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口蹄疫
Foot and mouth disease
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口蹄疫 (Foot and mouth disease,FMD)

一、緒言

是一種極急性、高度傳染性疾病,感染對象為偶蹄類動物,以口、鼻、舌、趾、蹄冠、乳房及乳頭部皮膚產生水疱然後糜爛為其特徵。感染動物之產肉能力、產乳能力大幅下降,並會造成年幼動物之大量死亡。由於此病可藉接觸與空氣而傳播,可以說是世界上所有重要畜產國家高度嚴防的主要傳染性疾病,也是國際貿易中各國動物檢疫的首要傳染性疾病。國際畜疫會將之列為最重要的 15 種 A 表疾病之一 ,我國動物傳染病分類亦列為甲類疾病。 本病最早於 1514 年在義大利發生後,幾乎所有畜牧事業發達的地區均發生過。本省於日據時代 1913 年至 1916 年、1924 年至 1929 年前後發生兩次流行 ,經勵行發病場撲殺政策後撲滅。1997 年 3 月 20 日確診又再度入侵,經研判其原因可能為自疫區走私偶蹄類動物、屠體或人員參觀疫區養豬場而傳入。 口蹄疫是一種 RNA 病毒,由 PicornaviridaeAphthovirus 引起,本病毒共有 7 種血清型,81 種以上之亞型,各血清型別間無交叉免疫保護效果,7 種血清型代表 7 種不同之口蹄疫。病毒直徑約 23 nm,表面共有 4 種主要的結構蛋白質:VP1、VP2、VP3、VP4,已知 VP1 能產生中和抗體。 本病毒一般不耐酸也不耐鹼,pH < 6 或 pH > 9 的環境足以殺死病毒。低溫可存活很久(攝氏零下可長達數年),溫度越高抵抗性越低。肉類加熱處理超過攝氏 80 度很快可以把病毒殺死。本病可由空氣傳播或直接與感染動物、病畜製品或污染物品接觸而感染。病毒在低壓低風速、高濕度、低溫度等有利情形配合下,可藉空氣傳播到數公里外使動物感染。人吸入口蹄疫病毒可在鼻或喉頭部位保毒 3~21 小時,並可藉此傳給其他具感受性動物。病毒可恢復牛之咽喉食道持續排毒 6~36 個 月,從羊之食道粘膜排毒約為 4~6 個月。國際畜疫會(Office International Des Epizooties,OIE)手冊中列有數種診斷方法,例如細胞接種分離病毒、酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、病毒中和試驗(VN)等,本標準為參酌 OIE 之方法所訂定適合吾國之診斷步驟。

二、臨床症狀與剖檢病變:

臨床症狀:

牛: 本病潛伏期 1~7 天。特徵為發熱、倦怠、食慾不振、流涎等症狀,伴隨著口腔形成水疱,破裂後形成糜爛。蹄部出現水疱時則有跛足現象。水疱同樣可發生在乳房皮膚。泌乳量減少,乳房炎和流產為一般症狀。水疱開始形成時如大頭針頭大小,然後可增大至核桃大或更大。水疱常發生融合,形成 瀰漫性損害。蹄部症狀常見于蹄冠和趾間,局部有熱感、發紅、微腫和疼痛 。經過 1~2 日,於上述蹄部無毛處出現小水疱並很快增大;初期充滿透明的 然後變為混濁的漿液,水疱破裂後形成爛斑。母牛,尤其在泌乳期,幾乎均 可在乳頭皮膚產生水疱,病毒在乳腺上皮增殖病牛於潛伏期和臨床症狀發生 期內可從乳汁中分離到病毒。口蹄疫病變也可見于鼻咽部、食道和瘤胃,有 時也見於母牛陰道粘膜及公牛陰囊。成年動物死亡率很少超過 5 %,幼年動物 則高達 50 %。但惡性口蹄疫也對成年動物具高度致死率。新生犢牛呈最急性經過而不形成水疱。病犢出現高熱、極度衰弱、心臟衰竭、常見下痢。經 1 至 2 日因心肌炎而死亡。
   
羊: 綿羊感染口蹄疫之潛伏期為 1~6 日,其症狀有時輕微至不被察覺,尤其 是水疱僅限於口腔粘膜時,由於水疱較小,有如米粒大,又無其他明顯之症 狀如流涎等,而且水疱迅即消失,因此不易被察覺。但如仔細檢查仍可見到 上唇發炎腫脹,有時頰部和咽部也發炎腫脹。 蹄部也和牛相同,於發生水疱時出現跛足現象,但水疱小得多,最後病 羊避免任何運動。發炎變化常漫延至蹄小囊,可從蹄小囊之輸出管擠出多量膿性乾酪樣團塊。個別病例的乳房上、陰唇上和陰道中也有小水疱,舌上也常見有小水疱。患病羊群如飼養環境良好、乾燥時,本病幾乎呈輕微與良性的經過。反 之,如飼養環境不良並常加驅趕時,則容易使病情惡化,如繼發感染則可引 起局部化膿、骨骼壞死、蹄脫落和敗血症。孕羊常流產。 山羊症狀與綿羊相同,但有時也可見到嚴重病例,部份伴有心臟病變。 在較劇烈的流行時,全身症狀如虛弱、高熱、食欲減退或廢絕、泌乳停止等 均較顯著還常出現唇部和面頰腫脹。伴有心臟病變的惡性病例或死於衰竭, 或無明顯症狀而突然死亡。 乳山羊感染口蹄疫常出現嚴重的典型口蹄疫症狀。
   
豬: 豬的症狀與牛相似,跛足為常見的症狀。潛伏期約 1~7 天,最短 12 小 時,最長 14 天。哺乳仔豬感染本病時突然整窩暴斃,死亡率可高達 100 %,仔 細檢查可在舌頭、牙齦、口蓋、趾間等處發現水疱。母豬感染時口、鼻、舌頭、牙齦、口蓋、乳房、乳頭、蹄冠部、趾間出現水疱,約 1~2 日水疱破裂,患部糜爛出血,蹄冠裂開,嚴重時蹄會脫落。發病期體溫上升(攝氏 40~ 41 度)、拒食、口中流涎含白色泡沫,懷孕母豬會發生流產,死亡率低。肉豬症狀與母豬相似,於口、鼻、蹄部出現水疱、蹄裂甚至掉蹄,發熱、拒食、流涎含白沫,死亡率約 5 %。

剖檢病變: 典型的水疱不一定可看到,不過一旦發生多經破裂而成糜爛、出血及肉芽腫狀的粘膜,這種病變在鼻、口腔、乳房或蹄等部位發生。解剖時也可見胃腸病變,特別在瘤胃,偶爾會陰、外陰及陰唇也會有病灶,幼年牛感染時可見虎斑心(灰、白或黃色的心肌病變)。豬感染本病時也可見氣管、支氣管、咽喉、食道、胃粘膜之潰瘍,大小 腸粘膜點狀出血,腸漿膜面出現水疱。心包膜點狀出血、心肌表面可見灰白 色或黃色條紋斑塊(虎斑心),心肌切面可見灰白色或黃色壞死區。虎斑心常見於暴斃之哺乳仔豬,偶見於急性死亡的肉豬。 口蹄疫水疱之大小差別甚大,依動物種類及其發生部位而定。最小的見于山羊如大頭針頭,而最大的則見于豬的鼻部與牛之舌頭。

三、實驗室診斷

本病在臨床上無法與豬水疱病 (swine vesicµlar disease)、水疱性口炎(vesicµlar stomatitis)及豬水疱疹(vesicµlar exanthema of swine)加以區別,必須進行實驗室確診。由於口蹄疫病毒之高度傳染性及空氣傳播之特性,其診斷實驗室必須是經中央主管機關指定的負壓隔離密閉之實驗室。位於英國坡布萊 (Pirbright) 經國際畜疫會認證之口蹄疫世界參考實驗室(WRL for FMD),接受世界各地送檢之疑似口蹄疫病材。該實驗室並對具有負壓隔離密閉之診斷實驗室提供口蹄疫 ELISA 診斷試劑。

 

病材之採取: 水疱液及水疱上皮之採取 供診斷用之病材以未破或剛破不久之水疱上皮最好(最少要採 1 gm), 水疱液(最少 1 ml)也可。水疱上皮需置於 5 ml 可密封之塑膠無菌瓶,並加入輸送液 2 ml(甘油一份、0.04 M 磷酸緩衝溶液(PBS)一份,加入 500 IU / ml 青黴素、500 µg / ml 鏈黴素,並以 0.1 M NaOH 調整 pH 值至 pH 7.2~7.6) ,如無輸送液,可以細胞培養液或 PBS 代替。病材須馬上冷藏(8 ℃ 以下), 並於 12 小時內連同病歷表送達前述之負壓隔離密閉診斷實驗室。 如果無法採到水疱上皮時,例如發病前、恢復期或是可疑患畜,則必須採取咽喉食道液(oesophageal-pharyngeal fluid; 簡稱 OP 液)。使用食道探子(probang) 採集,採取後,倒入 20 ml 廣口瓶,並檢查其內容,如混有反芻之食 物或血液則必須丟棄並重新採取,取 2 ml 與等量之輸送液(0.08 M PBS 含 0.01 % 牛血清白蛋白,0.002 % phenol red, 500 IU / ml 青黴素,500 µg / ml 鏈黴素,pH 7.2)混合,最終之 pH 須在 7.6 左右為佳。OP 液採取後必須馬上冷藏(8 ℃ 以下)或冷凍,如以乾冰冷凍須密封,以防止二氧化碳之滲入而使 酸度增加,因口蹄疫病毒對酸很敏感。
血液之採取: 以 10 ml 塑膠注射筒(不加抗凝劑)由頸靜脈採取 5 ml 的血液,裝於塑膠 無菌試管連同病歷表送檢,血液只可冷藏不可冷凍。
確診方法 : 一是證明其抗原之存在,另一是證明其已產生抗體。
   
證明抗原    
病毒分離 : 收到病材時先於登記簿上登記,然後以試紙檢測其 pH 值並將其登記在登記簿上。無菌操作取出病材,滴除輸送液,稱重後以乳缽研磨再以 0.04 M PBS 製成 10 倍乳劑,1000 xg 離心 10 分鐘,取上清液保存於 4 ℃ 供病毒分離或 酵素結合免疫吸附試驗用,但不可超過二天,長期保存則保存於 -70 ℃。上述病材上清液或水疱液,接種於已形成單層細胞之初代牛甲狀腺細胞、初代牛、豬、小羊之腎臟細胞或是 BHK-21、IB-RS-2、ESK 等株化細胞。病毒量少時,初代細胞較株化細胞敏感。接種後觀察其有無細胞病變作用(CPE) 產生。產生 CPE 者以下述之酵素結合免疫吸附試驗,鑑定其是否為口蹄疫並鑑定其血清型別。
酵素結合免疫吸附試驗 : 試劑由 Pirbright 的口蹄疫世界參考實驗室提供,可以用來檢測病材中之口蹄疫病毒並鑑定血清型別,目前由該實驗室所提供之試劑套組可以檢測鑑定的血清型包括 O、A、C 、Asia 1 以及 SVD。其方法為:
  先將兔抗各種血清型 FMD 病毒及 SVD 病毒之血清溶於 coating buffer 後被覆於 96 孔 ELISA 免疫盤,每孔 50 µl,密封後置 37 ℃ 感作 1 小時,以 PBS 清洗 3 次,甩乾。加入病材乳劑 50 µl 以及陽性、陰性對照抗原各 50 µl。置 37 ℃ 感作 1 小時,感作後以 PBS 清洗 3 次,甩乾。
  再加入天竺鼠抗各血清型 FMD 病毒及 SVD 病毒之血清各 50 µl,同樣置 37 ℃ 感作 1 小時,PBS 洗 3 次。
  加入酵素連結之兔抗天竺鼠血清 50 µl,置 37 ℃ 感作 40 分鐘,以 PBS 充分清洗 3 次。
  加入受質及呈色劑 50 µl,作用 15 分鐘,最後加入停止液 50 µl。
  以 ELISA 判讀機判定,平均 OD 值扣除背景值後 大 於 0.1 者為陽性,接 近 0.1 者,須再重測或以細胞培養觀察其有無 CPE 產生。
  証明抗體 檢測抗體可用中和抗體試驗及 ELISA 試驗。ELISA 試驗有較為敏感,可大量檢測,時間較短,不需細胞培養系統等優點。
  中和抗體檢測 細胞可使用 BHK-21、IB-RS-2、小牛、小羊或豬之初代腎臟細胞。96 孔微 量培養盤,最低必需培養液(MEM)等為必需品。種毒(K4)先接種於已形成單 層細胞之仔倉鼠腎細胞株(BHK-21)等細胞,產生 CPE 後收集之,加入 50 % 甘油 。測定力價後,分裝保存於 -20 ℃,可維持約一年。血清 56 ℃ 30 分鐘不活化, 對照血清採取 21 天恢復期之豬血清。檢測中所有加的量以 50 µl 為準。
  血清稀釋由 1 / 4 稀釋起,以 2 倍序列稀釋,每一稀釋做二重覆,每孔量 50 µl。
  加入 100 TCID50 之病毒每孔 50 µl。
  對照血清包括已知力價之陽性血清、陰性血清,尚須細胞對照,培養液對照,病毒對照。
  蓋上蓋子置 37 ℃ 感作一小時。
  加入 50 µl 之細胞懸浮液,其細胞數為 106 cells / ml。
  48 小時後即可以有無 CPE 作判定,如要固定則等到第 3 天(以甲醇固定 2 分 鐘)。 1 / 45(含)以上為陽性,1 / 11(含)以下為陰性。
ELISA 抗體檢測: 先將兔抗各種血清型 FMD 病毒之血清溶於 coating buffer 後被覆於 96 孔 ELISA 盤每孔 50 µl,密封後置 4 ℃ 一夜。 血清與 coating buffer 之比為 1:1000,每一盤約需 6 ml(6 µl 兔抗 FMDV serotype 血清溶於 6 ml coating buffer)。測試血清與對照血清均稀釋 1 / 16,血清稀釋後各吸 50 µl 移入 96 孔 平底 微量 盤。然後加入口蹄疫抗原每孔 50 µl,與前面加的稀釋血清 50 µl 合計共100 µl ,輕敲盤角使抗原與血清充分混合,置 4 ℃ 一夜。
血清稀釋: 搖盪測試血清及對照血清使均勻,測試血清與對照血清均稀釋 1 / 16。(對照血清 C++、C+、C- 為 15 µl 之對照牛血清加入 225 µl 的 diluent buffer A 中,測試血清則為 10 µl 加入 150 µl diluent buffer A 中,C++、C+ 為各型陽性血清)。血清稀釋後各吸 50 µl 移入 96 孔平底微量盤中並另取紙張將血清位置加以標記。
清  洗: 將前一日被覆之 96 孔 ELISA 盤反轉過來甩掉內容物,須將它甩至容器槽,再以不起毛球之吸水紙瀝除餘液,以清洗液將每個小孔注滿後,再將清洗液甩掉,以吸水紙瀝淨,共重覆清洗三次。清洗時不得讓 96 孔 ELISA 盤之各孔乾凅。

將血清抗原混合液轉置至 ELISA 盤,置 37 ℃ 感作 1 小時。 在完成三次清洗並確定沒有殘餘液體留在盤中,取 50 µl 量的血清抗原混 合液,注入 96 孔 ELISA 盤中的相對位置,其盤子標記需與液相時相同。轉置時 對每個 Sample 要用新的滴頭。 接著把 96 孔 ELISA 盤封蓋起來,置於 37 ℃ 恆溫箱內的平台搖擺機上,持續 搖擺感作 1 小時(搖擺頻率每分鐘 120 次)。

注意:所用的平台搖擺機,要有效的完全混合,且不得將內容物濺出。

若沒有平台搖擺機時,可用手打方式,輕敲盤子四周,以使反應 物均勻混合。

如 96 孔 ELISA 盤在恆溫箱中的搖擺機上需重疊時,則僅蓋上最上 面的一盤,而此種情形可能造成熱差度效應及蒸氣,最好不要重疊。 利用此一小時配製稀釋緩衝液 B 以供下一步驟用。

稀釋緩衝液 B 的製備: 0.01 M 磷酸緩衝生理鹽水 pH 7.2~7.6 加入 0.05 % 之 Tween 20,再加入 5 % 脫脂 奶粉。在測試當天,計算緩衝液 B 所需的量,並由相等量的稀釋緩液 A,加入最終濃度為 5 % 的脫脂奶粉製備而成。例如:製備 100 ml 的稀釋緩衝液 B,只需將 5 g 的脫脂奶粉加入 100 ml 的稀釋緩衝液 A 即得。調整 pH 值至 7.2~7.6 之間(以 0.1 M NaOH 調整)。

加入稀釋 100 倍之天竺鼠抗 FMDV 各血清型抗體每孔 50 µl,置 37 ℃ 感作 1 小 時。 在血清抗原混合液感作終止之前,要先以稀釋緩衝液 B,將保存的同源偵 測抗體(天竺鼠抗 FMDV 各血清型抗體)稀釋 100 倍,其體積量要足夠所使用的 96 孔 ELISA 盤數,(每盤以 6 ml 計,以 0.06 ml 的天竺鼠抗血清加入 6 ml 的稀釋 緩衝液 B 中)。將剩下的偵測抗體立即放回 4 ℃ 保存。

注意:從盤子中倒出的內容液及清洗液,必須倒入含 0.2 % 枸椽酸消毒液的桶或槽中消毒,而碰到盤中試藥的可丟棄式滴頭,也要以此法消毒。

操作方法:感作 1 小時後,從培養箱中取出 96 孔 ELISA 盤,依先前方法,以 清洗緩衝液清洗 96 孔 ELISA 盤,在清洗後馬上加 50 µl 量的 100 倍稀釋偵測抗體,於 96 孔 ELISA 盤的每孔中,再輕輕拍打 96 孔 ELISA 盤四周確定偵測抗體均已完 全分佈於每孔底部,再將 96 孔 ELISA 盤封蓋後置於 37 ℃ 恆溫箱的搖擺機上,持 續搖擺 1 小時。

加入酵素連結之兔抗天竺鼠血清每孔 50 µl,置 37 ℃ 感作 1 小時。在偵測抗體感作終止之前,馬上以稀釋緩衝液 B,將酵素連結之兔抗天竺鼠血清稀釋 200 倍,其量要足夠所用於檢測的 96 孔 ELISA 盤(每盤以 6 ml 計算,將保存的酵素連結兔抗天竺鼠血清 30 µl 加入 6 ml 的稀釋緩衝液 B 中)。剩下的酵素連結兔抗天竺鼠血清立即放回 -20 ℃ 保存。

操作方法:感作 1 小時後從恆溫箱中取出 96 孔 ELISA 盤,以上述方法用清洗緩衝液清洗 3 次,洗後每孔立即加入 50 µl 之 200 倍稀釋酵素連結兔抗天竺鼠血清,並輕拍盤子四周,確定酵素連結兔抗天竺鼠血清,都完全落於每孔之底部。再將盤子封蓋後置於 37 ℃ 恆溫箱中搖擺感作 1 小時。用剩之酵素連結兔抗天竺鼠血清液不要倒掉,受質 / 呈色劑製備液也不要丟棄,因這些剩餘試液在出現問題時,將可用來檢查酵素及受質的活性。

加入受質 / 呈色劑每孔 50 µl,置室溫 15 分鐘。在酵素連結兔抗天竺鼠血清感作終止之前,須先準備受質 / 呈色劑溶液,其量要足夠所檢測的盤數(例如:1 盤需取 30 µl 的受質 H2O2 加入 6 ml 的 OPD 中),OPD 的濃度為 3.3 mM, H2O2 是 4.4 mM。最後的受質 / 呈色劑溶液必須是無色的,且需存放於暗處,如有色澤呈現,則必須丟棄。 取一塊乾淨沒有被覆抗體的 96 孔 ELISA 盤,以之當作 ELISA 判讀機判讀時的背景盤(此盤用完後可清洗,並可留作往後測試時的背景盤用)。

操作方法:於酵素連結兔抗天竺鼠血清感作 1 小時後,以前述方法清洗 96 孔 ELISA 盤,要確定所有孔洞均完全被清洗緩衝液沖洗,以清除無反應之酵素連結兔抗天竺鼠血清。清洗完成立即加入受質 / 呈色劑每孔 50 µl,由空白對照盤開始,於加第一 孔時即開始計時,置室溫 15 分鐘。

15 分鐘後由空白對照盤開始加停止液,每孔 50 µl,置搖擺機使混合均勻。

置 ELISA 判讀機以波長 A492 讀取其 OD 值及計算其 PI 值,PI 值大於 50 為陽性。

四、參考文獻:

Office International Des Epizooties (1996). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Third edition. Paris, France. Ferris N. P. (1996). Indirect Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Detection of Antibodies of Foot-and-Mouth Disease Virus. Bench Protocol, World and E. E. C. Reference Laboratory for Foot & Mouth Disease. Pirbright, U. K.

附錄一:各種試劑配製方法

一、 0.01 M PBS 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 pH 7.4 ±0.20 標貼後存於 4 ℃,不可超過二週。
二、 0.04 M PBS .BPR 5K 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 250 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於 4 ℃,不可超過二週。
三、 0.08 M PBS 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 125 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於 4 ℃,不可超過二週 。
四、 0.1 M NaOH 取 NaOH 0.4 gm 溶於滅菌過之蒸餾水 100 ml 中 以塑膠瓶盛裝 標貼後保存於室溫。
五、 細胞培養液 MEM (GIBCO) 1900 ml 胎牛血清 100 ml 青黴素 100 IU/ml 鏈黴素 100 µg/ml Fungizone250 µg / ml 標貼後保存於 4 ℃,不可超過四週 。
六、 稀釋液 A (Diluent Buffer A) 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 加入 0.5 ml 之 Tween 20 pH 7.4 + / - 0.20 標貼後保存於 4 ℃,不可超過二週。
七、 稀釋液 B (Diluent Buffer B) 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 加入 0.5 ml 之 Tween 20 加入 5 % (W / V) 脫脂奶粉(Marvel,Chivers & Sons Ltd.) pH 7.4 ± 0.20 當天配製。
八、 清洗液 (0.002 M PBS) 取 PBS 粉末一瓶 (Sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 5000 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於室溫,不可超過二週。
九、 消毒液 0.2 % Citric acid (W / V) . BPR 5K 取 2 gms 枸椽酸溶於 1000 ml 水中標貼後保存於室溫。
十、 Chromogen Buffer 0.05 M phosphate-citrate buffer, pH 5.0 取 phosphate-citrate buffer 一錠 (Sigma P-4809) 溶於 100 ml 蒸餾水中 pH 5.0 標貼後保存於 4 ℃,不可超過一週。
十一、 Chromogen stock 3.3 mM OPD 取 Ortho-Phenylenediamine (OPD) 一錠 (Sigma P-8412) 溶於 50 ml Chromogen Buffer pH 5.0 中 標貼後保存於室溫黑暗處。
十二、 停止液 (1.25 M Sµl phuric Acid ):慢慢的將 68 ml 濃鹽酸 (18 M) 加入 932 ml 之蒸餾水中 標貼後保存於室溫 。

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