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高病原性家禽流行性感冒
Highly pathogenic avian influenza
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高病原性家禽流行性感冒
( HIGHLY PATHOGENIC AVINA INFLUENZA;FOWL PLAGUE )

       高病原性家禽流行性感冒(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)係由正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)之 A 型流行性感冒病毒感染所引起, A 型流行性感冒病毒,是正黏液病毒中唯一感染鳥類之病毒,許多種鳥類對本病毒具感受性,所幸大多數的分離株對雞及火雞皆屬低病原者, A 型流行性感冒病毒間具有抗原性相關的核蛋白衣(nucleocapsid)及基質多胜肽(matrix polypeptides)並以病毒之紅血球凝集素(hemagglutinin, H)及神經胺酶(neuraminidase, N)抗原區分亞型。目前,一共有 15 個 H 亞型(H1-H15)及 9 個 N 亞型(N1-N9),造成雞及火雞急性臨床疾病之高病原性 A 型流行性感冒病毒僅與 H5、H7 亞型有關,不過大多從鳥類分離之 H5、H7 亞型病毒卻屬於低病原性。

依年齡禽別及環境因素之差異,高病原性毒株引起之臨床症狀也有極大差異,有些無任何明顯症狀即急速斃死、有些則會呈現特徵性呼吸症狀、過度流淚、鼻竇炎、頭部水腫、發紺下痢等變化。前述症狀並無特異性,因此本病之診斷需仰賴病毒之分離及對適當宿主病原性之鑑定來做最後確診。血清學方法可做為輔助診斷,但不適宜做為最後之鑑定。

1. 病原鑑定

鑑定用病材應包括腸內容(糞便)或泄殖腔棉拭及鼻咽棉拭。肺臟、氣囊、 腸管、脾、腦、肝及心臟等病材可單獨或混雜後處理之。活禽則應採取氣管、泄殖腔棉拭(前者較佳),幼禽則可採取新解糞便代替之。檢體可置於 pH 7.0~7.4 之含有抗生素之 PBS 中,抗生素種類可因地制宜,如 penicillin(2,000 Iu / ml),streptomycin(2 mg / ml),gentamycin(50 mg / ml)及 mycostatin(1,000 units / ml)等,可使用於組織及氣管棉拭;但若檢體是糞便及泄殖腔棉拭時,抗生素量則應提高五倍。抗生素加入後,PBS 之 pH 應再調至 7.0~7.4,糞便及組織乳劑為 10~20 %(W / V)在室溫中作用 1~2 小時後立即處理,亦可保存於 4 ℃ 冰箱數天。

A 型流行性感冒病毒最好的增殖方法是接種 SPF 雞胚胎蛋。組織或糞便乳劑經 1,000 g 離心後,採取其上清液接種於 9~11 日齡 SPF 雞胚胎至少 5 個。再置於 35 ℃ ~ 37 ℃ 孵卵箱孵化 4~7 天,然後再把所有的胚胎包括死亡及瀕死胚胎在內,置入 4 ℃ 冰箱中,其尿囊液需測定血球凝集(HA)活性。HA 之出現即表示可能有 A 型流行性感冒病毒或副黏液病毒之存在,如無 HA 現象,則應再繼代一次。

HA 陽性者,應採集其尿囊液及絨毛尿囊膜。絨毛尿囊膜予以磨碎或均質至糊狀,然後予以凍結、解凍三次,或以超音波細胞擊碎器充份擊碎後 1,000 g 離心 10 分鐘,其上清液即為可溶性抗原。尿囊液經超高速離心法或以酸沈渣沈澱法濃縮病毒,將 1.0 M HC1 加入尿囊液,一直到 pH 下降至 4.0 後,置入冰箱一小時後以 1,000 g 在 4 ℃ 離心十分鐘,倒棄上清液,其沈渣以 0.5 M glycine 調節 pH 至 9.0 之 1 % Sodium lauroyl sarcosinate 緩衝液溶解。此一濃縮物中即含有核蛋白衣及基質多胜肽。再以 0.1 % formalin 處理後做為抗原,此抗原與前述絨毛尿囊膜製成之可溶性抗原可作為膠內免疫擴散法之抗原與已知血清及已知之家禽流行性感冒抗原進行膠內免疫擴散法測定,如有一致性之沈降線出現,即可確認所分離之病毒為家禽流行性感冒病毒(AIV),接種胚胎收集之無菌尿囊液 HA 活性應係由 A 型流行性感冒病毒或副黏液病毒所產生(非無菌尿囊液之細菌可能會引起 HA 現象)。目前已確認鳥類副黏液病毒有 9 個亞型,由於全世界均廣泛使用新城雞病(鳥類副黏液病毒 type 1)活毒疫苗,最好要用其抗血清實施 HI 檢測法去評估它的存在。

進行膠內免疫擴散法測定時,在已知 AI 抗體旁應有一孔加新城雞病已知抗體,此抗體與欲測抗原不應有沈降線出現。

濃縮之尿囊液也可經負染色後在電子顯微鏡觀察病毒顆粒予以確認。確認為 AIV 後進行血清亞型之測定,WHO 委員會推薦對 A 型流行性感冒病毒抗原亞型鑑定方法為利用最不具非特異性動物(如山羊),直接針對 H 或 N 亞型抗原生產之高度特異性抗血清,對此病毒產生之多價抗血清亦可使用於亞型之鑑定,但此一方法對不熟悉 A 型流行性感冒病毒之實驗室而言並不恰當。如有需要可將病毒分離株送 OIE 指定實驗室 Central Veterinary Laboratory Weybridge, Surrey, UK 進行鑑定。

1981 年在首次鳥類流行性感冒國際會議上決定廢棄“雞瘟”一詞,同時以多種路徑感染 4~8 週齡雞隻(肌肉內、血管內或氣囊內)皆會造成 75 % 以上之死亡率,而冠之以“高病原性家禽流行性感冒”。

依據 OIE 之標準,高病原性家禽流行性感冒病毒,需符合下列條件:

1. 將分離株之尿囊液稀釋十倍,以靜脈接種 8 隻 4~8 週齡無 AI 抗體雞隻,每隻接種 0.2 ml,在觀察 10 天期間如有 6 隻以上死亡,即為強毒株。
2. 不屬於 H5 或 H7 亞型,但可殺死 1~5 隻接種雞之病毒,經再接種細胞培養產生 CPE 或在沒有添加胰蛋白酶(trypsin)下仍有斑灶形成(plaque)者,則可能是強毒株,反之,則非高病原性者。
3. 低病原性 H5 及 H7 病毒及其他亞型分離株,如果在細胞培養時不添加 trypsin 可產生 CPE,則該病毒血球凝集素(Hemagglutinin)切割位相關聯之胜肽氨基酸必須再經序列分析,如其序列與其他高病原病毒之序列相似,則應視同為高病原株。

在歐盟,1992 年亦有類似定義。採用靜脈內接種病原性指數(IVPI)做為病原性判定標準。亦即:當一 A 型流行性感冒病毒對 6 週齡雞之 IVPI > 1.2 或H5 或 H7 病毒之核苷酸定序中證實在血球凝集素切割位置上出現 3 個以上驗估氨基酸時,應為高病原病毒株。

IVPI 測定法

1. 以無菌生理食鹽水 10 倍稀釋含病毒尿囊液。
2. 10 隻 6 週齡 SPF 雞,每隻靜脈接種 0.1 ml。
3. 每 24 小時觀察一次,持續十天,並給予記分。正常:0 分;發病:1 分;嚴重發病:2 分;死亡:3 分。(發病程度之觀察判斷常會受主觀之影響,其判斷通則如下:若雞僅呈現下列一種症狀時應判讀為“發病”;出現一種以上症狀時則判讀為“嚴重發病”。HPAI 之症狀有呼吸症狀、沈鬱、下痢、肉垂發紺、頭或臉水腫、神經症狀,斃死者則登記為 3 分。)

指數係為每隻雞每天之平均分數。如指數=3 即為所有的雞在 24 小時內死亡;而指數 0 為在 10 天觀察期間無任何臨床症狀。

2. 血清學檢測

膠內免疫擴散法:

本法乃利用所有 AIV 的各血清亞型,皆具有相同的核蛋白衣(nucleocapsid)抗原及 matrix 抗原 (皆為 Influenga A vimg),來測定家禽(雞、鴨、鵝、火雞、鳥等)是否感染 AIV 而帶有抗體。

本法抗原的製備可使用任何一種亞型的 AIV 以尿囊腔接種 9~11 日齡雞胚胎於 37 ℃ 培養 3~5 天後採取感染的絨毛尿囊膜(CAM),以均質機研碎,用磷酸緩衝液製成五倍乳劑,急速凍結解凍三次(或以超音波擊碎機充分擊碎細胞)再經 1,000 g離心 10 分鐘,其上清液添加福馬林使其濃度達 0.1 %,即為本法之抗原,可分裝儲存於 -20 ℃ 冷凍櫃備用。

本法之進行,可加 1 % 之 agar 於 8 % 之食鹽溶液經高壓滅菌後,每一平皿(直徑 9 公分)倒入 15~20 ml,待完全凝固後,挖取中央一洞周圍六洞,每洞直徑 0.5 公分,周圍與中央洞距 0.5 公分,每洞滴入 50 ul 之抗原或血清,每個欲測血清旁至少有一個已知陽性之血清,與陽性血清形成連續一致之沉降線者,是為具有 AI 抗體。

血球凝集 (HA) 與血球凝集抑制 (HI) 試驗:

比照新城雞病之方式操作。唯有些雞以外的禽類血清對雞的紅血球有非特異性的凝集作用,此血清可先以雞紅血球吸附,亦即血清添加雞紅血球混合均勻置室溫一小時後 1000 g 離心 5 分鐘,取上清液為供試血清,也可以何種禽類血清,就用該種禽類紅血球進行 HA 或 HI 試驗即無問題。

血球凝集 (HA) 和血球凝集抑制 (HI) 試驗,現在多用微量法測定。通常使用雞的紅血球。血球凝集抑制試驗時,抗原用 4 個血球凝集單位。血球凝集抑制力價以出現完全抗制血球凝集的血清最高稀釋倍數的倒數為準。一般情況下,HI 力價≧20 才可認為陽性,HI < 5 為陰性,介於兩者之間為可疑。

血球凝集試驗(HA)

96 孔 U 型盤,每孔加 25 ul 生理鹽水(或 PBS,pH 7.2)。
第 1 孔加 25 ul 病毒液,以微量稀釋器作連續倍比稀釋,最後 1 孔 25 ul 丟棄。
每孔加 25 ul 生理鹽水(或 PBS)。
每孔加 0.5 % 雞紅血球懸浮液 50 ul,振盪均勻,室溫中放置 45~60 分鐘後,判讀病毒液血球凝集力價。

血球凝集抑制試驗(HI)

需當天測定病毒血球凝集力價。試驗多用 4 個血球凝集單位(4HAU)的病毒。如病毒血球凝集力價為 1:640,4 單位為 1:160,即使用時需將病毒稀釋到 1:160。

96 孔微量盤,以第 2 孔開始,各加 25 ul 生理鹽水(或 PBS)。
第 1、2 孔各加 25 ul 處理好的血清(1:5),以第 2 孔開始依次作倍比稀釋,最後丟棄 25 ul。

每孔加入 4 個血球凝集單位病毒各 25 ul,振盪均勻,感作 25 分鐘。

每孔加入 0.5 % 雞紅血球 50 ul,振盪均勻,靜置 60 分鐘。
對照:血清對照:25 ul 1:10 稀釋的血清加 25 ul 生理鹽水。病毒對照:4、2、1、1 / 2 個血球凝集單位的病毒各 25 ml,再加 25 ul 生理鹽水。紅血球對照:50 ul 生理鹽水。以上各對照均再加入 50 ul 的 0.5 % 雞紅血球。
結果判定:判讀時將微量盤斜立起,血球如淚滴狀流下者為完全 HI,記錄 HI 之血清力價,對照之血清及病毒力價要能符合。

神經氨酸酶(Neuraminidase)分析

家禽流行性感冒之 N 亞型須以 NI 法鑑定之,本法亦需有標準的的 N1~N9 抗血清才能進行,進行 NI 試驗前,需先測定病毒的 N 活性,以決定病毒進行 NI 時的稀釋倍數。本法因試劑及方法繁雜,故一般禽病診斷實驗室多不進行此試驗,而將病毒送往 AI 專門實驗室進行 N 亞型鑑定。

試劑

PBS
Substrate:12.5 mg / ml fetuin in 0.2 M phosphate buffer(pH 5.9)
Periodate reagent:0.2 M sodium periodate in 9 M phosphoric acid
Arsenite reagent:10 % sodium arsenite in 0.5M sodium sulfate
Thiobarbituric acid(TBA)reagent:0.6 % TBA in 0.5 M sodium sulfate
Warrenoff reagent:3 % Hcl in buthanol

實施方法

病毒液 2 倍連續稀釋於 PBS。
每一稀釋取 25 ul 至16×150 mm之玻璃管。
加 50 ul substrate 混合,然後置 37 ℃ 30 分鐘(或隔夜)。
加 50 ul periodate reagent,混合後,在室溫感作 20 分鐘(此時開始準備沸水)。
加 0.5 ml arsenite reagent,振盪至棕色消失為止。
加 1.25 ul TBA reagent,混合之。
置於沸水中煮 15 分鐘。
冰浴中冷卻,加 1.5 ml Warrenoff reagent 混合均勻至顏色出現。
1000 rpm 離心 10 分鐘取上層。
在 549 nm 波長光度機讀取吸光值,吸光值在 0.45~0.8 之間的病毒稀釋倍數為 NI 用病毒濃度。

神經氨酸酶抑制試驗(NI)

實施方法

血清(N1~N9)稀釋成 10-2
每一稀釋之標準血清取 25 ul 至 2 支試管。
加 25 ul 上述稀釋定量好之病毒,混合後,置室溫中 1 小時。
加 50 ul substrate,混合後,置 37 ℃ 30 分鐘(或隔夜)。
加 50 ul periodate reagent,混合均勻,置室溫中 20 分鐘(此時開始準備沸水)。
加 0.5 ml arsenite reagent,振盪至棕色消失。
加 1.25 ul TBA reagent,混合之。
置於沸水中煮 15 分鐘。
結果:呈粉紅色表示抗血清無抑制作用,無粉紅色表示血清有抑制作用,由結果來判定 N 亞型。

酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA 可用於家禽流行性感冒早期感染的快速檢測,本法敏感度高,不管是高病原性病毒株還是低病原性病毒株都可應用,但檢測之抗原同 AGP 法,沒有亞型特異性,只能証實有 A 型的 AIV 抗體存在。本法可以進行大批抗體檢測。有市售商品化之 AI ELISA 套組可使用但抗原包被後乾燥的 ELISA 盤,卻可能易有非特異性陽性反應出現,需注意。

抗原製造

包被抗原:取單一標準株或混合株病毒感染雞胚的尿囊液,30,000 rpm 離心 2 小時。沉澱物溶於 TNE 緩衝液(Tris 0.01 M、NaCl 0.1 M、EDTA 0.001 M,pH 7.4)。再通過 25~40 % 的蔗糖梯度離心 20,000 rpm 2 小時,收集病毒帶,TNE 緩衝液透析。
測 HA,包被抗原濃度為 100 HAU / well。血清 100 倍稀釋。

準備材料

Disruption buffer:0.05 M Tris-HCL(pH 7.8)
Triton X-100, 0.6 M KCL

PBST:0.05 % Tween 20 in PBS(pH 7.2)
BSA10:Bovine serum albumin fraction V 10 mg / ml in PBS
BSA5T:Bovine serum albumin 5 mg / ml in PBST
Conjugate:Goat anti-rabbit globulin cojugated to horseradish peroxidase
Substrate:10 ml citrate buffer(0.05 M, pH 4.0) 40 ml 1 % H2O2

50 ul ABTS(40 mM)
2,2-Azino-di-3ethyl-benzothiazoline-6-sulphuric acid

96 孔 ELISA 微量平底盤

操作方法

ELISA 用 96 孔盤每孔加抗原 50 ul 使抗原吸附於盤內(4 ℃ 隔夜或室溫 1 小時)。
吸取抗原,各孔加 BSA10 100 ml(室溫 1 小時)。
以 PBST 洗淨(3 次)。
被檢抗體(血清)稀釋(in BSA5T)每孔加 50 ul(室溫 1 小時)。
以 PBST 洗淨(4 次)。
每孔加 Conjugate 50 ul(室溫 1 小時)。
以 PBST 洗淨( 4 次)。
Substrate solution 加 100 ml,作用 15~30 分鐘後加 0.1 M HF
(pH 3.3)50 ul 使反應停止。以 OD405 nm 光度計測定吸光值。

參考文獻:

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