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非洲豬瘟
African swine fever
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非 洲 豬 瘟 ( African Swine Fever, ASF )

       非洲豬瘟是豬的一種病毒性疾病,臨床上有急性至慢性不等病徵。急性非洲豬瘟,以發高熱、網狀內皮系統出血病變和死亡率高為主徵。病毒於鮮肉和醃乾肉製品內可存活數月之久。

       非洲豬瘟病毒,係非洲豬瘟類病毒科(Family of ASF-like viruses)內唯一的一種病毒。

       實驗診斷分為兩種,第一種包括病毒的分離、病毒抗原的測定和去氧核醣核酸基因的檢測;第二種則為抗體的測定。至於採用何種方法作為檢驗標準,得依非洲豬瘟發生情況而定。

       非疫區之非洲豬瘟可疑病例之實驗室診斷,可將病材乳劑接種於試驗豬隻或健康豬白血球或骨髓細胞培養,作病毒分離。或者將送檢和採集臟器做抹片或冷凍切片的螢光標示抗體染色,檢測組織內之病毒抗原。或者以聚合酶鏈反應檢測病毒去氧核醣核酸基因。同時亦可利用間接螢光抗體染色試驗檢測血清或組織液內的抗體。病原的鑑定,可將田間送檢可疑病例之臟器和試驗接種豬之臟器做抹片或冷凍切片的螢光標示抗體染色,以檢測非洲豬瘟病毒抗原。健康豬初代白血球培養,經接種病材乳劑後每日觀察紅血球吸附現象和細胞病變作用產生情形,以偵測非洲豬瘟病毒。若無血球吸附現象和細胞病變作用產生時,需將接種細胞做螢光標示抗體染色,並盲目繼代接種於新健康豬白血球細胞培養。聚合酶鏈反應,係用以檢測組織內的病毒核酸。當送檢病材因腐敗而不適作病毒分離和抗原檢測時,本技術在診斷上更為有用。與豬瘟做區別診斷時,可將病材乳劑分別接種於豬瘟免疫和未免疫兩組豬隻。接種後,每日量取和記錄肛溫,並採血做白血球細胞培養,觀察紅血球吸附現象。當試驗接種豬肛溫超過 40 ℃ 時,應予犧牲並採臟器進行檢驗。血清學的檢驗在非洲豬瘟疫區或由弱毒株首度引發非洲豬瘟病例的地區,應以酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 來檢測血清或送檢臟器組織液內之特異抗體。

疫苗和生物診斷試劑,目前尚無非洲豬瘟疫苗問世。

A. 診斷技術:

臨床診斷:非洲豬瘟病毒原本歸屬於虹彩病毒科 (Iridoviridae),但因其基因結構和病毒增殖方式與痘病毒科 (Poxviridae) 有諸多相似之處,因此 1984 年在日本仙臺舉行第六屆國際病毒命名委員會 (ICTV) 會議結果同意將非洲豬瘟病毒挪出虹彩病毒科,並重新歸屬於非洲豬瘟類病毒科,這也是本科目前唯一的一種病毒。非洲豬瘟,依病毒株毒力的不同產生的臨床症狀差異也大,從甚急性至慢性和不顯性帶毒感染都有可能發生。強毒株會造成甚急性或急性出血性疾病,以發高熱、無食慾、皮膚和內臟的出血病變,2 至 10 天內斃死為主徵,死亡率高達 100 %。較低毒力病毒株所引發之臨床症狀也較輕微,諸如輕微熱反應、食慾減退和精神不振等。這些輕微症狀,在臨床上與豬 隻其他疾病不易區別,因此常會對非洲豬瘟失去警覺性。至於無紅血球吸附性之弱毒株,雖然有時會於感染豬的肺臟和接觸骨頭部位皮膚產生特異病灶,但一般為不顯性感染,並無出血性病變產生,而血清抗體的陽轉往往是唯一的主徵。此時,抗體的檢測就成為一項最重要的診斷方法。非洲豬瘟和豬瘟在臨床和病理剖檢病變上極為相似,難以區別。兩者 都會產生急性出血性病變,有賴實驗室的區別診斷。非疫區懷疑有非洲豬瘟病例時,需以試驗豬隻、豬白血球或骨髓細胞培養來做病材乳劑的接種,直接分離病毒。並將送檢或試驗接種豬臟器做 抹片或冷凍切片的螢光標示抗體染色,以檢測病毒抗原。同時利用酵素結合免疫吸附試驗、免疫墨漬法或間接螢光抗體染色試驗檢測血清或組織液內的抗體,以免遺漏而延誤低毒力病毒株的確診。聚合酶鏈反應是近代新興的一種診斷技術,用以檢測感染豬血液和臟器內的病毒核酸。當送檢病材因腐敗而不適合做病毒分離和抗原檢測時尤 其有用。

  病原的鑑定,非洲豬瘟可疑病例,應以肝素或乙烯二胺四醋酸鹽 (EDTA) 抗凝劑採集血液,並將採集之脾臟、扁桃腺、腎臟和淋巴結等臟器一起於低溫冷藏情況下快速送抵診斷實驗室。輸送途中不宜冷凍。

◇病材乳劑的製備:將病材剪切成小塊放置乳缽內,加入滅菌細沙或玻璃粉後以乳棒磨碎,再 加入 5~10 ml 含抗生素之鹽類緩衝液或細胞培養液。經 1,000 g,離心 5 分鐘。取出上清液供血球吸附試驗和試驗豬接種用。

  血球吸附試驗 (Haemadsorption test): 由於大多數的非洲豬瘟分離毒株,經感染豬單核球或巨噬細胞後,其細胞表 面具有特殊的豬紅血球吸附現象,因此血球吸附試驗可供非洲豬瘟的確診。 唯需注意,有少數非洲豬瘟分離毒株並無血球吸附特性。這些無血球吸附特 性的病毒株,一般雖不具毒力,但偶爾也會引起典型的急性非洲豬瘟病例。 血球吸附試驗,係將可疑患畜血液或臟器乳劑上清液接種於健康豬初代白血 球細胞培養(方法 1);或者將田間可疑患畜血液或試驗接種豬血液直接做成白 血球細胞培養(方法 2)。於試管內,每 100 ml 之脫纖血或肝素抗凝血可作成 30 支白血球細胞培養。操作過程中應避免雜菌污染。

方法 1. 豬初代白血球細胞培養之血球吸附試驗 (Haemadsorption test in primary leukocyte cultures)

依實際需用量,以肝素抗凝劑(每 ml 血液 100 國際單位)採集健康豬隻血液700 g,離心 30 分鐘。取出白血球層細胞,並以細胞培養液清洗。再離心後之沉澱細胞,以含 10~30 % 豬血清和抗生素之細胞培養液沖散並做成每 ml 含 107 個細胞濃度的細胞懸浮液。同時為防止非特異性血球 吸附作用,細胞培養液內所加血清需為供應白血球細胞培養之同一頭豬的血清或血漿。在每支 160×16 mm 試管內,分別注入 1.5 ml 白血球細胞懸浮液。然後,傾斜放置 37 ℃ 培養(斜面為 5~10 度)。 註:例行診斷宜採用培養 2~4 天的白血球細胞,較為敏感。

將每一病材乳劑之上清液分別接種於 3 支白血球細胞培養試管內,每管接種 0.2 ml。同時為防止田間送檢病材因保存狀況不佳帶來負面影響,最好也將 10 倍和 100 倍稀釋後上清液接種於白血球細胞培養。

另外接種有血球吸附性之非洲豬瘟病毒,作為陽性對照;並保留未接種白血球細胞培養,當陰性對照,觀察有無非特異性血球吸附現象。

接種後第 3 天,於每支試管內分別加入 0.2 ml 以鹽類緩衝液新鮮配製之 1 % 豬紅血球細胞懸浮液。在顯微鏡下每日觀察細胞病變作用和血球吸附現象,並以第 7~10 天為最 終判讀時間。

判讀:有血球吸附現象產生時,在感染細胞表面可見諸多紅血球的附著。如果僅見細胞病變作用,試管底部附著細胞數顯著減少而無血球吸附現象時,可能係因接種液之細胞毒性作用、假性狂犬病病毒或無血球吸附性之非洲豬瘟病毒等因素所引起。需將培養細胞離心後做螢光標示抗體染色,或實施聚合酶鏈反應(參閱下述)予以區別診斷。 若接種細胞正常無任何變化,或經螢光標示抗體染色和聚合酶鏈反 應後均呈陰性,則需將接種細胞上清液再行繼代接種於新白血球細胞培養。

方法 2. 感染豬白血球自體玫瑰花瓣狀血球吸附試驗(Haemadsorption autorosette test)

自體玫瑰花瓣狀血球吸附試驗,在操作和判定上要比上述方法 1. 更為 簡單、快速。只要有玻片、蓋玻片、顯微鏡、無菌培養液、試管或瓶子以及 滴管等即可進行檢驗。以注射針筒先抽取肝素溶液後再採集田間可疑罹患豬 血液或試驗接種豬血液,並做成白血球細胞培養,即可直接觀察血球吸附現象。

以注射針筒抽取 2 ml 生理鹽水配製之 2,000 國際單位之肝素溶液後,採集 20 ml 血液。混合後,放入玻璃試管或窄瓶內。將試管或窄瓶垂直放置在 37 ℃ 恒溫箱或水浴槽,使血球細胞自行沉降。或者在抗凝血液內加入 2 ml 血漿容積擴張劑,例如 Dextran 150 溶液,以加速血球的沉降。Dextran 150 溶液,係一種溶解於 0.9 % 生理食鹽水的 Dextran 150 注射液 (Hisons,UK 廠牌)。

經 37 ℃ 放置培養 6~8 小時後,每隔 2~3 小時抽取出少量富含白血球並混些紅血球層之懸浮液,放置玻片上。於顯微鏡下觀察血球吸附現象。

以螢光抗體染色試驗檢測,病毒抗原螢光抗體染色試驗,除可檢測田間可疑罹患豬或試驗接種豬組織臟器內的病毒抗原外,亦可檢測感染白血球細胞培養內無血球吸附性之非洲豬瘟病毒抗原。此外也能鑑別白血球細胞培養細胞病變作用的原因,例如係來自非洲豬瘟病毒、假性狂犬病病毒或接種液本身之細胞毒性作用。

◇試驗步驟:將送檢或試驗接種豬隻臟器作冷凍切片或抹片,或者將接種乳劑之白血球細胞培養離心後做成細胞抹片。風乾後以丙酮於室溫固定 10 分鐘。

滴上適當稀釋之非洲豬瘟螢光標示抗體,於 37 ℃ 保濕盒內進行螢光標 示抗體染色 1 小時。同時將陽性、陰性臟器和白血球細胞作冷凍切片和抹片之螢光標示抗體染色,供對照參考用。

經磷酸緩衝溶液清洗過後滴一滴磷酸緩衝溶液 / 甘油混合液並蓋上蓋玻片。然後於螢光顯微鏡下鏡檢。

判讀:細胞質內呈現顆粒狀特異性螢光者判為陽性。

以聚合酶鏈反應檢測病毒核酸

從非洲豬瘟病毒基因之高度保存區 (Highly conserved region) 尋出配對引子實施聚合酶鏈反應結果,可以檢測各種不同的非洲豬瘟分離毒株,包括無血球吸附性毒株和弱毒株。當送檢病材因採材時或輸送途中發生腐敗,病毒業遭不活化而無法供病毒分離和抗原檢測時,以聚合酶鏈反應技術檢測非洲豬瘟病毒之去氧核醣核酸更能發揮其診斷效果。

◇病材製備

剪取小塊臟器放置乳缽內,加入滅菌細沙並以乳棒磨碎後加入 5~10 ml 含 1 % 公牛血清和抗生素之磷酸緩衝溶液作成 10 % 乳劑。500 g,離心 5 分鐘。

吸取 500 ul 上清液,放入有螺旋蓋 Eppendorf 試管內並煮沸 10 分鐘。在桌上小型離心機,13,000 g,離心 5 分鐘。取出上清液後即可供聚合酶鏈反應用。

◇藥品試劑 (Stock solutions)

市售 Taq DNA 聚合和 10 X 聚合鏈反應緩衝液。

1.25 mM dNTP 混合溶液:在 360 ul 無菌蒸餾水中,各別加入 10 ul 濃 度為 50 mM 的 dATP,dCTP,dGTP 和 dTTP。

引子溶液濃度 50 pmol / ul:引子 1,序列為 5'-ATGGA TACCG AGGGA ATAGC-3'(正鏈);引子 2,序列為 5'-CTTAC CGATG AAAAT GATAC-3' (負鏈)。

載入緩衝液 (loading buffer):為含 0.25 % Orange G 之 30 % 甘油溶液。

50 X TAE 緩衝液:供洋菜膠片配製用。配方,Tris base(242 g); Glacial acetic acid(57.1 ml);PH 8.0,0.5 M EDTA(100 ml)。加蒸餾水至 1 公升。

標記 DNA (Marker DNA):市售不同分子量的 DNA 標記溶液,為 100 bp Ladder 標記 DNA。

◇試驗步驟:

依需用試管數,於每支 0.75 ml 之 Eppendorf 試管內,分別加入下列試 劑:滅菌蒸餾水 24.5 ul,10 X 聚合酶鏈反應緩衝液 5 ul,1.25 mM dNTP 混合液 8 ul,引子 1 溶液 1 ul,引子 2 溶液 1 ul,組織上清液 10 ul 和 Taq DNA 聚合 0.5 ul 等。不加組織上清液之對照用試管:陰性對照(無 DNA),以 10 ul 蒸溜水取 代組織上清液;陽性對照,則以 2 ul 非洲豬瘟病毒 DNA 和 8 ul 蒸溜 水取代組織上清液。

於每支試管混合液之上端加入 60 ul 礦物油。 將全部試管放入 DNA 自動控溫循環機,並依序進行下述反應作用。94 ℃ 5 分鐘,50 ℃ 2 分鐘和 72 ℃ 3 分鐘,單一循環;94 ℃ 1 分鐘, 50 ℃ 2分鐘和 72 ℃ 3 分鐘,三十次循環;最後為 94 ℃ 1 分鐘,50 ℃ 2 分鐘和 72 ℃ 10 分鐘,單一循環。然後保持在 4 ℃。

反應結束後,從每支試管礦物油下層小心抽取 20 ul 反應液,放置在另 一新試管內並加入 2 ul 載入緩衝液。混合後,逐一載入以每 ml 含 0.5 ug 溴化乙基啶 TAE 緩衝液配製之 2 % 洋菜膠片孔洞內。每一膠片留一孔,載入標記 DNA 溶液。150 伏特定電壓,電泳 2 小時。

判讀:將電泳後洋菜膠片放在紫外燈光源上方觀察結果。陽性病材之聚合鏈反應產物與陽性對照一樣會在同一位置呈現一特異線條 (Band)。 比照標準標記 DNA 推算出陽性 PCR 產物大小,長度為 278 個 bp (Base pairs)。而陰性對照和陰性病材則無此產物。

豬隻接種試驗: 非洲豬瘟和豬瘟,臨床上無法區別,但可將病材乳劑接種於豬瘟免疫和 未免疫兩組試驗豬隻來做區別診斷。非疫區首次發生非洲豬瘟病例時一般都 利用豬隻接種試驗來作確診。

◇試驗步驟

將病材乳劑上清液混合後接種於四隻試驗豬隻,其中兩隻為豬瘟疫苗免疫 豬,而另外兩隻則未免疫豬,每一豬隻肌肉接種 2 ml 混合液或全血。

接種後每日觀察接種試驗豬隻之臨床症狀並量肛溫,至接種後第 21 天 為止。觀察期間,每日採血作自體玫瑰花瓣狀血球吸附試驗,並將採集 血液接種於健康豬初代白血球細胞培養以觀察血球吸附現象。若是非洲豬瘟,兩組試驗豬隻接種後幾乎同時發病。有熱反應(≧40 ℃) 或有明顯症狀豬隻其體內各臟器均有高力價病毒的存在。試驗接種豬發病時,或在接種後第 21 天試驗結束時,至少犧牲一隻試 驗接種豬並採集臟器做冷凍切片螢光標示抗體染色以檢測病毒抗原,同時將臟器乳劑接種於豬白血球細胞培養以分離病毒(參上述章節),並採 血檢測血清內抗體。

若豬瘟免疫組豬隻正常而未免疫組豬隻發病時,則需做豬瘟的診斷。

結果若為疑陽性,應再重覆繼代接種。血清學的檢驗 非洲豬瘟感染耐過豬其體內之抗體可存在一段很長時間甚或終生。雖 然有許多方法都可用以檢測非洲豬瘟抗體,但實驗室內一般僅採用數種例 行方法來檢測抗體。 最常見者為酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA),用以檢測血清和組織液內 的抗體,唯必要時亦可利用其他方法例如間接螢光抗體染色試驗或免疫墨 漬法來佐証 ELISA 個體陽性血清或組織液樣品。非洲豬瘟感染耐過豬並 無中和抗體的產生。 非洲豬瘟疫區可疑病例最好採用酵素結合免疫吸附試驗、間接螢光抗 體染色試驗和冷凍切片螢光標示抗體染色試驗三者相互配合來做確診。有 些國家,95 % 以上的陽性病例就是靠間接螢光抗體染色試驗抗體的測定和 直接螢光標示抗體染色試驗抗原的檢測兩者確診出來。需注意的是,感染無毒力或弱毒株的豬隻,血清學的檢測往往是唯一 的確診方法。雖然酵素結合免疫吸附試驗較為敏感而且已經成為非洲豬瘟撲滅計劃 一項重要的抗體測定工具,但相對免疫電泳法和酵素結合免疫吸附試驗一樣,兩者均可供大規模血清抗體篩檢用。至於採用何種抗體檢驗方法得依實驗室內專業人員和現有儀器設備而 定。

酵素結合免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA) 酵素結合 免疫吸附試驗,可以直接檢測非洲豬瘟感染豬體內的抗體,目前已成國際貿 易上一項標準抗體檢測方法。

◇抗原的製備

酵素結合免疫吸附試驗用抗原,係以含豬血清細胞培養液增殖之感染 細胞製造而成。

猴源細胞株 (Monkey stable cells;MS cells) 經接種馴化病毒 (10 MOI) 後, 以含 2 % 豬血清的細胞培養液培養增殖。

細胞經感染 36~48 小時有大量細胞病變作用產生時,將感染細胞收集起 來。以磷酸緩衝溶液沖洗過後,650 g,離心 5 分鐘。沉澱細胞再以含 0.34 M 蔗糖之pH 8.0,5 mM Tris-HCL 溶液清洗一次。離心,沉澱感染細胞。 以下步驟請在冰浴中操作。沉澱之感染細胞,以含 67 mM 蔗糖之 pH 8.0,5 mM Tris-HCL 溶液沖散後靜置 10 分鐘。加入 Nonidet P-40 非離子清潔劑最終濃度為 1 % (w / v)。靜置 10 分鐘, 以溶解細胞。

加入蔗糖至最終濃度為 10 % (w / v) 後,1,000 g ,離心 10 分鐘,以沉澱 核酸。取出上清液,分別加入 EDTA,β-mercaptoethanol 和 NaCL(最終濃度 分別為 2 mM ,50 mM 和 0.5 M)後於 25 ℃ 作用 15 分鐘。將含 20 % 蔗糖 (w / w) 之 pH 8.0,50 mM Tris-HCl 溶液先行加入離心管內,然後沿管壁慢慢加入上述混合溶液。4 ℃,100,000 g 離心一小 時。離心後即刻取出蔗糖溶液上一層抗原液,放置 -20 ℃ 冰櫃,即 可供酵素結合免疫吸附試驗抗原用。

◇試驗步驟

抗原先以 pH 9.6,0.05 M 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液適當稀釋後,於 ELISA 專用 96 孔微量盤每孔加入 100 ul ,將抗原覆蓋 (Coat) 於孔底。4 ℃,感作 16 小時(過夜)後,以 pH 7.2,磷酸緩衝溶液清洗五次。將欲測血清以及陽性和陰性對照血清以含 0.05 % Tween 20 之磷酸緩衝 溶液稀釋 30 倍。然後於 ELISA 抗原盤每孔加入 100 ul 的稀釋血清, 每一稀釋血清兩孔。若將陽性和陰性對照血清分別加入 ELISA 抗原盤 四處不同部位,每處各兩孔,則每盤可檢測 40 個血清樣品,每樣品兩 孔。

將盤子放置 37 ℃ 搖擺器上感作一小時。然後,以磷酸緩衝溶液清洗五 次。蔊菜過氧化酶標幟蛋白 A 經含 0.05 % Tween 20 之磷酸緩衝溶液適當稀釋後於每孔分別加入 100 ul。

將盤子放置 37 ℃ 搖擺器上感作一小時。然後,以磷酸緩衝溶液清洗五 次。在 25 ml 受質溶液(含 0.04 % OPD 之磷酸-枸椽酸鹽緩衝液)內加入 10 ul 雙氧水後,每孔加入 100 ul 受質溶液。

放置室溫約作用 10 分鐘。所需呈色時間依當時加入之受質溶液溫度和室溫高低而定。每孔加入 100 ul 之 1 M 硫酸液,以停止反應作用。

判讀:陽性血清,呈黃顏色反應,可用肉眼直接判定。但為求判定標準 的一致性,需藉 ELISA 光度比色判讀機以波長 492 nm 測定每孔吸光值。同一盤內,任何血清的吸光值只要超過陰性對照血清平均吸光值的兩倍以上即判為陽性。

間接螢光抗體試驗 (Indirect fluorescent antibody test)

非疫區 ELISA 判定為陽性之個體血清以及疫區 ELISA 無法判定之血清,需以間接螢光抗體試驗再予確認。

◇試驗步驟

將感染非洲豬瘟病毒之豬腎或猴源細胞株作成每 ml 含 5×105 個細胞 懸浮液。然後在每一玻片上滴一小滴,塗抹開後風乾。再以丙酮於室溫中固定 10 分鐘。感染細胞抹片可存放在 -20 ℃ 冰櫃,以便隨時取用。

欲測血清經 56 ℃ 處理 30 分鐘。欲測血清、陽性和陰性對照血清先以食鹽緩衝液適當稀釋後分別滴於非洲豬瘟病毒感染細胞抹片和未感染對照細胞抹片。放置 37 ℃ 潮濕箱盒內感作一小時。抹片經磷酸緩衝溶液清洗過後再以蒸溜水清洗一次。

在每一抹片上滴上適當稀釋之抗豬免疫球蛋白螢光標示抗體,或異硫氰酸螢光素標幟蛋白 A 液體。放置 37 ℃ 潮濕箱盒內感作一小時。

抹片經磷酸緩衝溶液清洗過後再以蒸溜水清洗一次。然後滴上一滴磷酸 緩衝溶液 / 甘油混合液,蓋上蓋玻片後於螢光顯微鏡下鏡檢。

判讀:先觀察陽性和陰性對照血清,陽性對照血清只能於感染細胞抹片呈現特異性螢光,而其他均需為陰性。若欲測血清於感染細胞呈現特異 性螢光時則判為陽性。免疫墨漬試驗 (Immunoblotting test)

◇免疫墨漬試驗可用以取代間接螢光抗體試驗以確認疑陽性個體血清。抗原條帶膜的製備,免疫墨漬試驗用之細胞質內可溶性病毒蛋白的製備與 ELISA 抗原的製備同。

利用已知分子量蛋白液作標準對照,將製備抗原與標準分子量蛋白液分別 於 17 % Acrylamide / N,N'-diallytartardiamide (DATD) 膠體片上電泳。

電泳後,將膠體片與 14×14 平方公分大小的硝纖膜(Nitrocellulose membrane)一起放入含 20 % 甲醇之 PH 8.3,196 nM 甘胺酸,25 mM Tris-HCL 轉移溶液內(Transfer buffer)。以 5 mA / cm 定電流電泳,將膠體 片上的蛋白轉移至硝纖膜上。硝纖膜經乾燥後於蛋白面上作記。

從邊緣切取出一條帶狀膜並進行下述免疫墨漬試驗步驟。與標準分子量蛋 白比對,標出 23~35 KDa 分子量蛋白部位。然後橫切成寬 0.5 cm 條帶狀 並於蛋白面上作記,即成抗原條帶膜。這些抗原條帶膜(長約 4 公分)上的 抗原當進行免疫墨漬試驗時會與急性感染豬或耐過豬血清內的抗體相互作 用。有些非洲豬瘟感染豬其抗體會持續終生。

◇氯奈酚受質溶液的配製 (Preparation of chloranaphthol substrate solution) 受質溶液使用時才配製。

將 2 mg 之 4-氯 1-奈酚 (4-chloro-1-naphthol) 溶解於 2 ml 甲醇內。然後, 慢慢加入攪拌中之 10 ml PBS 溶液。

以 Whatman 1 號濾紙過濾,除去白色沉澱物。

在過濾液內加入 4 mµl 之 30 % 雙氧水。

◇試驗步驟

操作過程中,抗原條帶膜之病毒蛋白標示面需保持朝上。

將抗原條帶膜浸入阻滯緩衝液 (Blocking buffer;含 2 % 脫脂奶粉之 PBS 溶液 ) 內。於 37 ℃ 不停搖動,作用 30 分鐘。

將欲測血清以及陽性和陰性對照血清以阻滯緩衝液作 40 倍稀釋。

將抗原條帶膜浸入欲測血清稀釋液內,於 37 ℃ 不停搖動,作用 45 分 鐘。同樣將兩條抗原條帶膜分別浸入陽性和陰性血清稀釋液內,以供對 照用。作用時間結束後將抗原條帶膜以阻滯緩衝液清洗四次,最後一次則將抗原條帶膜浸泡於阻滯緩衝液內並不停地搖動 5 分鐘。

山洋葵過氧酵素標幟蛋白 A,經阻滯緩衝液適當稀釋後加入每一抗原條帶膜並於 37 ℃ 不停搖動,作用 45 分鐘。然後,以阻滯緩衝液清洗四次,最後一次則將抗原條帶膜浸泡於阻滯緩衝液內並不停地搖動 5 分 鐘。

配製受質溶液,加入每一抗原條帶膜後於室溫中不停地搖動作用 5~15 分 鐘。

當病毒蛋白條紋呈現清楚黑色時以蒸餾水停止其反應作用。

判讀:陽性欲測血清會與抗原條帶膜上一種以上的病毒蛋白作用,其作用模式及呈色強度和陽性對照血清同。

相對免疫電泳試驗 (Counter immunoelectrophoresis test;Immunoelectro- osmophoresis test) :免疫電泳試驗極為快速,只要 30 分鐘即可獲得結果。唯敏感度較低, 只適用於整群豬血清抗體的篩檢用。

◇試驗步驟

依實際需用量,將 2.5×10 cm 玻片放置平臺玻片架上。以含 0.1 % 疊氮鈉之    PH 8.6 Veronal acetate 緩衝液(離子強度為 0.025)配製 0.6 % Agarose,經加熱溶解後倒入每一玻片上。靜置、凝固。

在每一玻片膠體上,以鑿洞器挖取直徑 3 mm 洞距 10 mm 的四組孔洞。

利用毛細管抽取欲測血清以及陽性、陰性對照血清和陽性、陰性對照抗原等試劑分別注入膠體組洞內。

將玻片架放入電泳槽內,以 19 伏特 / 公分定電壓電泳 30 分鐘。

電泳後,將玻片放置間接光源上方觀察抗原、抗體組洞間有無特異沉降線產生。

將玻片浸泡於 2 % 氯化鈉溶液內一夜。然後以蒸溜水浸泡並每隔兩小時更換蒸溜水一次。經更換數次後予以乾燥。

乾燥玻片以染色液染色 5~10 分鐘。染色液的配製係將 12 % 醋酸,1.6 % 醋酸鈉溶液與等量甲醇混合後,再加入 0.007 % 甘油和 0.075 % Amido black 配製而成。染色後,將玻片浸泡於含 45 % 甲醇和 10 % 冰 醋酸之脫色溶液內進行脫色,並每隔 10 分鐘更換脫色溶液,如此重複 更換三次。

判讀:經染色和脫色後,在抗血清和抗原組洞間只要有沉降線出現者即 判定為陽性。 

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