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假性狂犬病
Aujeszky,s disease
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假 性 狂 犬 病 ( Pseudorabies,PR)

       假性狂犬病(Aujeszky's disease,又稱為 Pseudorabies)係一由阿爾發泡疹病毒(alpha-herpesvirus)所引起的動物疾病。中樞神經系統及許多器官,如呼吸道等,皆是其感染目標。除了人類及無尾的高等猿猴類之外,幾乎所有的哺乳類均具有感受性,其中又以豬最重要,因為豬在感染復原後會成為潛伏性感染。污染場使用疫苗並摘除潛伏感染的豬隻,是控制本病的方法。

       本病的診斷方法除了病毒分離之外,尚可由動物的血清學檢測得知。

病原的確認:假性狂犬病的病毒分離,可以將病材乳劑(病材包括腦、扁桃腺、鼻 /喉括抹物等)接種於有感受性細胞株或初代及第二代的豬腎細胞,常用的細胞株包括PK-15 及 SK6 等。若有病毒增殖,則接種的細胞會出現細胞病變作用(cytopathic effect, CPE),同時再以免疫螢光法(immunofluorescence)、免疫過氧化脢染色法(immunoperoxidase)或特異抗血清中和反應加以區別及確認;聚合脢鏈反應(polymerase chain reaction)亦是一個可以確診的新方法。

血清學檢測:有關假性狂犬病的血清學檢測方法包括病毒中和試驗(virus neutralization)、膠乳凝集試驗(latex agglutination)或酵素結合免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);目前已有市售 ELISA 診斷試劑多種。

由於基因缺損疫苗(gene-deleted vaccine)的研發成功及使用,所以可以從抗體檢測的方式區別豬隻體內的抗體係自然感染或是疫苗免疫所產生。

不活化疫苗或是馴化活毒疫苗的使用,有助於清除本病。但科學的日新月異,利用遺傳工程重組基因的技術研發成功的基因缺損疫苗或自然缺損疫苗,這類的新疫苗亦稱為標記疫苗(marker vaccine),通常缺 gG、gE 或 gC 等病毒的特異醣蛋白。

診斷方法

假性狂犬病係一由泡疹病毒科(familyHerpesviridae)的阿爾發泡疹病毒(alpha-herpesvirus)所引起的動物疾病。豬、草食獸及肉食獸是主要的感染標的動物,但除了人類及大部分的靈長類動物之外,幾乎所有的哺乳類均具有感受性。

對於感染本病造成死亡或是發生臨床症狀的豬隻,病毒分離是確診的必要步驟;而其他的血清學檢測等方法,則有助於潛伏性感染的診斷,但豬以外的動物感染本病,極少有能存活至抗體產生。

一、病原的確認

病毒分離

潛伏感染的帶毒豬口喉腔液、流死產的胎兒及感染的動物臟器,都是分離病毒的對象;而腦、扁桃腺及肺臟是最容易分離到的病材。牛隻感染後常只見搔癢的症狀在這種情形時,則必須取疑患牛隻的脊髓以作為分離病毒之用。潛伏感染的帶毒豬隻,其三叉神經為最容易分離到病毒的器官。

病材先以生理食鹽水製備成乳劑,經低速離心(約 900 xg,十分鐘)後取上清液接種於細胞。有多種細胞株及初代細胞對假性狂犬病病毒均具有感受性,但最常為實驗室中使用的為 PK-15 豬腎細胞株(porcine kidney cell line),通常細胞培養液中會添加抗生素(200 IU / mL penecillin,100 ug / mL streptomycin, 100 ug / mL polymyxin 及 3 ug / mL fungizone)。

通常接種後約 24 至 72 小時之內會出現細胞病變作用(CPE)。感染的單層細胞一開始是出現細胞堆集,最後整個細胞層會全部脫落;有時亦可看見細胞融合(syncytia)的現象,但融合細胞的大小不一。若是沒有見到細胞病變,則需將病材盲目繼代。

除了細胞病變之外,需以免疫螢光法、免疫過氧化染色法或以特異的抗血清加以確認。另可以將病毒接種於已長成單層細胞的蓋玻片(cover-slip),再以 H & E 染色,則可以看見感染細胞的染色質偏移週邊(margination)的現象,還有泡疹病毒特異的嗜酸性核內包涵體(acidophilic intranuclear inclusions)。

在沒有細胞培養設備的實驗室,可以將可疑病材的上清液,以肌肉注射方式接種兔子若病材中含有假性狂犬病病毒,則在接種後的二至五日內,兔子會在接種部位搔癢不止。(病材上清液應稀釋,否則可能因病毒太強,而在未產生症狀之前,兔子即死亡)。若是分離到病毒當然是可以確認動物被感染;但若未分離到病毒亦不代表動物未被感染。

以聚合脢鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)確診

聚合脢鏈反應可以用於在感染動物的分泌物或器官檢體中,檢測得假性狂犬病病毒核酸。聚合脢鏈反應目前尚無法訂定一個放諸四海皆準的操作標準,但仍有部分通則可以供參。

聚合脢鏈反應是利用成對引子,將特定區段的病毒核酸進行選擇性的增幅。第一個步驟是將完整的病毒 DNA 抽取(如以蛋白脢消化,再用苯酚 / 氯仿萃取),再將其核酸變性使 DNA 打開成單股的模版(template),使之與引子接合,在熱循環反應及DNA 聚合脢的作用下,合成特異的互補核酸序列。以溫度控制的循環反應,不斷進行核酸變性→打開成單股→引子接合→合成互補核酸序列等反應,如此反覆進行,約可增殖病毒核酸 106 倍。因此,作為診斷用的引子必須要設計於變異少的區域,如負責合成病毒必要醣蛋白的 gB 及 gD 基因。亦有為了要增加其敏感性,於第一次聚合脢鏈反應所合成的產物核酸中,合成另一對引子,用以進行第二次聚合脢鏈反應(nested PCR)

聚合脢鏈反應增幅後的產物,可以用瓊膠電泳來檢測其產物大小是否為原先所預期的,亦可用互補的另一探針進行南方轉漬法(Southern blotting)加以驗證。


與傳統的方法比較之下,聚合脢鏈反應是較快速的,所有反應可以於一日內完成檢測。但也由於其敏感性高,所以對於病材及所使用的試劑是否遭受污染,或操作者的不當操作以致誤診為陽性的問題,必須特別慎重及防範。也因為如此,而且受限於並不是有的實驗室都具備進行聚合脢鏈反應所需的技術及設備,所以這一個方法未能作為常規診斷的方法之一。

二、血清學檢測

凡進行血清學檢測,都應於實驗中使用 OIE 認定的標準血清作為陽性對照。此一血清可以自 OIE 認定的標準診斷實驗室分讓。該標準血清可以用1.4 mL 的蒸餾水溶解使用,但為了世界貿易的安全及一致性,進行本試驗的敏感性至少要達到可以測此標準血清 1 / 2 力價量(即將標準血清以 2.8 mL蒸餾水稀釋使用)。

病毒中和試驗(virus neutralization, VN)是一特異性高且延用極久的標準方法。但為了提高其敏感性及處理大量的檢體,酵素結合免疫吸附法是另一廣為使用的方法。最近另有膠乳凝集試驗被建立及使用。

病毒中和試驗(Virus neutralization, VN)

病毒中和試驗可分為定性(qualitative)及定量(quantitative)兩部份。本試驗方法所需時間,視不同的實驗室操作方法及補體(complement)的存在與否而有不同。一般而言,病毒及血清混合感作的時間,可以是於攝氏三十七度一小時或是於攝氏四度二十四小時。若是沒有補體的存在,則於攝氏三十七度感作一小時便足夠,這也是最廣為使用的,因為所需的時間較短。但是置於攝氏四度感作二十四小時,其敏感性提高,可偵測到低於前感作法低十至十五倍的抗體。

血清中的補體可以藉由攝氏五十六度水浴加熱三十分鐘加以破壞。

細胞:凡具有感受性的細胞皆可用,常使用的細胞株包括 PK-15、SK6,亦可使用初代或第二代的細胞。

細胞培養基:因所使用的細胞不同,需要的細胞培養基亦有不同。以PK-15 而言,是用含 Eagle's 鹽基的最低必需培養液(minimum essential medium, MEM),加入百分之十的的胎牛血清及抗生素(100 IU / mL penicillin, 及 100 ug / mL streptomycin,或可以 50 ug / mL gentamycin 取代)。

細胞的儲備:細胞通常培養於七十五平方公分(75 cm2)的角瓶中,用胰蛋白脢(trypsin)每週消化一至二次。若是每週繼代一次,則將消代的細胞以一:五倍,置於五十公撮的培養液中培養;若是每週繼代二次,則將消代的細胞以一:三倍,置於三十公撮的培養液中培養。

消化繼代的方法是先將原培養角瓶中的培養基倒掉,再將細胞層先以五公撮的消化液(含百分之零點二五 EDTA 的胰蛋白脢 0.25 % EDTA-trypsin)潤濕後,倒掉上述消化液再加入少量新的消化液。將細胞角瓶置於攝氏三十七度感作五至十分鐘,一旦細胞層脫落且細胞完全分離,再將細胞重新懸浮於培養基中。若是將細胞以一:五倍繼代者,則將細胞置於二百五十公撮的培養液中,並分裝於五個七十五平方公分的培養角瓶中培養;若是將細胞以一:三倍繼代者,則將細胞置於九十公撮的培
養液中,並分裝於三個七十五平方公分的培養角瓶中培養。

病毒:本所使用的是本省所分離的 TNL 株假性狂犬病病毒,置於攝氏零下七十度保存備用。

標準病毒的製備:將長成完整細胞層的培養上清液倒掉,加入一公撮力價約 107 TCID50/ mL 假性狂犬病病毒(約百分之五十的細胞感染量 ),將角瓶置於攝氏三十七度感作一小時,加入三十公撮的培養液後置於三十七度培養。隨時觀察感染的細胞,通常於接種後十二小時便會出現細胞病變。當細胞病變達百分之七十五時(通常是接種後三十六至四十八小時),便將細胞收於攝氏零下二十度(或更低)的冰櫃中,以便使細胞破裂釋出病毒。

將角瓶解凍並劇烈振盪,以便將細胞震離培養瓶。收集培養液並以 5,000 xg 離心十五分鐘。離心後的上清液以小量(通常是 0.5 公撮)分裝,標 示病毒株及製備日期等資料後,置於攝氏零下七十度(或更低)冰櫃備用。

標準病毒的病毒力價測定:以十倍稀釋標準病毒後,接種於已長成細胞(如 PK-15)的九十六孔微量培養皿中,每一稀釋倍數至少接種四孔,連續觀察三天並紀錄細胞病變出現的情形。以 Reed & Muench 的公式或是 Karber 的公式,計算病毒的力價;通常換算成每公撮(TCID50 / mL)或每五十亳撮(TCID50 / 50 ul)所含感染病毒量表示之。

病毒中和試驗需要對照血清,其中陽性對照血清需已知其抗體力價,而陰性對照血清是從無特定病原(specific pathogen free, SPF)的豬隻採取。

●定性試驗(Qualitative technique)

將未稀釋的待測血清置於九十六孔盤內,每個樣品分別注於相鄰三孔,每孔 50 ul。

將病毒以最低必需培養液(MEM)作適量的稀釋,使病毒含量為 100 TCID50 /50 ul( 即 2×103 TCID50 / mL )。每孔加入 50 ul 的病毒液。

將九十六孔盤置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時。

將消化後的細胞配製成細胞濃度為 150,000 個 / mL 的懸浮液,每孔加入 150 ul。

將盤子稍微搖動,使細胞均勻分佈後,置於攝氏三十七度恆溫箱內。若是使用可自動供給二氧化碳的恆溫箱,則只要將培養皿以其蓋子蓋上即可;若是使用無二氧化碳供給的恆溫箱,則培養皿需以膠帶封住才置入恆溫箱中。

每次都需放置對照組,包括病毒對照、細胞對照、陽性血清對照、血清對照(為測試該批血清是否具細胞毒性)及陰性血清對照。

病毒對照:將適當稀釋的假性狂犬病病毒(其病毒量為 100 TCID50 / 50 ul)以最低必需培養液(MEM)再做 1 / 10、1 / 100、1 / 1000 稀釋。將上述稀釋好的病毒液加入九十六孔培養皿,每孔加入 50 ul,每一稀釋倍數至少加五格。每孔再加入 50 ul 的最低必需培養液,置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時後,加入如上述製備好的細胞懸浮液。

細胞對照:上述製備好的細胞懸浮液,每孔加入 150 ul,至少要加入兩格,每格再加入最低必需培養液 100 ul。

陽性對照:拿已知中和抗體力價的血清作為陽性對照,必須做五個稀釋倍數。例如該血清的力價已知為 T,則必須做的五個稀釋倍數為 T、T / 2、T / 4、2T 及 4T 。加入病毒與細胞懸浮液的量與感作方式如前所述。

血清對照:這是為了要測知該批測試血清有否細胞毒性。將 50 ul 的血清加入 50 ul 的最低必需培養液,置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時後,加入如上述製備好的細胞懸浮液 150 ul,其餘步驟如前所述。

陰性對照:無特定病原豬隻的血清作為陰性對照血清,其操作方法與前述檢測血清的操作方法相同。

判讀:在作用四十八小時至七十二小時後,於顯微鏡下觀察其細胞病變作用(CPE)。或是以甲基藍固定染色,尚有細胞附著的部分則可染上深藍色,而發生細胞病變作用(CPE)的地方則不被染色。該次試驗若要判定為有效者,至少對照組的結果要達下列標準:

病毒對照:該次所使用的病毒,力價需為 30 至 300 TCID50 / 50 ul。

細胞對照:細胞必須是完全健康的。

陽性血清對照:所測得的力價必須與事前所預期的相同。

血清對照:若血清對細胞有毒性則細胞會有不正常的現象。

陰性血清對照:都必須有細胞病變作用(CPE)產生。

測試血清的判讀:每個測試血清都加了三孔,並於第三天判讀。若三孔都有細胞病變,表示該血清為陰性。若三孔都無細胞病變出現,表示該血清為陽性;若其細胞病變只出現於一孔,或是在培養三日後仍僅有極小的細胞病變者,表示該測血清之力價無法判定,必須重新測定。

本試驗可以測定血清中有否存在抗假性狂犬病的中和抗體,但並無法區別該抗體係因免疫注射產生抑或為自然感染所致。在本試驗中,將血清與病毒等量混合置於攝氏三十七度中感作一小時的步驟,可能會導致偽陰性(false-positive)或偽陽性(false-negative)。因為這樣的感作法,其敏感性不如置於攝氏四度中感作廿四小時,亦不如酵素結合免疫吸附試驗。所以,在本試驗中測得血清為陰性者,並不保證血清內不含有抗假性狂犬病的抗體(尤其是若該血清以酵素結合免疫吸附試驗測得為陽性者)。

因為本定性試驗用的檢體是未稀釋的,所以在某些例子可能會出現偽陽性。為了避免偽陽性出現,可以使用定量試驗(quantitative technique),又如果以定量試驗只有未稀釋血清為陽性反應(有抗體,即無 CPE),其餘連續稀釋的倍數都有 CPE 出現,則建議最好將血清檢體再以其他試驗,如酵素結合免疫吸附試驗或膠乳凝集試驗再進行檢測,或於第一次採血後八日再採配對血清檢測。

●定量試驗(Quantitative technique)

在九十六孔盤加入 MEM,每孔均加入 50 ul。

將待測血清加於 H 列,每個樣品加二孔,每孔 50 ul。

以十二爪微量吸管(multichannel pipette)在 H 列將血清與 MEM充分混合,吸出 50 ul 移注於 G 列,再以十二爪微量吸管充分混合,吸出 50 ul 移注於F 列,,如此相同步驟將血清從 H 至A 以兩倍稀釋。最終 50 ul 丟棄。

將病毒以最低必需培養液(MEM)做適量的稀釋,使病毒含量為 100 TCID50 / 50 ul( 即 2×103 TCID50 / mL)。每孔加入 50 ul 的病毒液。

將九十六孔盤置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時。

將消化後的細胞配製成細胞濃度為 150,000 個 / mL 的懸浮液,每孔加入 150 ul。

將盤子稍微搖動,使細胞均勻分佈後,置於攝氏三十七度恆溫箱內;若是使用可自動供給二氧化碳的恆溫箱,則只要將培養皿以其蓋子蓋上即可;若是使用無二氧化碳供給的恆溫箱,則培養皿需以膠帶封住才置入恆溫箱中。

每次都須於置對照組,包括病毒對照、細胞對照、陽性血清對照、血清對照(為測試該批血清是否具細胞毒性)及陰性血清對照。

病毒對照:將適當稀釋的假性狂犬病病毒(其病毒量為 100TCID50 / 50 ul)以最低必須培養液(MEM)再做 1 / 10、1 / 100、1 / 1000 稀釋。將上述稀釋好的病毒液加入九十六孔培養皿,每孔加入 50 ul,每一稀釋倍數至少加五格。每孔再加入 50 ul 的最低必須培養液,置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時後,加入如上述製備好的細胞懸浮液。

細胞對照:上述製備好的細胞懸浮液,每孔加入 150 ul,至少要加入兩格,每格再加入最低必需培養液 100 ul。

陽性對照:拿已知中和抗體力價的血清作為陽性對照,必須做五個稀釋倍數。例如該血清的力價已知為 T,則必須做的五個稀釋倍數為 T、T / 2、T / 4、2T 及 4T 。加入病毒與細胞懸浮液的量與感作方式如前所述。

血清對照:這是為了要測知該批測試血清有否細胞毒性。將 50 ul 的血清加入 50 ul 的最低必需培養液,置於攝氏三十七度的恆溫箱中,振盪感作一小時後,加入如上述製備好的細胞懸浮液 150 ul,其餘步驟如前所述。

陰性對照:無特定病原豬隻的血清作為陰性對照血清,其操作方法與前述檢測血清的操作方法相同。

判讀:在培養四十八小時至七十二小時後,於顯微鏡下觀察其細胞病變作用(CPE)。或是以甲基藍固定染色,尚有細胞附著的部分則可染上深藍色,而發生細胞病變作用(CPE)的地方則不被染色。該次試驗若要判定為有效者,至少對照組的結果要達下列標準:

病毒對照:該次所使用的病毒,力價需為 30 至 300 TCID50 / 50 ul 。

細胞對照:細胞必須是完全健康的。

陽性血清對照:所測得的力價必須與事前所預期的相同。

血清對照:若血清對細胞有毒性則細胞會有不正常的現象。

陰性血清對照:都必須有細胞病變作用(CPE)產生。

測試血清的力價判定:以能夠完全中和病毒所產生細胞病變的血清最高稀釋倍數,即為其力價。

酵素結合免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);目前市售的假性狂犬病抗體的 ELISA 試劑套組有許多種,其所使用的試劑(包括抗原、酵素標示抗體、呈色劑等)均有不同,其操作步驟與判定方法亦不盡相同。一般而言,使用酵素結合免疫吸附試驗的好處是可以快速的檢測大量的檢體,或甚至可以結合自動操作系統及電腦,以便分析檢測結果。亦有市售 ELISA 試劑套組可以區別自然感染與疫苗免疫者,但這是在所使用的疫苗為標記疫苗(marker vaccine)或基因缺損疫苗(gene-deleted vaccine)的情形下。

假性狂犬病之診斷

一、診斷方法:

臨床症狀:在沒有抗體保護的動物,感染後可能產生角弓反張、游泳滑水狀等神經症狀。兔、牛、狗等動物感染後可能會有搔癢現象。母豬感染本病可能造成流產、死產等繁殖障礙。

細胞培養分離病毒:將病材乳劑接種於細胞(常用的是 PK-15),經過廿四至七十二小時培養,應可見到特異的細胞病變(細胞圓形化及融合)。若是沒有細胞病變出現,則再進行繼代培養。

動物接種:將病毒液(病材乳劑上清液)肌肉接種於兔子。若有假性狂犬病病毒存在,兔子於接種部位會因奇癢而搔癢不止,甚至捉至破皮、流血亦不停止搔癢。

電子顯微鏡檢測:可以從培養或病材乳劑的上清液,檢出假性狂犬病病毒(為泡疹病毒,有封套,完整病毒約150~180 nm)。

血清學檢測:除了豬以外,其他動物感染假狂犬病不易存活至血清中產生抗體,因此這個方法只能用於豬隻血清檢測。我國主要是以中和試驗測定其抗體力價。為大量篩檢檢體,在國外亦有發展以酵素結合免疫吸附試驗進行血清學檢測。

二、類症鑑別:

本病只有一種血清型。

日本腦炎、豬生殖與呼吸綜合症、豬小病毒等皆會引起感染母豬的流、死產;鏈球菌感染亦會引起神經症狀,但與假性狂犬病可鑑別診斷。

從臨床不易直接判定是否有假性狂犬病感染,所以確診只能從實驗室中診斷。其必要措施包括:防疫(疫苗接種等)情形的調查、鄰近豬場的疫情調查、疑發生場的病材取樣(流死產胎兒、分泌物、咽喉拭子等)、配對血清的採取。

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