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副結核病
Paratuberculosis
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副結核病
(Johne's 氏病

摘 要

副結核病 (Paratuberculosis,又稱為Johne's氏病) 是由副結核桿菌(Mycobacterium paratuberculosis) 引起反芻類動物之慢性腸炎 (chronic enteritis) 。

病原菌的鑑別:副結核病的診斷可以分成兩個部份:臨床疾病的診斷和檢測潛伏性的感染 (subclinical infection) ,潛伏性的感染是農場、國家或全球在控制本疾病的首重要務。

副結核病的診斷方法是用顯微鏡鏡檢、培養或藉去氧核醣核酸(DNA)探針和聚合酶鏈反應 (PCR) 等方法來檢出在糞便中副結核桿菌的存在。屍體解剖的診斷是藉它在腸道不論是肉眼或是組織病理學上產生的特徵性病變以及藉此分離出副結核桿菌。

診斷潛伏性的感染是藉它對副結核菌素(johnin)或禽結核菌素(avian tuberculin)所產生的遲發型過敏反應(delayed-type hypersensitivity)、用血清學方法檢測出它的特異性抗體或是從糞便中分離出副結核桿菌。選擇何種診斷方法是視情況及針對這個體或群體之敏感性而定。

可以從糞便或是組織中分離出副結核桿菌;在加入防止雜菌污染的制菌劑之後,接種到人工的培養基,培養基含有或不含特異性成長因子 - 分枝桿菌素(mycobactin) - 它是副結核桿菌生長的基本要素。

血清學試驗:副結核病在疾病的控制上,面臨的最大困難是潛伏性感染的牛隻很不容易被檢查出來。最常被使用在診斷牛的副結核病的血清學方法是補體結合試驗 (CF) 、酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 和凝膠免疫擴散試驗 (gel immunodiffusion) 等。雖以糞便培養結果作參考而來決定這些方法的敏感性及特異性,但應用於潛伏性感染牛隻時,其敏感性仍無法確知。當應用於具典型臨床症狀之確診病例時,某些試驗例如 CF,則具有良好的效果。

疫苗和診斷用的生物製劑之必要條件:副結核病的疫苗可以用減毒活菌或死菌,加入佐劑 (adjuvant) 或是冷凍乾燥 (lyophilised) 處理(於解凍時再加入佐劑)。疫苗很難做細菌計數,所以疫苗所含菌量的多少是以重量來估計,每批生產的疫苗之力價是以它對天竺鼠的致敏化能力來測定。

疫苗的安全性或是異常毒性也可以用天竺鼠來測試。

副結核菌素和禽結核菌素它們各別是副結核桿菌或禽結核桿菌 (M. avium) 之培養液經過熱處理 (heat-treated culture) 後的純化蛋白衍生物 (purified protein derivatives, PPD) 。副結核桿菌素所含的純化蛋白衍生物可用化學試驗的方法加以標準化,它的生物活性需藉經副結核桿菌致敏化的天竺鼠而加以確認。

禽結核桿菌素活性的測定需藉經禽結核桿菌致敏化的天竺鼠而加以確認,其結果並和已製備好的計量表以國際單位 (IU) 做比較。

A.診 斷 技 術

副結核桿菌是在 1895 年首度被 Johne 和 Frothingham 所發現的。它可以導致副結核病或稱為 Johne's 氏病,它是一種慢性腸道肉芽腫 (chronic intestinal granulomatous) 的感染。首見於牛,然後在羊、接著是山羊都被發現有這病原菌的感染,副結核病最常被發現感染飼養和野生的反芻類動物,亦曾發生在馬、豬、鹿和羊駝等動物。在自然環境裡,牛因為在污染的環境裡吃下含本病的病原菌而感染。這疾病在引入病畜之後會一直持續地存在於該畜群裡。小牛最常感染的來源是吸吮感染母牛的乳液或是乳中污染了病牛的糞便。

副結核桿菌的鑑別是根據它們對分枝桿菌素的需要程度和它們的病原性。對分枝桿菌素的依賴程度很早以前就被用來做為副結核桿菌在生物分類學上特性的依據,因為大部份的分枝桿菌 (Mycobacteria) 都能夠自已製造分枝桿菌素。副結核桿菌、silvaticum 分枝桿菌和某些的禽結核桿菌在初代分離時都缺乏製造分枝桿菌素的能力,但它們在實驗室裡培養時都需要分枝桿菌素,所以並不祗是副結核桿菌需要此分枝桿菌素。這種特性在禽結核桿菌群裡有各種不同程度的差異 (27) 。

副結核病的症狀是呈緩慢的進行方式,剛開始時間斷性的出現消瘦和下痢的情形,如果成為常在性之後會變成嚴重的進行性病情 (6) 。在小型的反芻類動物較不常發生下痢的情形。

一部份感染的母牛會由子宮內感染傳給下一代。早期的病變發生在小腸的腸壁和腸系膜的淋巴結,這時期的病變祗局限於這些部位。當疾病進展之後,在小腸的末端、盲腸和結腸以及腸系膜淋巴結都可看到肉眼的病變。副結核桿菌會存在這些病變處,最後散佈於全身。腸道的病變會造成腸道的蛋白質滲漏和吸收不良,它會因此而導致肌肉的消瘦。臨床症狀經常先是出現在年輕的成年動物,但是它也可能發生在1 ~ 2歲的動物。

在感染初期(幾周內)副結核桿菌開始在小腸壁繁殖。視動物個體的抵抗力它會自動痊癒或是變成感染的帶原者,但這種情形的比率到底有多少目前仍不得而知。動物於疾病末期時,在腸道增生的病原菌會造成廣泛性的病變並同時干擾腸道的新陳代謝以及產生疾病的臨床症狀。潛伏性感染的帶原者所排出的糞便會帶有大量的副結核桿菌;當臨床症狀發生時,大部分病例均會排出大量的病菌。

早期感染時就會有遲發型的過敏反應 (DTH) ;在部份的潛伏性帶原動物也會有同樣的情形,但是當疾病繼續發展之後,這遲發型過敏反應開始變小,具臨床症狀之病例也可能不再出現遲發型過敏反應。在遲發型過敏反應發生之後,血清中的抗體也會出現。在感染後復原的帶菌者也會有抗體存在。當病變的範圍變得更廣泛時抗體會更持續地存在於血清之中並且有更高的力價,這反應出體內有大量的病菌存在。

其它的分枝桿菌疾病和感染(包括哺乳類和禽結核桿菌),都會導致遲發型過敏反應和血清中出現抗體。因此這些疾病必須在臨床上和用特異性的診斷試驗來和副結核桿菌的感染加以區別。

副結核病的疫苗接種可以產生遲發型過敏反應和血清抗體。疫苗接種可以防止疾病的臨床症狀產生,但並不一定能防止病原菌感染。因此在疫苗接種之後如果要診斷是否感染則必須要從糞便中檢查是否有副結核桿菌 (11) 。

對單一個體的動物而言,特別是來自從來都沒診斷是否有本病感染的牧場,必須用實驗室的診斷方法來確認暫時性的臨床檢查是否有誤。如果有典型的臨床症狀產生而且知道這疾病已經存在這牛群裡時,最終的確診還是祗有藉觀察臨床症狀一途。副結核病的確診得依賴肉眼或在顯微鏡下觀察這疾病所特有的病變以及確實分離出副結核桿菌。

如果要針對單一動物個體診斷是否感染副結核病時,有許多實驗室的診斷方法可供應用,它們包括糞便抹片檢查、糞便細菌培養、糞便的去氧核醣核酸探測法、血清學檢查、屍體解剖檢查和組織學的檢查。

藉潛伏性感染的診斷而瞭解感染的流行情況,並由此即可研擬出一套控制疾病的辦法。由於沒有一個試驗可以百分之百地檢查出此疾病,所以必須連續幾年不斷地將陽性反應者從這群動物中摘除,並且每六個月或每年檢查一次。用血清學試驗或糞便檢查的方法摘除陽性反應者,有時也不儘然可完全成功 (2) 。

1. 病原菌的鑑別

  (a) 屍體解剖

 

副結核病無法藉由腸道外觀的增厚之現象來診斷。腸道必須從十二指腸至直腸的部位剖開檢查其粘膜層 (mucosa) ,特別在迴腸的尾端,檢查其特有的病徵如增厚和皺紋等。臨床症狀的嚴重性和腸道病變的廣泛性,並無密切相關性。早期腸道的病變如果在明亮處觀察的話可看到許多不連續的斑點 (discrete plaques) 。此時的腸系膜淋巴結可能腫大和呈水腫的現象。

感染的粘膜和淋巴結切面之抹片,可以用 Ziehl-Neelsen's 染色法,在顯微鏡底下檢查副結核桿菌的抗酸菌 (acid-fast organisms) 之特徵性形態,但並非所有病例均可檢出抗酸菌。所以,最好的診斷方法是廣泛地採集腸壁和腸系膜淋巴結樣本,並將之固定 (10%福馬林生理食鹽水) 後,以便進一步做組織學上的檢查。可以用蘇木素和伊紅 (haematoxylin-and-eosin-stain) 和 Ziehl-Neelsen 染色後再做檢查。病變的特徵是固有層 (lamina propria) 的浸潤、集淋小結 (Peyer's patches) 和腸系膜淋巴結的皮質腫大、上皮狀的細胞淡染和 Langhans' 巨細胞多核化,兩者經常都可看到抗酸桿菌成叢或單獨存在,但並不一定全部都有此現象。偶而可看到Langhans'巨細胞裡面含有菌體。

在羊和山羊可看到類似於牛的病變。它們的粘膜輕微增厚,但有時腸道及與其相關之淋巴結呈乾酪狀變性和鈣化。在羊駝 (alpaca) 可看到腸系膜淋巴結腫大。


  (b) 細菌學 (顯微鏡下)
 

在顯微鏡下鏡檢經 Ziehl-Neelsen 染色的糞便抹片,如果發現成叢 (三個或三個以上的菌體) 細小呈強抗酸染色的桿菌則可診斷為副結核病。但是如果祗看到獨立的抗酸桿菌而沒有成叢出現時並不能做為確診的證據。這試驗的缺點是所採集的單獨糞便樣本祗有約 1/3 可以被鏡檢出來,主要的原因是糞便中有其它抗酸物體存在而受到干擾。


  (c) 細菌學 (培養)
 

副結核桿菌主要的感染部位是小腸和鄰近的盲腸。在糞便及腸組織樣本內所含其它細菌的數目遠超過副結核桿菌本身的菌體數目。

副結核桿菌的初代培養菌落可以在接種後5 ~ 14週內出現。用含分枝桿菌素 (mycobactin) 的Herrold's培養基培養的初代培養菌落形狀非常小 (直徑約1毫米) 、無色、半透明並且呈半球狀。菌落的邊緣呈圓形而且均勻,表面看起來光滑和閃亮。當繼續培養後,菌落的體積漸增加 (4或5毫米) 時則變成較不透明。菌落的形態隨著培養時間會從光滑變成粗糙,從半圓形變成乳頭狀(26)。

一種分離自綿羊,較不尋常的明亮具黃色素的菌株,不容易在人工培養基內生長。曾有報告指出無黃色素的綿羊菌株比分離自牛的菌株的生長情況較差,如果因沒有培養更長的時間而只得到陰性結果時不應將培養基就此捨棄。

要進一步鑑別副結核桿菌時,將小量疑似為本菌的菌落用同樣的培養基內含或不含分枝桿菌素做純化培養,以便觀察它對分枝桿菌素的依賴程度。

˙培養基

 適合的培養基有:

(1) 含分枝桿菌素的Herrold's蛋黃培養基 (10,15)
  1公升的培養基內含有:9公克的蛋白腖,4.5公克的氯化鈉,2.7公克的牛肉萃取液,27毫升的甘油,4.1公克的丙酮酸鈉(pyruvate),15.3公克的瓊脂,2毫克的分枝桿菌素,870毫升的蒸餾水,六個蛋黃 (120毫升) 和5.1毫升的2%孔雀綠水溶液。前六種成份的定量是先將其置於蒸餾水中加熱溶化。用 4% 氫氧化鈉調整這液體培養基的pH值為6.9 ~ 7.0,並檢查當它凝固後的pH值應為7.2 ~ 7.3。將溶於4毫升乙醇的分枝桿菌素加入後,在121℃之下高壓滅菌25分鐘。冷卻至56℃之後以無菌操作加入6個無菌的蛋黃和無菌的孔雀綠溶液。溫和地混合均勻後分裝於無菌的試管內。 也可以加50毫克的氯黴素,100,000單位的青黴素和50毫克的節性鏈黴素B (amphotericin B) 。
(2) 改良Dubos培養基 (24)
  1公升的培養基內含有:2.5公克的胺基酸(casamino acid),0.3公克的門冬醯胺(asparagine),2.5公克的無水雙鈉氫磷酸鹽,1公克的鉀雙氫磷酸鹽,1.5公克的檸檬酸鈉,0.6公克的硫酸鎂結晶,25毫升的甘油,50毫升的1% Tween 80溶液和15公克的瓊脂。用小火加熱將各種鹽類溶解在蒸餾水裡,並配成800毫升的溶液。加分枝桿菌素於酒精溶液配成0.05% (2毫克溶於4毫升的乙醇內) ,用無蒸氣法將培養基加熱到100℃,再置於115℃高壓滅菌15分鐘。用水浴冷卻至56℃後加入抗生素 (100,000單位的青黴素,50毫克的氯黴素和50毫克的節性鏈黴素B) 和血清 (200毫升通過Seitz 'EX'墊濾過滅菌和加熱至56℃約1小時使之不活化的牛血清) 。培養基充份混合均勻之後分裝於滅菌的試管內。這培養基的優點是它有非常好的透明度,因此可以儘早就檢查到菌落的存在。
(3) Middlebrook 7H9、7H10和7H11培養基 (Difco公司) ,它是以Herrold's培養基同樣的比例成份再加強分枝桿菌素而製成。

˙樣本的準備

  雖然糞便培養技術上非常困難並且需花較長的時間,但它使用在活體動物仍不失為診斷副結核病的好方法。它也是唯一不會造成假陽性反應的試驗 (具有100%的特異性) 。它可以在動物發病前六個月甚至更早即可診斷出來,而且在發病的期間,它的敏感度可達百分之百。

˙ 組織樣本的處理

  不能使用化學保存劑,但組織可以冷凍。

  為了避免污染,在輸送到實驗室之前糞便必須先自腸道中洗出來。

(1) 組織的消化
  從迴盲瓣 (ilelcaecal valve) 刮下約4公克的粘膜和腸系膜淋巴結或其它有顯示出病變的地方,然後將它放在含有50公克胰蛋白酵素 (trypsin) 的摻合器之瓶內。混合液用4%氫氧化鈉和pH試紙調整酸鹼度,用磁性攪拌器在室溫下攪拌30分鐘。經消化後的混合物用紗布濾過,濾過物在約 1,650g 離心30 分鐘後去除上清液。
(2) 除去接種物的污染
  沉澱物重新用20毫升的0.75%氯十六烷基氮苯 (hexadecylpyfidinium chloride, HPC) 製成懸浮液,在室溫下靜置18小時之後,它的微粒會附著在試管的底部,在不攪動上清液的情況下用吸管將它吸出來做為接種物。
(3) 培養基的接種和培養
  各將約0.1毫升的接種物分別放入三支Herrold's斜面培養基上(含有分枝桿菌素)另接一支不含分枝桿菌素的斜面培養基。接種物必須均勻地分佈在培養基的斜面上。將這試管蓋子稍微鬆開,並且保持傾斜的位置在37℃之下培養約一週。
  當斜面上潮溼的流動液體蒸發掉了之後再將試管恢復垂直的位置。此時將蓋子栓緊並將試管置於架上放入37℃的保溫箱中培養。
  在Herrold's培養基裡加入蛋黃可以提供足夠的燐脂 (phospholipids) 來中和殘留在接種物的 HPC 之殺菌活性。另外的培養基 (改良的Dubos和Middlebrook) 並沒有這個特性。也可以用其它的物質來防止樣本的污染,例如5%的草酸 (oxalic acid) 。
  HPC 對抑制黴菌 (fungi) 生長的效果非常差。Merkal和Richards (18) 發現節性鏈黴素B (Amphotericin B,商品名稱為Fungizone) 可以有效地抑制接種後,培養基內黴菌之生長。節性鏈黴素也可以加入Herrold's培養基內,其培養基的最終濃度是每毫升50μg。因為節性鏈黴素會漸失它的制黴效果,所以這含有節性鏈黴素的Herrold's培養基在4℃的貯存期間不能超過一個月。
  培養基的斜面每週觀察一次,連續觀察15 ~ 20週。

˙ 糞便樣本的處理

  不使用冷凝劑或化學保存劑。

(1) 糞便的懸浮液和防污染劑
  1公克的糞便放入含20毫升滅菌蒸餾水的50毫升試管內。將這混合物在室溫下搖晃30分鐘後較大的塊粒可以沈澱下來。將最上層5毫升的糞便懸浮液取出置於含20毫升 HPC 的50毫升試管裡。將試管反轉數次使它能混合均勻,然後在室溫靜置18小時。
(2) 培養基的接種
  各取0.1毫升未受攪動的沉澱物放入四支斜面Herrold's培養基裡,三支含分枝桿菌素另一支則不含。將它的沉澱物製成塗抹片,並用Ziehl-Neelsen方法染色。
(3) 斜面的培養和觀察
  和組織樣本的做法相同。

  有許多不同的培養方法可供參考 (3,12,17,20,23,31,32) 。


  (d) 去氧核醣核酸探針法
 

去氧核醣核酸 (DNA) 探針法提供了一個診斷副結核桿菌的新方法。它可以很迅速地對所採取的樣本做診斷及分離的菌株做鑑定 (16) 。由於它具有獨特的特異性,所以它能夠分辨出是副結核桿菌或是其它分枝桿菌的感染,特別是禽結核桿菌群。

McFadden等人在DNA中找出一個序列 (sequence) 稱為IS900(13、14),它是屬於副結核桿菌具有特異性的染色體插入序列。已經有報告提及用IS900做為DNA探針來特異性地診斷牛糞便樣本中的副結核桿菌 (29) ,它是利用聚合酶的鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) 來使DNA的酶增強。市場上已經發展出藉聚合酶的鏈反應來增強來自IS900序列的DNA斷片,用這方法可以診斷出糞便樣本中副結核桿菌所含DNA上之IS900。這試驗可以用診斷盒的方式,所以適合在一般的實驗室裡進行。但它和糞便培養比,在診斷上的敏感度較差。

2. 血清學試驗

  經常被用來做副結核病的血清學診斷方法是補體結合試驗 (CF) 、酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 和膠內免疫擴散反應 (AGID) (25) 。 

(a) 補體結合試驗
 

補體結合試驗多年來一直是診斷牛副結核病的標準試驗方法。補體結合試驗對疑似感染動物時它的診斷效果很好,但是因為它的特異性不夠,所以無法用在做為一般牛群的疾病控制之用。當從別的國家輸入牛隻時補體結合試驗是常被要求必須做的診斷方法。補體結合試驗的檢查方法視國家而有所不同。下面是用微滴定法 (microtitre method) 來操作的補體結合試驗之例子 (7) :

(1) 抗原是用除去脂質之細菌的水溶性萃取物 (副結核桿菌316F菌株) 。也可以用禽結核桿菌D9。
(2) 所有的血清都用60℃水浴30分鐘加以不活化,並稀釋成1/4,1/8和1/16。每一個微量盤裡必須包含一陽性對照血清。另外也需要準備下列的對照組:抗原對照組、補體對照組和溶血系統對照組。
(3) 冷凍乾燥的補體經過溶解之後用對抗原力價測定的方法將之稀釋成含六倍的H50 (50%血球溶血之劑量) 。
(4) 2.5%羊紅血球,用2單位的H100溶血素 (haemolysin) 將之致敏化。
(5) 所有的稀釋液和反應劑都用鈣/鎂佛羅那緩衝液 (veronal buffer) 來製備。在96孔圓底的微量滴定盤的每一孔裡加入25μl的反應劑。
(6) 初培養時是在4℃之下放置隔夜,次培養時則在37℃之下培養30分鐘。
(7) 結果的讀取和判定:微量滴定盤可讓其自然沉澱或是經過離心,記錄的方法如下:4+ = 100%結合,3+ = 75%結合,2+ = 50%結合,1+ = 25%結合以及 0 = 完全溶血。受測血清的力價是以能使50%結合的最高稀釋濃度倒數為準。稀釋倍數為1/8,當讀數為2+時認定為陽性反應其力價為8。判讀的結果必須和臨床症狀和其它實驗室的診斷方法一起參考比較。
   
(b) 酵素結合免疫吸附試驗
 

酵素結合免疫吸附試驗是目前診斷副結核桿菌血清中抗體敏感性最高和最具特異性的試驗。在臨床上它的敏感性和補體結合試驗可以說是不相上下,但是用在診斷潛伏性的帶原者時它的敏感性則比補體結合試驗高出許多。如果經由血清吸附phlei分枝桿菌時可以提高酵素結合免疫吸附試驗的特異性。

這吸附的酵素結合免疫吸附試驗是由Yokomizo等人 (34) 所設計出來的並且經由Milner等人 (19) 加以改良,並由Cox等人 (4) 研究發展成商業用途的診斷盒。這診斷盒經過Ridge等人測試的結果發現它在臨床病例上有88.3%的敏感性,在潛伏性感染的病例則有48.8%的敏感性,另外,它的特異性達到99.8%。

這吸附的酵素結合免疫吸附試驗具有和酵素結合免疫吸附試驗相同的敏感性,但因為被測血清多了一個吸附的手續,所以也同時增加了它的特異性。在進行試驗之前,被測血清用含有phlei分枝桿菌水溶性抗原的緩衝液稀釋之後進行間接酵素結合免疫吸附。這個方法可以排除因非特異性交叉反應抗體所造成之干擾。在早期時血清的吸附是用離心出來的全部phlei分枝桿菌。

最近發展出來的一種微滴定盤是將副結核桿菌抗原預先包覆在96孔的平盤。血清先經由含phlei分枝桿菌的稀釋液加以稀釋以除去交叉反應的抗體。當這稀釋血清在這預先包覆的平盤內培養時,對副結核桿菌有特異性的抗體會和包覆的抗原形成一複合物 (complex) 。在洗掉小孔內未結合之剩餘物質之後再加入用辣根過氧化物酵素 (horseradish peroxidase, HPRO) 標示的抗牛免疫球蛋白。它會和免疫球蛋白結合然後附著在固態的抗原上。這酵素分解的轉換速率和結合的免疫球蛋白數量成比例。它之後所呈現的顏色變化可用光譜分析法 (在450 nm) 來檢測,它和受測樣本內所含的抗體量成比例。

用來包覆酵素結合免疫吸附試驗平盤的抗原是副結核桿菌316F,它經過煮沸15分鐘後過濾,再用重碳酸鹽緩衝液(bicarbonate)稀釋。被加入血清稀釋劑做為吸附抗原之用的phlei分枝桿菌菌株,VRI 22/2/89,也是經過煮沸和過濾。

以辣根過氧化物酵素標示的抗牛免疫球蛋白是用來做為軛合物 (conjugate) 之用途。這酵素的色原質 (chromogen) 溶液是過氧化氫四甲替聯苯胺 (hydrogen peroxide tetramethyl benzidine) 。當陽性對照血清的吸附作用已經達到預測點 (pre-determined point) 時可以加入0.5摩爾的H2SO4溶液來中止這反應的進行。

商用的試驗盒裡都附有詳細的說明書,它包括試驗的操作方法和所需準備的試驗材料等。操作方法和例行的酵素結合免疫吸附試驗相同。每件血清樣本都使用一小孔來做篩別試驗,但它的結果並不確實。做診斷試驗時必須以兩個小孔做重覆試驗。

雖然強陽性反應可以用肉眼來判讀,但這吸附的酵素結合免疫吸附試驗最好還是用光譜分析法來判定反應是否已達截止點 (cut-off point) 。計算一有效試驗的截止值 (cut-off value) 是將陰性對照組的平均值加0.100。舉例來說,假若陰性對照組是0.055和0.085那麼它的截止值是0.070 + 0.100 = 0.170。

當已知牛群之本病病歷時,可針對單一牛隻進行測試並加以判讀結果。

   
(c) 膠內免疫擴散反應
 

用膠內免疫擴散反應來確認臨床上被懷疑為感染的牛、羊和山羊來說是一個非常有效的方法 (22) 。它們有許多不同的操作方法。

抗原是用副結核桿第18實驗菌株的粗原生質萃取物,它的萃取方法是將細胞放入水壓機細胞分餾器裡使細胞分解。被分解的細胞經過 40,000g 離心二小時來除去細胞壁的殘渣,收集上清液並冷凍乾燥保存。這抗原在使用之前用水配成濃度10毫克/毫升的懸浮液。

瓊脂糖 (agarose) 溶解在巴比特魯緩衝液 (barbital buffer) 裡,調成 PH 8.6,含疊氮化鈉 (sodium azide) ,並使瓊脂糖的最終濃度為0.75%。瓊脂糖可以倒入平皿 (Petri dishes) 裡或是玻片上。小孔排成六角型的排列方式。小孔的直徑為4毫米,間隔為4毫米,並且瓊脂的厚度必須達3 ~ 4毫米深。抗原加入中央的小孔。被測血清、陽性和陰性對照血清分別加入在周邊對側的小孔裡。

將這平盤在室溫下培養於潮溼的密室中。在培養24 小時及48小時之後分別檢查它形成的沉澱線。在48小時或之前如果出現一條或以上和陽性對照血清一致的沉澱線即可判定為陽性。如果沒有任何沉澱線時則認定為陰性,但有時可能出現非特異性的沉澱線。

3. 遲發型過敏反應

  這試驗的方法是用0.1毫升的禽純化蛋白衍生物 (purified protein derivative, PPD) 的結核菌素 (tuberculin) 或副結核菌素 (johnin) (禽結核菌素和副結核菌素是相當具有敏感性和特異性的抗原物質) 經由皮內接種到牛的頸側中線前 1/3 的剃毛部位。在接種前及在接種後72小時用測徑器量皮膚的厚度。如果皮膚的厚度增加2毫米以上可以判定為已發生遲發型過敏反應 (DHT) 。需注意的是,鹿的陽性反應是呈擴散性的斑點而不是獨立周邊明顯的腫脹,因此會使判讀變得很困難。所以,當鹿祗要有腫脹的現象時即被判定為陽性反應。遲發型過敏反應的應用價值不高,因為動物普遍都接觸過禽複型結核桿菌因此對禽複型結核桿菌常會有致敏化的現象,所以不管是禽結核桿菌素或是副結核桿菌素都沒有很高的特異性 (9) 。群體的試驗祗是做為瞭解它們被致敏化的情形,所以它祗能用來做為擬定防疫計劃之前的先行試驗。

B. 疫苗和診斷用生物製劑的必要條件

疫苗:用來做為對抗副結核病的疫苗如下:被包含在油和浮石 (pumice) 裡的減毒活菌、經過冷凍乾燥的減毒活菌它可能在解凍後被加上佐助劑例如油等、以及經熱處理後的死毒菌苗。疫苗可能來自副結核桿菌316F或2E (Weybridge) 或副結核桿菌3和5或Ⅱ (加拿大菌株) 之單一菌株,或是可能含三種以上的菌株。以下所提供的資料都是應用於減毒活菌疫苗並用油和浮石做為佐助劑 (5,28,33) 。

診斷用產品:副結核菌素純化蛋白衍生物 (PPD) 是由生長中的副結核桿菌及其溶解物經過熱處理而製備出的產品。禽結核菌素純化蛋白衍生物 (PPD) 則是由生長中的禽結核桿菌D4ER或TB56及其溶解物經過熱處理而製備出的產品。詳細的禽結核菌素純化蛋白衍生物的資料請參考第3.6.8章禽結核病。這兩種製劑經由皮內注射後都可呈現出遲發型過敏反應,而被應用於診斷曾被副結核桿菌感染或致敏化的動物。

1. 種菌的管理

(a) 種菌的特性
 

疫苗:種菌株必須是目前流行的菌型,且需經生物分類法或是做基因上分析之檢測。它們必須可以用於接種在指定接種方式的特定動物種別身上。

  副結核菌素:用來做為種菌的副結核桿菌菌株必須先用生物分類法或做基因的測試。而且它們必須沒有雜菌的污染。
   
(b) 培養方法
  疫苗:種菌可以培養在馬鈴薯的斜面,並且部份浸入在合適的培養基裡,例如Reid's合成培養基 (30) 。菌株可以用冷凍乾燥貯存。在培養時可以放在37℃的保溫箱裡。
  副結核菌素:其培養基之成分必須不能含有毒素或產生過敏反應的物質。Reid培養基適合做為種菌培養的培養基(含1.75% 瓊脂)分裝於螺旋蓋的試管中。菌株也可以用冷凍乾燥法來貯存。
   
(c) 疫苗的合格化
  疫苗:種菌培養及最後收菌時必須以抹片染色檢查,做為純化試驗。 這疫苗雖能被用來做為防疫計劃的一部份但對副結核桿菌造成的疾病沒有完全的保護作用 (33) 。它們對控制有臨床症狀的感染有很好的效果,但經過疫苗注射之後,雖然它的菌量會降低可是潛伏性的感染仍會一直存在牛群之中。疫苗祗能使用於動物的年幼期亦即第一個月的小牛。它必須經過皮下注射,並產生輕微的發炎腫脹。它漸漸會變成面積不等的不發熱、無痛、纖維乾酪狀的結節,並且會持續數年之久。
  使用過疫苗之後會干擾結核病皮膚試驗的診斷結果,所以在做防疫計劃時必須將它一起列入考慮 (8) 。
  副結核菌素:培養基必須做雜菌污染的抹片檢查。
  無致敏化副作用試驗時,必須用三隻沒有接受過任何會干擾這試驗的物質之天竺鼠,每隔5天皮下注入做成0.1毫升的溶液的0.01毫克待測副結核菌素,連續注射三次。在第三次注射之後的15 ~ 21天包括三隻對照的天竺鼠先前均未注射副結核菌素再皮內注射同樣劑量的副結核菌素。這兩組天竺鼠的反應在24 ~ 48小時之後觀察應該沒有明顯的不同。

2. 製造方法

 

疫苗:每一批疫苗的細菌必須生長在例如配方A (Formula A) 的液體合成培養基裡,這菌體會在這液體培養基表面長成一層薄膜。為了增加培養基的表面積,最好用圓錐形並至少有1/3的體積做好刻劃的玻璃瓶。這些玻璃瓶的種菌可以直接使用在馬鈴薯斜面上培養的種菌,但有些菌株可能需要經過液體培養基繼代一次以上,以期它能在製造疫苗的繼代過程中的液體培養基表面長成一層較好的菌膜。繼代培養的間隔不能超過二週以上,因為過長的培養期,會導致菌膜過於成熟而沉到液體底部。培養基的溫度是37℃。

製作菌苗時,分別將這培養兩週的不同種菌菌膜,輕輕地傾倒出來使它和液體培養液分開,過濾後再放在兩片濾過紙之間輕壓。這仍潮溼的副結核桿菌的培養再和如液體石臘、橄欖油和浮石等佐助劑混合 (5) 。

副結核菌素:做為皮膚試驗診斷之用的副結核菌素是由一種或一種以上的副結核桿菌菌株所製備出來的純化蛋白衍生物 (PPD) 。它可以用下列的方法來製備:

讓副結核桿菌菌株在液體Reid's液體培養基裡長成一層菌膜。生產培養用的菌株則是用來自液體培養基內的種菌,而不是直接來自固體培養基的種菌。生產用培養時可加入青黴素,瓶內並含有1/2量的培養液。將它們置於37℃之下培養10天。

在培養的末期,培養基的pH值約祗有5,如果不使pH值昇高的話副結核桿素的收穫量將會很少或甚至沒有,所以在放入蒸汽室之前用氫氧化鈉將pH值調整到7.3。在充份地攪拌混合後由蒸氣室取出,再用粗過濾 (coarse filtration) 的方法將菌體分離出來,這過濾出來之物質再經進一步的過濾。過濾物內所含的蛋白質用化學方法使之沉澱後洗淨並再次溶解。所製成的產品是用過濾的方法來滅菌。可加入某些抗微生物的防腐劑,例如石碳酸(不超過0.5%[重量/體積])不會造成假陽性的反應。甘油 (不超過10%[重量/體積]) 可以用來做為穩定劑。所製成的產品分裝於滅菌、密封的玻璃容器裡。

3. 過程中的品管

 

疫苗:培養時必須檢查生長的情形和培養的純化等問題。在收成時必須用傳統的無菌試驗並檢查是否有雜菌污染。仍未乾燥的培養先以佐劑混合並用生理食鹽水做10倍稀釋後注入動物體內做病原性分枝桿菌的初步檢查。這方法是用兩隻天竺鼠各注入1毫升,在觀察八週之後解剖檢查可能發生的病變。

副結核菌素:在最後一次過濾後,每批純化蛋白衍生物 (PPD) 溶液需做無菌試驗。

用Kjeldahl法來做這滅菌之濾過物的蛋白質含量 (1) 。最終產品的蛋白質含量調整在每毫升溶液內含有0.475和0.525毫克。pH值則調整在6.5 ~ 7.5之間。

4. 批次品管

  (a) 滅菌
 

如何滅菌及做無菌檢查請參考第1.4章。用傳統的無菌檢查方法,在正常的狀況下不會有雜菌的生長。


  (b) 安全性
 

疫苗:這些試驗通常都在實驗動物體內進行,但標的動物(target animal)用多劑量試驗的方法也可以得到滿意的結果。以下為典型的實驗動物試驗方法:皮下接種兩隻天竺鼠,接種量為牛之劑量的一定比例之疫苗後,接種部位祗出現塊狀,但沒有明顯的壞死時則此批疫苗被認為有足夠的安全性。接種的動物在觀察八週之後,解剖檢查是否有異常的病變。

副結核桿菌素:兩隻天竺鼠皮下各注入0.5毫升的副結核菌素。合格的安全性是在七內沒有發現明顯的局部或全身性的病變 (1) 。

副結核菌素的活菌檢查樣本可以在最後分裝到容器之前或從容器中取得的。最少需取得10毫升的樣本,它最少必須用兩隻天竺鼠來做腹腔內或皮下注射,並且每隻天竺鼠的注入量必須相同。最好用大量的樣本,例如用50毫升,用離心或薄膜過濾來濃縮殘留的副結核桿菌。天竺鼠必須經過42天的觀察,並且要做死後的病變檢查。任何肉眼可見的病變必須再做顯微鏡檢並且做培養。


  (c) 力價
 

疫苗:因為做動物保護試驗似乎不切實際,所以改用致敏化能力試驗 (sensitising ability) 來取代。其力價與其含菌量(以重量計)有關,它的典型試驗方法如下:疫苗用液體石蠟稀釋100倍後取0.5毫升肌肉注射於天竺鼠。在注射後六週進行皮膚試驗:至少用三個序列稀釋倍數的副結核菌抗原(例如副結核菌素純化蛋白衍生物) (PPD) ,並取其中0.2毫升做皮內接種,它會產生直徑從8毫米到25毫米的皮膚反應。天竺鼠的腰窩間分成數個不同濃度的接種部位,接種部位的佈置方法是以拉丁方格 (Latin square) 來設計的。經過24 ~ 48小時之後檢查皮膚反應的結果。這個試驗方法到目前為止還沒有一個標準方法可供參考。因為禽結核桿菌純化蛋白質衍生物已經有公認的國際單位量 (international unitage) ,所以可以用它做抗原進行皮膚試驗,以確保疫苗刺激足夠的抗體產生。

副結核菌素:副結核菌素的力價目前是用Kjeldahl方法做化學試驗來測試其蛋白質。最後產品的純化蛋白質衍生物的含量推薦是 0.5+0.025 毫克/毫升 (1) 。

要確認其含量時,必須用小劑量在皮內注入已受激化的天竺鼠(在六週前注射過副結核桿菌死菌)。

也可用經過副結核桿菌激化的天竺鼠以稀釋的副結核菌素來做它的力價試驗。這個試驗和測定牛和禽結核菌素力價的方法相同,但是到目前為止這一類型試驗的標準方法還未被建立。


  (d) 免疫有效時間
 

疫苗:當疫苗接種於14 ~ 30日齡之後,接種過疫苗動物的糞便中病原菌的排除量比未接種的動物有明顯地減小的現象 (11) 。

有效的疫苗可以讓暴露於病原菌底下之動物因其排泄物中的病原菌大量減低的結果而使發病的機會亦大為減低。但接種疫苗的動物並無法全部避免病原菌的感染。


  (e) 穩定性
 

疫苗:疫苗可以貯存在 2 ~ 8℃ 之下達 9 ~ 12 個月而不會損及其力價。疫苗不可以冷凍。

副結核菌素:副結核菌素避免光照,並需要貯存於 2 ~ 8℃。在以上的貯存條件下可以使其力價保持至少五年。


  (f) 防腐劑
 

在多劑量疫苗容器裡經常都放有防腐劑。保存副結核菌素是用不高於0.5% (重量/體積) 的石碳酸。在保存期間,最後成品內所含的防腐劑濃度和它的持續性都必須做仔細的檢查。


  (g) 注意事項(可能的危險)
 

疫苗:疫苗會造成一些副作用、結節 (nodule) 的產生和激化動物引起對結核菌素試驗的過敏反應 (8) 。在人方面,如果意外情形下注入疫苗會造成慢性的炎症反應而導致需做外科手術處理 (11) 。

5. 成品的測試

  (a) 安全性
 

參考第 B.4.b 節。


  (b) 力價
 

參考第 B.4.c 節。

˙ 致 謝

  本章的一部份是摘錄自或參考 1992 年版手冊 (Manual) 中的副結核病一章。它最早的作者是N.J.L Gilmour和G.W. Wood。

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