾冰或冰寶保存並快速送至實驗室。

  2. 細胞超薄切片之病材亦必須新鮮且輸送前必須先經glutaraldehyde固定後再輸送至實驗室。

    glutaraldehyde 固定液配製: 2.5% glutaraldehyde solution

    0.1 M sodium cacodylate buffer

(二) 電子顯微鏡技術原理與方法

  1. 一般光學顯微鏡雖然理論上利用可見光的純放大倍率可以無限,但因解析力之因素,光學顯微鏡之放大倍率會因波長的影響而受到限制,其關係如下:α=0.61λ/NA,α為解析力,NA為折光係數,以油鏡所得NA最大可能為1.4,λ為波長,可視光之波長為3000~8000A°,由此公式可推出光學顯微鏡之解析力極限為α=0.61(4000)/1.4λ=1700A°(以波長為4000A°單色光之α為0.17μ),一般白色光解析力約為0.25μ;因此實際上以一般光學顯微鏡無法區分小於0.2μ之結構。電子顯微鏡之波長與電壓有密切之關係,其公式為λ=12.2/√V,λ為波長單位為A°,V為加速電壓,當加速電壓為 50000 V時之解析力約為 2.5A°,過去幾拾年穿透式電子顯微鏡已成為病毒學研究的一種重要工具。負染色法因操作簡單,解析力強,可省去許多繁雜費時的標本純化及製備過程。現在任何一種体液皆可利用負染色法鏡檢,直接依型態學檢出病原体而省去以往標本純化等繁雜的定性手續。

  2. 負染色電子顯微鏡法除了簡單快速外,且當負染色診斷陽性時,即為確診。例如當水泡液送診時,很快即可因其病毒大小,形狀,而能確診為口蹄疫 (picorna virus) 或丘疹性口炎 (pox virus),如屬同一類之病毒,例如 picorna virus 之口蹄疫,豬水泡病及水泡病時,可藉免疫負染色法而快速確診。

  3. 引起下痢之冠狀病毒,輪狀病毒,腺病毒及星狀病毒也可藉負染色法而快速診斷,其他引起腸炎的腸道小病毒尤其是介於 20~30 nm者,可利用免疫電子顯微鏡法確診,如鴨肝炎病毒,小病毒 (parvo virus),貓白血病病毒,皆可利用這種方法加以確診。

  4. 利用薄切片技術可觀察病毒於組織細胞內增生的情形,但因其操作繁雜,費時,很難應用於常規性的鑑定。因負染色時病毒顆粒之結構較為清楚明顯,且操作簡單快速,故一般病性鑑定皆以負染色法進行。

  5. 負染色操作方法:

    先以自閉式抗毛細現象之夾子夾住一片鍍有炭膜及膠膜之銅網片,將一滴標本滴於銅網片上,等候一分鐘後再將一滴磷鎢酸染色液滴於銅網片上然後以濾紙吸去過多之液体,等候15至30分鐘使其乾燥後即可利用電子顯微鏡觀察。

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