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水疱性口炎
Vesicular stomatitis
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水泡性口炎 ( Vesicular Stomatitis, VS )

       水泡性口炎 (Vericular stomatitis;VS) 是馬、牛、豬的水泡性疾病,是由屬於 RhabdoviridaeVesiculovirus 所引起。臨床上 VS 與口蹄疫 (Foot- and-mouth disease;FMD) 及豬水泡病 (Swine vesicular disease;SVD) 難以區別。以感染動物而言,馬不會感染 SVD,而綿羊、山羊及其他許多野生動物皆可感染 VS,人類對 VS 亦具感受性。VS 之發生主要局限於美洲,然而法國與南非亦曾有發生報告。

       VS 主要是直接經由皮膚或粘膜而傳染,VS 病毒可自沙蠅 (sandfly) 及蚊子體內分離出來,因此推測 VS 可經由昆蟲傳播。而季節的變換會影響 VS 之發生率,VS 常於熱帶地區雨季結束時或溫暖地區第一次降霜時節發生,有時亦可於流行病鏈 (epidemiological chain) 末端動物或植物身上發現 VS 病毒曾存在的證據。此病的致病機序目前仍不清楚,且特異性的抗體亦無法預防 VS病毒之感染。

       對 VS 病毒具有感受性的動物包括馬、豬及牛,而 FMD 可感染牛及豬,SVD只能感染豬,由於三種疾病的臨床症狀相似,因此立即且確實的區別診斷相當重要。

       確診病原:VS 病毒能在數種細胞株、哺乳小白鼠或雞胚蛋中分離出來,因此實驗室中已不需要進行天竺鼠、牛、馬、豬的動物接種試驗。病毒抗原可由間接三明治酵素結合免疫吸附試驗 (indirect sandwich enzyme-linked immunosorbent assay;IS-ELISA)檢測出來,這是最快及最經濟的方法。另外,補體結合試驗 (complement fixation;CF) 亦是一個不錯的選擇,而病毒中和試驗 (virus neutralisation;VN) 亦可使用,但步驟較繁複且費時。

血清學檢測:動物感染後 4~8 天,體內會產生特異性抗體,可由液相阻斷ELISA(liquid-phase blocking ELISA;LP-ELISA ) 及 VN 試驗檢測出來,其他如膠內免疫擴散反應 (agar gel immunodiffusion)、相對免疫電泳法(counter immunoelectrophoresis) 及競爭性ELISA ( compectitive ELISA ) 等方法亦可使用。

疫苗及診斷試劑:以氫氧化鋁或油劑為佐劑的不活化疫苗,已在美國及哥倫比亞測試其效果,兩種疫苗皆可在被免疫的牛身上產生高量特異性抗體,但目前仍不確定血液中的抗體是否能抵抗病毒的感染。另外有一種馴化活毒疫苗,亦已使用於田間試驗,但仍無確切結果。


A. 診斷技術

水泡性口炎首見於美國 1926(18) 及 1927(8),馬先發生水泡性疾病,之後牛、豬群也接著發生,VS 病毒會使牛、馬、豬、其他經濟動物與野生動物的舌頭、唇、口腔粘膜、乳頭及蹄冠狀帶產生水泡,其他實驗動物亦具感受性。
VS 的發生主要局限於美洲,然而法國(1915 及 1917 年)及南非(1886 及 1897年)(12) 也曾有報導。VS 在人身上只能看到類似感冒症狀,看不到水泡的發生,人類通常是因接觸病畜或操作 VS 病毒而被感染,因此必須特別小心。

VS 病毒在免疫學上主要分為兩型:新澤西型 (New Jersey;NJ) 及印第安納型(Indiana;IND),兩者皆屬 Rhabdoviridae Vesiculovirus,目前已研究至分子階段。NJ 型以引起牲畜疾病為主,造成較嚴重的臨床症狀,潛伏期比IND 型短。過去數 10 年來,許多其他相近的 Rhabdovirus 已相繼自病畜身上分離出來,其中 Salto-Argentina / 63 株及Alagoas-Brazil / 64 株最具代表性,分別被歸為 IND 的亞型 IND-2 及 IND-3(9)。

NJ 株及 IND-1 株是由地方流行性疾病中確診而來,發生地如美國東南部、墨西哥、中美洲、巴拿馬、委內瑞拉、哥倫比亞、厄瓜多爾及秘魯。IND-2 Salto-Argentina / 63株是在 1963 年阿根廷由馬身上分離出來,而 IND-2 Marpu-Argentina / 86 及另外兩株則在 1966 及 1979年 於巴西分離出來,在分類上此 4 株被歸於同一亞型中,只會感染馬(2, 3),牛與病馬同居並無任何抗體的陽轉現象。

IND 株的代表是 IND-3 Alagoas-Brazil / 64 株,只在巴西確診過,在 1979年以前IND-3 亞型皆只能自馬身上分離出來,而 IND-3 Espinosa-Brazil / 77 是第一次自牛身上分離出來的病毒株,且牛感染 IND-3 的症狀比馬輕微(2, 3),此次的發現,證實了VS 在 1926 年及 1927 年(8, 18) 的首次發生情形,即 NJ 及IND 亞型會先感染馬,再繼發於牛群及豬群感染。

直至目前,VS 的傳染機制仍不清楚,VS 病毒曾自沙蠅、蚊子及其他昆蟲身上分離出來,故此病可能經由昆蟲傳播(7, 11, 17),亦有假說認為 VS 病毒可生存於牧草植物,而動物為流行病鏈的尾端宿主。在特殊環境之下,病毒經適應而對動物具感染力,接著再傳播至其他具感受性動物身上。

1982 年美國出現許多直接傳染的病例(20),但在病畜身上無法真正診斷為 VS,因此被認為是野生動物(尤其是東南部的野豬)的地方性流行病(6)。

VS 可感染的族群相當廣,通常只有 10~15 % 出現臨床症狀。主要感染成年動物,少見感染 1 歲以下的牛馬,而其死亡率幾乎為零,但豬感染 NJ 株則死亡率高。感染後 2週恢復,主要損失在於乳房炎及日產量下降(15)。除了馬以外,在臨床上 VS 與FMD、SVD 無法區別診斷,因此發生初期的實驗室診斷是相當重要且緊急的。而豬水泡疹 (Vesicular exanthema of swine;VES) 及其他 calicivirus 引起疾病則無需區別診斷,因為最近一次於美國 1956 及 1959年爆發的 VES 已依計畫撲滅。但必須正視下列事實,目前美國太平洋岸許多哺乳類及魚類身上已分離到與 VES (calicivirus) 相關的病毒,這些動物可能是類似 VES (VES-like) 疾病的病原保毒動物(21)。

為了對 VS,FMD 及 SVD 三種水泡性疾病做區別診斷,因此收集病材的方式一定要相同,水泡液、未破水泡上皮、新破水泡上皮為最佳樣品,可自口唇病變、蹄及其他任何有水泡形成部位取得,但為了取材人員安全及動物權,取病材時需先鎮靜動物。上皮病材可放在裝有 pH 7.2 ~ 7.6 甘油緩衝液的瓶子內,上皮與甘油緩衝液體積比例不可超過 1:10,保存於 4 ℃ 或 -20 ℃,若一時找不到甘油緩衝液,上皮病材可先冷凍起來, 再裝進有乾冰的密封瓶內,避免 CO2 進入瓶內使 pH 值降低破壞病毒。

若無法自牛身上取得上皮組織,可用咽喉探杯 (Probang Cup) 取得食道咽頭液(Oesophageal-Pharyngeal fluid,OP fluid)。對豬取材時,可用棉棒擦拭咽喉 (throat swab),送交實驗室分離病毒。一旦病材送到後,應放入不含血清的組織培養液中,而 OP液需在乾冰保存狀態下運送至實驗室。

在恢復期病畜身上很難採到可供確診的病材,此時可收集血清以檢測特異性抗體。自同一動物體取得成對血清 (pairs of sera),中間間隔 2 星期,測兩次之間抗體增加量加以判斷。

VS 病毒的診斷試劑尚未有商業化產品出現,現由各實驗室自行製造,目前有 2 個 OIE水泡性口炎參考實驗室(請看第頁的表格)及動物衛生研究所 *(Institute for  Animal Health)可接受委託製造區別診斷試劑。
*動物衛生研究所地址如下:Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,Ash Road, Pirbright, woking, surrey GU24 ONF, United Kingdom。

確診病原
為了做區別診斷,含 VS 病毒之野外病材上清液需做免疫學試驗。病毒分離方面,病材可接種於特定細胞中,用轉動瓶培養 (roller bottles) 比用角瓶培養敏感。可用的細胞有非洲綠猴腎細胞 (African green monkey kidney,VERO)、幼倉鼠腎細-21 (baby hamster kidney-21;BHK-21) 及 IB-RS-2細胞。VS 病毒在三種細胞皆形成CPE。FMD 病毒使 BHK-21 及 IB-RS-2 出現 CPE,而 SVD 只在 IB-RS-2 形成 CPE。而許多其他細胞株及來自動物的初代細胞,皆對 VS 病毒具感受性。

接種 8~10 日雞胚尿囊腔,2~7 日齡哺乳小鼠以任何途徑接種,3 週齡小鼠腦內接種,皆能使 VS 病毒增殖分離出來。被接種動物皆會在 2~5 日內死亡,皮內接種是對馬及牛最敏感的方式,豬則是對蹄冠狀帶及鼻部接種最敏感。在接種後 2~4 天,就能在口唇上皮、乳頭及蹄出現水泡,水泡出現的速度視病毒株毒力而定。CPE 的組織培養上清液、死亡小鼠或雞胚肌肉骨骼組織的均質上清液及上皮病材上清液,皆可用於免疫學試驗以確認病原。其中小鼠腦組織為病毒最佳來源。形態學方面,rhabdovirus(VS 病毒)及 calicivirus(FMD病毒及 SVD 病毒)具不同形態特徵,當水泡液或上皮組織含大量病毒時,可用電子顯微鏡做診斷,確認所屬科別。

在實驗室中,確認病原最佳的免疫學方法為酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)(2, 10) 及補體結合試驗 (CF test)(2, 13),病毒中和試驗 (VN) 需要 VS 病毒的 NJ 及 IND的陽性血清,才能應用於組織培養、哺乳小鼠或雞胚蛋,且需時較久。

目前一般用 IS-ELISA(2, 10) 以區別 VS 之病毒亞型及其他水泡性疾病。ELISA 步驟中需用一組多價兔 / 天竺鼠抗血清 (rabbit / guinea pig antisera) 這是用三種 IND 亞型病毒株製造出來的,故可檢測所有 VS 病毒的 IND 亞型(2)而 NJ 株則使用單價 rabbit /guinea pig antisera(2,10)。

◆步 驟:

固相 (solid phase):

以 pH 9.6 carbonate / bicarbonate 緩衝液,稀釋不同濃度的 rabbit antisera,取 50 ul 加入 ELISA 盤。

同時取 50 ul 正常兔血清加入 ELISA 盤(見文獻 2 及 4 的敘述)。

於 37 ℃ 作用 1 小時或 4 ℃ 整晚後,以含 0.05 % tween 20 之 PBS 清洗一次。

加入含 1 % 卵白蛋白 (ovalbumin) 的 PBS,室溫作用 1 小時以中止反應。

 ELISA 盤可立即使用或以 PBS 清洗 3 次後,保存於 -20 ℃ 備用。

 病 材:

雞胚胎的肌肉骨骼組織和小鼠組織需泡在 PBS 中製成 10~20 % 上皮 組織懸浮液;而組織培養上清液不需稀釋。

將待檢樣品 50 ul 加入相對孔 (well) 中,放在規則搖擺器 (orbital shaker) 上 37 ℃ 作用 30 分鐘。

檢測試劑 (Detector):

與兔血清相對應之單價 NJ 及多價 IND 亞型的天竺鼠抗血清,以 PBSTB(含有 0.05 % tween 20,1 % ovalbumin,2 % 正常兔血清的 PBS)稀釋後,取 50 ul 加入相對應孔中。

於 37 ℃ 搖擺作用 30 分鐘。

結合劑 (conjugate):

將 peroxidase / rabbit 或 goat IgG anit-guinea pig Ig conjugate 以 PBSTB 稀釋後,取 50 ul 加入每孔中。

 37 ℃ 搖擺作用 30 分鐘。

受質 (substrate):

 H2O2 活化受質 ( H2O2-activated substrate) 50 ul 加入各孔中,室溫下作用 15 分鐘。

加入硫酸液中止反應。

使用 ELISA 判讀機測定吸光值。

本項試驗中,所有試劑皆用 50 ul,每個步驟皆需以含 0.05 % Tween 20 的 PBS 清洗 5 次。

結果判讀:若受檢樣品對其中某種抗血清之吸光值高於其他種抗血清、正常血清及對照組超過 20 %者,可視為陽性。

補體結合試驗 (complement fixation test)

ELISA 試驗較 CF 試驗為佳,因 ELISA 較敏感且不易被 pro-complementary 或 anti-complementary 因子干擾,但是當 ELISA 試劑無法取得時,可進行 CF 試驗。CF 試驗需使用 U 型底的微量分析盤及 CF50 % 試劑。

◆步 驟:

抗血清:單價 NJ VS 病毒及多價 IND VS 病毒之天竺鼠抗血清,分別以佛羅拿緩衝液 (VB) 稀釋成含 2.5 CFU50 (50 % complement fixation units)的濃度,加入各相對應孔中,這些抗血清與上述 ELISA 所使用的檢測劑相同。

病材:與 IS-ELISA 處理方式相同,與血清一起加入孔中。

補體:4 CFU50 (50 % complement haemolytic units) 加入各孔中,將抗血清檢測樣品及補體混合後,於 37 ℃ 作用 30 分鐘。

溶血系統:

綿羊紅血球 (Sheep red blood cells,SRBC) 懸浮於 VB 中,當溶血系統可在 545 nm 讀取 0.66 的吸光值時,取 2 倍體積的溶血系統加入 3 倍體積蒸餾水。

於 37 ℃ 作用 30 分鐘。

將盤子離心,以肉眼判讀結果。

CF 試驗中,抗血清檢測樣品及補體體積皆為 25 ul,而溶血系統為 50 ul 。CF 50 % 試驗亦可以試管法檢驗之(2),各試劑積為微量稀釋盤的 8 倍,用波長 545 nm 光電比色計判讀結果。

結果判讀:當對照組正常,而檢測樣品對某一種抗血清比其他抗血清及對照組的溶血度低於 20 % 時,可視為陽性。以 ELISA 及 CF 試驗檢測為陰性的樣品,需再接種於哺乳小鼠或組織培養中,若連續三代結果都是陰性,才能判定為 VS 陰性。

血清學試驗

確認及定量血清特異性抗體,可使用液相阻斷 ELISA (liquid-phase blocking ELISA, IP-ELISA) 及病毒中和試驗 (VN test),而 CF 試驗可用於早期抗體之定量。

ELISA

IP-ELISA 可用於檢測及定量 VS 病毒引起的抗體,推薦以病毒醣蛋白 (glycoprotein) 為抗原,其優點為不具傳染性,可檢測中和抗體量,同時偽陽性結果也較 VN 少。

◆步 驟:

固相:見前面所述 IS-ELISA 之 A.1.a.。

液相:

使用 U 型底微量盤,第一排血清稀釋為 1 / 4 倍,之後以 2 倍連續稀釋法依序稀釋。

每孔加入等體積 VS 病毒 NJ 或 IND glycoprotein。

於 37 ℃ 作用 1 小時,吸取 50 ul 混合液至 ELISA 固相盤,37 ℃ 搖擺作用 30 分鐘。

檢測劑、結合劑及受質:與 IS-ELISA 所用試劑及方法相同。

結果判讀:根據 Sepearmann-Karber 法判定 50 % end point 力價,以陰性血清 50 % reduction 的 log10 值為參考值,力價高於 1.3 (1 / 20) 者認為是陽性。

競爭性 ELISA

現已開發競爭性 ELISA 以檢測抗體,方法如 Afshar et al.\P(1)\P 所述,利用 katz et al.(14) 提出之 VS NJ 及 IND-1 重組抗原為抗原。

◆步 驟:

固 相:

抗原以 pH 9.6 carbonate / bicarbonate 緩衝液稀釋,取 50 ul 加入 96 孔 ELISA 盤中。

 4 ℃ 作用一整晚,已覆抗原的盤子可保存於 -70 ℃ 達 30 天之久。

使用時先將盤子解凍,倒掉抗原液,加入 100 ul 阻斷劑。

 25 ℃ 作用 30 分鐘。

倒掉阻斷劑,以含 0.05 % Tween 20 的 PBS 洗三次。

液相:血清以含 1 % 脫脂奶粉 PBS 稀釋為 1 / 8 倍取 50 ul 加入孔中每個血清樣品作 2 重覆,於 37 ℃ 作用 30 分鐘,不需清洗,之後每孔再加入 50 ul 多價腹水液,於 37 ℃ 作用 30 分鐘。

檢測劑:

盤子洗 3 次之後,取 50 ul 的 goat anti-mouse horseradish peroxidase conjugate (以 1 % nonfat dry milk PBS 稀釋之)加入各孔中,於 37 ℃ 作用 30 分鐘。

盤子洗 3 次後,每孔加入 50 ul 的四甲基聯苯銨 (TMB) substrate solution。

 25 ℃ 作用 20 分鐘。

加入 50 ul 0.05 M 硫酸,以 450 nm 波長判讀結果。

結果判讀:以稀釋液做對照,當樣品吸光值低於對照組 50 % 時,判定為陽性。

病毒中和試驗:

病毒中和試驗使用平底組織培養盤,血清樣品需先非動化,NJ 或 IND VS 病毒量為 100 TCID50 (50 % tissue culture infective dose)(有些國家使用1,000 TCID50),細胞為已形成單層的培養細胞(4) 或懸浮 IB-RS-2 細胞,以檢測未被中和之病毒。

◆步 驟:

病毒:NJ 或 IND VS 病毒在 IB-RS-2 細胞增殖後,加入 50 % glycorol 保存於液態氮或 -20 ℃ 中。

樣品:血清在 56 ℃ 非動化 30 分鐘,陽性及陰性標準血清亦需非動化。

病毒中和:

血清於第一排稀釋 1 / 4 倍,之後 2 倍連續稀釋,每個血清樣品做二行。

加入等體積 100 TCID50 / 50 ul NJ 或 IND VS 病毒液。

在 37 ℃ 作用 60 分鐘使中和反應完全。

取 50 ul 混合液加入微量盤中。

每孔加入 150 ul 含 300,000 的 IB-RS 細胞或 VERO 細胞液。

蓋上蓋子於 37 ℃ CO2 培養箱作用 48 小時,或以正壓膠帶封盤放在一般培養箱中作用。

結果判讀:當孔中細胞未形成 CPE 時,表示血清具保護力。依據 Sepearmann-Karber 法判定終點力價,當 100 TCID50 病毒液結果介於 30~300 TCID50 之間,且陽性及陰性標準血清與前次檢測值誤差在 2 倍以內者,當血清 50 % 中和力價以 log10 表示時,若數值 > 1.6 (1 / 40) 視為 VS 陽性。

補體結合試驗

本試驗的詳細敘述見於 A.1.b.,以下所述為修正過後的方法。CF 試驗可用於定量早期抗體,因此血清連續 2 倍稀釋後,與 2 CHU50 已知抗原混合,再加入含 4 CHU50 補體的 5 % 正常牛或小牛血清,在 37 ℃ 作用 3 小時,或於 4 ℃ 一整晚,再加入溶血系統,37 ℃ 作用 30 分鐘,以未溶血的最高稀釋倍數為力價,在 1 / 5 以上者被視為陽性。CF 試驗的敏感度較低,且常會被 anti-complementary 或其他非特異性因子干擾。

B. 疫苗及診斷試劑

以氫氧化鋁 為佐劑的 VS 病毒不活化疫苗,已在美國取得許可執照(16),另以油質為佐劑的疫苗已於哥倫比亞進行田間試驗(5),二種疫苗皆可使免疫的馬及牛產生高量特異性抗體,但目前仍不清楚這些抗體是否能抵抗疾病的發生(19),馴化病毒疫苗已在美國、巴拿馬、瓜地馬拉、秘魯及委內瑞拉進行田間試劑,但仍未有確切結果。目前仍無活毒或不活化疫苗上市。

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