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新城病
Newcastle disease
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新城病 ( Newcastle disease;ND )

       新城病(Newcastle disease;ND)是由副粘液病毒科(paramyxoviridae)的rubulavirus 屬 ND 病毒所引起。禽類副粘液病毒(paramyxovirus; PMV)在血清學的分類可分為 PMV-1 至PMV-9 等 9 個血清型;ND 病毒為 PMV-1 型。本病自 1926 年首次發現以來,目前之發生已廣佈全球大部份國家,因此世界各地雞隻大都須進行本病疫苗的免疫。

ND 病毒株依其在雞感染的病原性和臨床症狀分為 5 個病原型

親內臟強毒型具有高病原性,常見以腸出血病變。
親神經強毒型呈現高度死亡率,通常有呼吸及神經症狀。
中間毒型呈現呼吸症狀,偶有神經症狀,但具低死亡率。
弱毒型或呼吸道型呈現輕微或無臨床症狀的呼吸道感染。
無症狀腸道型沒有臨床症狀的腸道感染型。

依據病原型不易清楚分類,即使感染無特殊病原(SPF)雞也會出現重疊的病狀。此外弱毒株感染也會因其他病原重覆感染或環境情況不良而加劇臨床症狀。

因在雞的 ND 感染發病臨床症狀變化大,感染不同宿主也有不同的反應,使得 ND 之臨床診斷上頗為困難,所以若單靠臨床症狀當無法得到正確可靠的 ND 診斷結果。但強毒型特徵性症狀及病變可提高確定本病的可能性。

A、病原鑑定

採 材

調查罹患雞群及高死亡率是否因 ND 引起,通常由新鮮死雞或瀕死雞之臟器分離病毒。病死雞採口、鼻拭子及肺、腎、腸(包括腸內容物)、脾、腦、肝及心臟組織。所採取之臟器組織可以分開或混合,但腸管通常一定要分開放置。

活雞採樣包括氣管及共泄腔拭子,共泄腔拭子一定要包含有糞便。小型脆弱的禽類可能受限於拭子太大而不容易採取,但可以收集排出之新鮮糞便。

若臟器採樣受限,則檢查共泄腔拭子(或糞便)及氣管拭子(或氣管組織)與具有臨床疾病的臟器組織是一樣重要的。採取的試材應放置在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)內,pH 7.0~7.4,含抗生素。所加抗生素可因地置宜,如添加 penicillin(2,000 Iu / ml);streptomycin(2 mg / ml);gentamicin(50 mg / ml)及 mycostatin(Amphotericin B)(1,000 Iu / ml)於組織及氣管拭子,但 5 倍以上濃度用於糞便及共泄腔拭子。添加抗生素後必須要調整 pH 值為 7.0~7.4。糞便及組織研製成 10~20 倍(w / v)乳劑。乳劑在室溫放置 1~2 小時後應馬上進行試驗,如存放 4 ℃ 不可超過 4 天。

病毒培養

糞便或組織乳劑經由 1,000 g 離心 10 分鐘,溫度不超過 25 ℃,所得上清液經 0.2 um 過濾膜濾過後之濾液接種 9 ~ 11 日齡 SPF 雞胚尿囊腔內,每個雞胚各接種 0.2 ml。

接種後在 35~37 ℃ 恒溫箱中靜置觀察 4~7 天。將死胚與未死亡胚置放 4 ℃ 降溫後抽取尿囊液,取少量尿囊液與 0.5 % 雞紅血球液混合以檢測血球凝集試驗(HA)活性之有無,如若呈陰性反應則應再盲目 1 次繼代。

病毒鑑定

即使在無菌操作接種的雞胚也可能有 A 型流行性感冒病毒而引起的 HA 活性或其他 8種副粘液病毒血清型所引起(非無菌的尿囊液則可能含有 HA 的細菌)ND 病毒可以使用特異 ND 抗血清測血球凝集抑制(HI)試驗來確認。通常雞的抗血清以任何一株ND 病毒製備都可使用。ND 病毒和 PMV-3 間產生 HI 交叉反應可能引起問題,以適當的抗原和抗血清對照來解決。

病原性指數

由於 ND 病毒有毒力強弱之不同及活毒疫苗廣泛地被用,所以由有出現臨床症狀的病雞所分離的 ND 病毒,必須再進一步的病原性鑑定。

病原性鑑定方法如下:

雞胚之平均死亡時間(Mean death time in eggs ; MDT)

  抽取新鮮 ND 感染的感染尿囊液 106~109 以滅菌生理鹽水中連續 10 倍稀釋成 106~109 取 0.1 ml,每一稀釋位數濃度分別接種 0.1 ml 至 5 個 9~10 日齡 SPF 雞胚,然後放置 37 ℃ 孵卵器中。

每一稀釋倍數接種後剩餘的病毒在 4 ℃,8 小時後再各接 5 個雞胚,同樣置 37 ℃中。每日 2 次照蛋檢查,連續 7 日,記錄雞胚死亡時間。造成接種雞胚全部死亡的高稀釋倍數即為最小致死劑量(the minimum lethal dose),MDT 即為小致死劑量殺死胚胎的平均時間。

MDT 採 ND 病毒分類為強毒株(MDT 小於 60 小時),中間毒株(MDT60~90 小時)及弱毒株(MDT 大於 90 小時)。

大腦內接種致病性指數(Intracerebral pathogenicity index; ICPI)

以無菌生理鹽水 10 倍稀釋新鮮 NDV 感染的尿囊液(HA 力價須高於 16 倍者),取該稀釋液 0.05 ml 分別腦內接種於 10 隻 1 日齡 SPF 小雞,在接種後每 24 小時觀察一次,連續觀察 8 日並記錄之。

正常雞之記錄值為 0,病雞為 1,死亡雞為 2,ICPI 即為全部 8 日內每日每隻雞的平均數值,所以最強毒的 ICPI 值幾近 2.0,而弱毒株的值則接近 0.0。

靜脈內接種致病性指數(Intravenous pathogenicityindex ; IVPI)

  以無菌生理鹽水 10 倍稀釋 HA 力價高於 16 倍之 ND 病毒接種後採收之新鮮尿囊液,取該稀釋液 0.1 ml 分別靜脈內接種 10 隻 6 週齡 SPF 雞,於接種後 10 日內每日觀察雞的死亡 (2.0) 和發病 (1.0) 情形,並計算其病原性平均數值,弱毒株和中毒株之 IVPI值為 0,而強毒株的 IVPI 值約為 3.0。

IVPI 測試方法可稍作改變的試驗方法為,將未稀釋的 ND 接種後採收尿囊液塗抹於2 隻 8 週齡雞的泄殖腔和結膜以取代靜脈內的接種,以區別親內臟型強毒株和親神經型 ND 強毒株病毒。

單源抗體

以小鼠 (Balb / C) 研製成的抗 ND 病毒單源抗體(Mabs)可藉由HI試驗方法快速鑑定不同型別的 ND 病毒,此項技術可去除多價(polyclonal)抗 ND 病毒血清之與其他 PMV的交叉反應。由於 Mabs 在HI 試驗時對不同 ND 病毒株具有特株性,因此若有多種Mabs,可基於它們各自是否和某種病毒發生反應的情形,做有意義的建立 ND 病毒的分類及鑑別,尤其可應用快速鑑別實否為強毒 ND 的爆發的流行病學鑑定。

B、血清學試驗:

ND 病毒可當作抗原來進行不同的血清學試驗,如 HI 中和試驗或 ELISA 來作診斷。目前,HI 試驗最常被廣泛使用。通常雞血清很少見有非特異陽性反應發生所以不需任何前處理,但其他種的家禽血清有時會有與雞紅血球發生凝集,所以須以雞紅血球先吸附去除其非特異性因子。HA 及 HI 試驗在不同實驗室的執行步驟不同。以下例子是使用 V 底微量塑膠盤進行試驗的步驟,試驗的最終體積為 0.075 ml。需要的試劑為 pH7.0~7.2 PBS(0.1 M),及取自至少 3 隻 SPF 雞混合的 RBC,混合等量的 1 % RBC溶液,混合等量的 Alsever's 溶液。(若無 SPF 雞,血液需來自無免疫雞及定期監測無ND 病毒抗體的雞)血球經 PBS 洗三次,然後懸浮成 1 % RBC 溶液。陽性和陰性對照血清至少各 1 支應在每次試驗時同時放入檢測。

血球凝集試驗和血球凝集抑制試驗

血球凝集試驗

分裝 0.025 ml PBS 至每一孔塑膠 V 形底微量孔盤。
放置 0.025 ml 病毒懸浮液(如感染的尿囊液)在第一孔。
病毒 0.025 ml 兩倍連續稀釋。
再加 0.025 ml PBS 至每一孔。
裝 0.025 ml 的 1 %(v / v)雞 RBC 溶液至每一孔。\R
輕輕振盪混合,靜置 40 分鐘,室溫(20 ℃)中(或 4 ℃ 60分鐘)直到 RBC 清楚地沉降至底部。

將盤子傾斜觀察 RBC 淚滴狀流下之有無以決定 HA。病毒力價之計算係以完全 HA(不會淚滴狀流下)的最高稀釋倍數稀釋之即成為 1 HA 單位 (HAU)。

血球凝集抑制試驗

分裝 0.025 ml PBS 至每一 V 形微量孔測定盤內。
放 0.025 ml 血清至測定盤的第一孔。
自第一孔起,取 0.025 ml 量連續稀釋。
加 4HAU 的病毒抗原 0.025 ml 至每孔及至少靜置於室溫中 30 分鐘。(如 4 ℃ 60 分鐘)
 加 0.025 ml 1 % 雞 RBC 至每孔,輕輕混合後靜置室溫中約 40 分鐘(4 ℃ 60 分鐘),因時對照之 RBC 應完全沉降至底部。
形成 4HAU 抗原完全抑制之最高血清稀釋倍數即為 HI 力價。
陰性對照血清的力價不應大於 1 / 4,陽性對照血清力價應和已知力價相同,否則應重做或修正之。

國際標準 ND 抗血清可自 WHO / FAO 取得冷凍乾燥的雞抗血清,使用於實驗室標準血清之用。血清學診斷的價值與感受雞免疫的狀況有關,HI 力價若為 1 / 16 或以上表示陽性。有些實驗室使用 8 單位抗原進行 HI 試驗,則陽性判定在 1 / 8 或以上。許多商品化的 ND ELISA Kits 也可使用,用於檢測 ND 病毒抗體之 ELISA Kits 之製作方法有直接法,三明治法及阻斷法或競爭法等。

參考文獻:

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