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豬水疱病
Swine vesicular disease
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豬 水 疱 病 ( Swine Vesicular Disease, SVD )

       豬水疱病 (SVD) 係一種豬的高傳染性疾病,由腸病毒所引起,會造成冠狀帶及蹄趾間的水疱,有時在唇、舌、鼻吻及乳頭也有水疱病變。豬水疱病病毒株在毒力上呈現不同差異,從無症狀、輕微症狀到極嚴重症狀,後者通常是當豬關在混凝土地面加上潮濕環境下才會見到。豬水疱病最重要是與口蹄疫 (FMD) 在臨床上無法區別,豬若發生水疱性疾病,在未被確診前都要先懷疑是口蹄疫。

       病原鑑定:罹患豬可觀察到水疱,從痂皮或水疱液檢體即足夠供做陽性診斷。如果病材量不夠(小於 0.5 g)或檢測結果為陰性或無法判定。則必須藉由豬源性細胞的病毒接種來分離病毒,若接種後之細胞出現細胞病變作用 (CPE),則要採用酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 或血清中和試驗 (SN) 來證明 SVD 抗原以作為陽性診斷。

       血清學檢測:SVD 病毒特異性抗體可用微量中和試驗或 ELISA 來證實,雖然微量中和試驗需要 2 至 3 天時間,但仍是可被接受的標準試驗方法。許多 ELISA 標準方法已被介紹,但此法會產生一些假陽性結果,最主要是部份腸病毒引起的抗體會與 SVD 病毒發生交叉反應。

所需疫苗和診斷生物學:目前尚無可用之疫苗,診斷方式和標準試劑可從區域參考實驗室取得。

一、診斷技術

豬水疱病 (SVD) 會因病毒株、感染路徑和感染劑量的不同出現無症狀、輕微到嚴重的水疱症狀。SVD 在臨床上與口蹄疫 (FMD) 無法區別,這是本病最重要之處,因此 SVD 病例要藉由實驗室檢測來與 FMD 區別。

SVD 之潛伏期約為 2 至 7 天,並可能出現 41 ℃ 的短暫發熱現象,之後水疱出現在冠狀帶,典型是出現在蹄趾接合處。這些會影響整個冠狀帶,而引起脫蹄。有些水疱會出現在鼻吻,特別是鼻吻背部表面、唇部、舌頭和乳頭,亦可見到膝部淺處潰瘍現象,因而造成豬有跛行和幾天不食。流產不是 SVD 的典型特徵。感染豬通常 2 至 3 週即可恢復。本病感染後唯一重要特徵是在蹄部出現一條深色水平線,這是起因於蹄部生長一時性受阻。而臨床症狀會因感染豬年齡,飼養狀況,和病毒株不同而出現不同結果。若被毒力輕的病毒株感染,可能看不出異樣,特別是豬養在草地或關在厚稻草舖地上。幼畜影響較嚴重。因 SVD 而致死的例子很少見,雖有報告會出現神經症狀,但不常見。感染豬自臨床症狀出現到 48 小時間會自口、鼻和糞便中排泄病毒,大部份病毒是感染後的頭七天從口、鼻產生出來,直到 2 週後停止。病毒可在糞便中持續排毒 3 個月之久,並可持續存在破裂水疱壞死組織中。SVD 病毒對環境有極大抵抗力,並在 pH 值 2.4 至 12.0 範圍中穩定。

因 SVD 可能出現輕微症狀或無症狀,當從疑似病例中採集病材時,也要採集同場中不同豬群的血清檢體。SVD 病毒很可能已存在環境中而被忽略,直到感染到感受性高的豬群才會出現症狀。因此,要確定本病已感染多久,有必要反向尋找被 SVD 病毒感染但外觀正常的陽性豬血清。

SVD 在臨床上無法與 FMD 區別,雖然 SVD 病毒在廣泛的 pH 值下皆穩定,而 FMD 病毒在 pH 值範圍 6.0 至 8.0 以外則非常不穩定。但對於要病毒分離或做抗原偵測的病材必須將其視為含有 FMD 的病材來處理,並且在輸送時必須保存在磷酸緩衝溶液 (50 %) 和甘油 (50 %) 保存液中,再加上抗生素,例如:penicillin(1,000 國際單位 [IU]),neomycin sulphate (100 IU),polymyxin B sulphate (50 IU) 或 mycostatin (100 IU)(以上為每 ml 的最終濃度)。

SVD 病毒已被分類在豬腸病毒族群,屬於小核糖核酸病毒科 (picornaviridae),在抗原上與人類病毒 Coxsackie B5 型病毒有相關。在實驗室內處理 SVD 病毒的工作人員有出現過血清陽性的報告,其中有一例出現腦膜炎病例。但與感染豬在一起的農民或獸醫師皆未出現血清陽性或罹患此病的報告,經過試驗結果 Coxsackie B5 型病毒不可能在豬群中傳染。

病原鑑定

豬發生水疱樣病變,就應懷疑是 FMD 或是 SVD,這二種疾病需在有專門設備的實驗室內進行病原鑑定,缺乏這種設備的國家應把病材送到 OIE / FAO 世界參考實驗室 (WRL) 來檢測。在美洲地區除這兩種疾病外還要增加水疱性口炎的檢測。

檢驗要從病變部病材的懸浮上清液開始著手,使用 ELISA 或血清中和試驗 (SN) 來測試 SVD 和 FMD 病毒的特異性抗血清,病材懸浮液亦要同時接種單層化的 IB-RS-2 細胞(或具感受性的合適豬細胞)、初代小牛甲狀腺細胞(初代或二代)、小牛腎細胞。FMD 病毒將會在上述三種組織上生長,而 SVD 將只會在豬源系細胞中生長。

培養

將淨化後之上皮細胞懸浮上清液接種一些到長成單層化之 IB-RS-2 細胞或其它具感受性豬細胞,若為區別診斷(例如:FMD)牛細胞培養系統也應該使用。合適的培養基是使用 50 / 50 Eagle's complete medium-yeast hydrolysate (LYH),要讓細胞生長則加 10 % 牛血清,要維持細胞則加 2 % 牛血清,若為了病毒分離則不加血清,只加抗生素。 培養細胞每天檢查兩次,當試管內細胞完全出現細胞病變作用 (CPE) 時,收取上清液作 ELISA 或 NT test 等抗原測定來鑑定病毒,陰性者要盲目繼代一次。

免疫學方法

 ◆酵素結合免疫吸附試驗

  本法與 FMD 診斷方法,即間接三明治型酵素結合免疫吸附試驗相同。在多孔 ELISA 盤中使用 SVD 病毒的兔抗血清被覆兩行以作為補捉血清,每行加入待測懸浮液,適當對照組亦包括在內。下一步加入天竺鼠檢測血清(或單株抗體 [MAb] 5B7)。接著加兔抗天竺鼠血清結合酵素,每步驟間要將未結合試劑清洗乾淨。加入酵素受質後若出現顏色反應是陽性反應的指標,強陽性反應可由肉眼視之,也可用分光光度計以 492 nm 讀出。若吸光值大於或等於背景值的 0.1 則是陽性反應。

  以單源抗體為基礎的 ELISA 可用於研究 SVD 病毒株間抗原變異性,組織培養病毒抗原被兔抗 SVD 病毒高免血清捕捉吸附在基質,選用適當的單源抗體組來反應,不同單源抗體可能結合到相同的抗原決定位,加入抗小白鼠過氧化氫酶,就有結果出來。

反轉錄聚合酶鏈反應檢測病毒核酸

  應用聚合酶鏈反應技術設計出豬水疱病特異性引子,可從豬水疱性疾病中鑑別豬水疱病。

◆樣品製備

  取新鮮水疱液,若無法取得水疱液則取病變部病材製成懸浮上清液。病變部病材需先用研缽磨碎後,加入 5~10 ml 含 1 % 小牛血清和抗生素之磷酸緩衝液做成 10 % 乳劑。乳劑經 500xg 4 ℃ 離心 5 分鐘後,取懸浮上清液備用。

◆RNA 採取

  取 100 ul 水疱液或病材懸浮上清液,加入 1 ml TRIZOL 試劑劇烈震盪 (vortex) 30 秒後靜置室溫 5 分鐘。加入 200 ul chloroform 以手劇烈震盪 15 秒後靜置室溫 3 分鐘。於 4 ℃ 12,000 xg 離心 15 分鐘。取上清液與等量 isopropyl alcohol 混合後靜置室溫 10 分鐘。於 4 ℃ 12,000 xg 離心 10 分鐘。去上清液加入 1 ml 75 % 乙醇經搖動後於 4 ℃ 7,500 xg 離心 5 分鐘後去上清液。純化後之 RNA 經乾燥後加入 30 ul DEPC 處理水置於 55 ℃ 溫度中 10 分鐘以溶解 RNA。

◆反轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)

  於 0.5 ml 微量管中加入 5 ul 之 10 倍 Dynazyme 緩衝液(含 500 mM KCl,100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2,0.1 % Triton X-100)、 0.02 mM鹼基 (dATP, dCTP, dGTP 及 dTTP 各為 0.5 mM)、16 單位 RNasin、2.4 單位 AMV 反轉錄酶、0.01 nanomole 正負鏈引子,2 單位 Dynazyme 聚合酶、5 ul 純化之 RNA 溶液及經 DEPC 處理過之二次蒸餾水,使每管反應溶液之總體積為 50 ul。(註:引子序列:primer P8 序列 5'-TGACTGAGGGTAGGACAGAT-3',primer P7 序列 5'-TGCAATCACACCTGGCAATGGT-3')。

  對照組包括一個陰性對照及一個陽性對照。陰性對照:不含病毒 RNA,以 5 ul 蒸餾水代替,其餘皆與試驗組相同。陽性對照:加入 5ul SVD 病毒純化之 RNA 溶液。

  反應液混合均勻後隨即放入熱循環器中,先以 42 ℃ 進行 40 分鐘反轉錄作用 (RT) 後直接進行 PCR 反應,PCR 反應條件為:

  95 ℃ 1 分鐘一次循環
  95 ℃ 15 秒及 60 ℃ 1 分鐘 35 次循環
  60 ℃ 6 分鐘一次循環
  最後保持在 4 ℃。

◆洋菜膠電泳

  以 1 倍 TAE 緩衝溶液配製成 2 % Agarose,並加入 Ethidium bromide 使終濃度為 0.5 ug / ml。

  核酸樣品取 10 ul 預先與 6X loading buffer 混合均勻,注入齒槽洞中,以 100 伏特電壓泳動 20 分鐘。

  電泳完畢後,置於 UV 透視燈下觀察,陽性樣品及陽性對照會出現一條長度 216 bp 之 RT-PCR 產物,陰性樣品及陰性對照則無產物出現。

血清學試驗

SVD 常單由血清學試驗的證據來作為診斷,因本病有臨床不顯性或症狀輕微的特性,所以常由出口證明上例行性之血清學檢驗來找出本病。病毒中和試驗 (VN)、雙重免疫擴散試驗、免疫擴散試驗、免疫電泳試驗和酵素結合免疫試驗 (ELISA) 已被用來檢測 SVD 的抗體。VN 和 ELISA 最常被使用。VN 是可接受的標準試驗,較不利的條件是需要組織培養設備和花費 2 至 3 天才能完成。ELISA 則較迅速,更容易標準化,但可能因某些豬體內抗體的存在而出現偽陽性,目前知道有Coxackie B5 型病毒會影響結果。常會出現一群豬中只有一隻豬出現血清陽性,此現象與一般熟知的流行病學不一致,因為只有一隻動物被感染,這種由 ELISA 檢測出來的單一反應個體可被忽略,但血清必須用 VN 再測一次。許多不同的 ELISA 標準方法已被發展,但 ELISA 使用單源抗體在測試血清的競爭性試驗出現最少偽陽性。

病毒中和試驗(國際級規定試驗)

SVD 之病毒量化中和微量試驗是使用 IB-RS-2 細胞(或具感受性之合適豬細胞)在組織培養級平底微量盤中操作。

生長在 IB-RS-2 單層細胞的病毒加入 50 % 甘油後可儲存在 -20 ℃,SVD 病毒在此狀況下至少可穩定存放 1 年。試驗前要將血清以 56 ℃ 非動化 30 分鐘(若用於 ELISA 試驗,血清不可非動化,否則會提高非特異性反應)。陽性對照標準血清是復原期第 21 天的豬血清。Eagle's 完全培養基或 LYH 加抗生素是最適合的培養基。

本試驗是採體積 50 ul 之等體積試驗。

從 1 / 4 開始稀釋,血清沿稀釋盤作 2 倍連續稀釋,每個血清兩行。加入已定好力價之病毒液,50 ul 單位體積含有 100 TCID50 病毒懸浮液。對照組包括一個已知力價的標準抗血清,一個細胞對照,一個培養基對照和本試驗中用來計算實際病毒力價的病毒力價測試。蓋上盤蓋後置於 37 ℃ 感作 1 至 2 小時。含 10 % 牛血清的生長培養基,調製成每 ml 含 106個細胞,每孔加入50 ul 細胞懸浮液。

培養盤用伸縮帶封住,保溫於 37 ℃ 2 至 3 天。亦可蓋上適當蓋子,置於 1 大氣壓含 5 % 二氧化碳環境下保溫 2 至 3 天。

48 小時後使用顯微鏡更容易判讀,培養盤一般在第三天固定並染色,固定是用 10 % formalin 作用 30 分鐘,再浸入含 0.05 % 甲基藍之 10 % formalin 中染色 30 分鐘,培養盤並以自來水洗滌。

細胞層被染成藍色是陽性,陰性則是孔內空白。血清抗體力價是以血清 / 病毒混合物中之血清 50 % 最終稀釋濃度 (50 % end point) 表示,這是當每孔實際使用的病毒量介於 101.5 到 102.5 TCID50 時,且陽性標準血清在預期力價的 2 倍內才適用。

結果解說:病毒中和力價大於或等於 64 倍為陽性,介於 16 倍及 32倍之間為疑陽性,這是 OIE / FAO 世界參考實驗室對 FMD 的試驗標準(參考 footnote 1)。無論如何,既然力價測定是藉由細胞培養系統,每個實驗室應參考標準試劑,建立自已的診斷標準。疑陽性和個別陽性血清,如果可能,則應使用 VN 法重測,如果這些血清用 ELISA 測試結果不是陰性,則應採更多血清來檢測。

酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA)

本試驗 ELISA 法是由 Brocchi 等所發展出來,先使用 Mab 5B7 單源抗體將 SVD 抗原捕捉到基底層,由測試血清對結合過氧化氫酶之 Mab 5B7 單源抗體的抑制能力來評估,最後藉由加入受質來檢測含過氧化氫酶單源抗體的結合量。

將 Mab 5B7 在 carbonate / bicarbonate buffer 中稀釋成 10ug / ml pH9.0,ELISA 盤每孔加入 50ul 進行被覆 (coated) 置於 4 ℃ 過夜。

用含 0.05 % Tween 20 之 PBS 洗滌盤子三次,將已測定過最佳稀釋倍數之 SVD 抗原(SVD 病毒生長在 IB-RS-2 細胞、純化、過濾並不活化)每孔加入 50 ul。抗原最佳稀釋倍數是以西洋棋盤式力價測定,由抗原和標示抗體在吸光值 2 所定義出來,最後將盤子置於 37 ℃ 作用 1 小時。

經三次洗滌後,50 ul 之稀釋測試血清(未被非動化)和對照血清與捕捉抗原一起在 37 ℃ 感作 1 小時,血清三倍連續稀釋是由 ELISA 孔中將 10 ul 血清與 65 ul 緩衝液(1 / 7.5 倍稀釋)混合,再取出 25 ul 到含 50 ul 緩衝液之連續孔中獲得。

經感作後每孔加入 25 ul 結合過氧化氫酶之單源抗體 Mab 5B7,再將盤子置於 37 ℃ 感作 1 小時。

經最後連續洗滌,藉由每孔加入 50 ul 受質(0.5 mg / ml orthophenylene-diamine〔OPD 緩衝液〕溶於含 0.02 % H2O2 之 phosphate-citrate buffer 來完成呈色反應。

10 分鐘後加入 50 ul 2N 之硫酸液來中止反應,使用微量盤計讀儀以吸光值 492 nm 來計讀。

抗原、血清和標示抗體要在含有 0.05 % Tween 20 與 1 % 酵母抽出液之 PBS,pH 值 7.4 中稀釋,不論是被覆盤底或加標示抗體所用的血清稀釋緩衝液都要加 0.05 % 小白鼠血清以阻止豬血清非特異性結合上 5B7 單源抗體。

對照:除被測血清外,每一測定盤中四孔分別加入待測物質,包括抗原,恢復期豬血清,陰性及弱陽性血清,並分別檢測其吸光值。

結果解說:反應結果則視 MAb 與 SVD 抗原反應時被每一個測試血清抑制之百分比來決定,如果在 1 / 7.5 倍血清稀釋下,抑制值超過 80 % 的血清即為陽性,所有疑陽性或陽性結果需以病毒中和試驗重測。

二、疫苗和診斷生物學要求

目前尚無 SVD 疫苗可用,標準血清可從 OIE / FAO 世界參考實驗室 之 FMD 實驗室取得,5B7 單源抗體可從位於義大利 OIE 之 SVD 參考實驗室取得。

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