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牛邊蟲病
Bovine anaplasmosis
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兩種邊蟲(Anaplasma)之一的感染都可能會導致牛邊蟲症(Bovine anaplasmosis – A. marginale(邊緣)和 A. centrale(中央)但大部份會暴發臨床疾病幾乎都是因為 A. marginale 所造成。這病原體可歸類為 Rickettsiales Anaplasmatacea 科中之 Anaplasma 屬。

邊蟲症的特徵性症狀是貧血和黃膽,但是這疾病祗能藉由確認它病原菌的存在來做為診斷的方法。一旦感染牛隻可能終身成為帶原者(carriers),診斷這疾病的方法可藉血清學的試驗來檢測它們特異性抗體或是用特異性核酸探測(specific nucleic acid probes)來檢測蟲體的DNA

病原體的鑑別:鑑別邊蟲最常用的方法是用顯微鏡做血液檢查或是用 Giemsa 抹片染色檢查。A. marginale 在抹片中可看到顏色較濃、圓形、直徑約 0.3 ~ 1.0μm 寄生於紅血球之內的蟲體,它們大部份都位於或靠近紅血球的邊緣。A. centrale的外觀和 A. marginale 都很相似,但它們大部蟲體的位置都遠離紅血球的邊緣。有些國家在商業上已有針對邊蟲的快速染色劑。

抹片的製備必需非常小心,並且不能有外來異物存在。從活的牛製備抹片時最好是從頸靜脈或是其它較大的血管採血。做死後檢查所製備的抹片則必需從內臟器官(包括肝、腎、心和肺) 以及從周邊血管中採取樣本。假如死後的屍體開始明顯溶解的話用後者的採血方法會更好,而且在這種情況下最好用直接螢光抗體染色法(direct fluorescent antibody)。

血清學試驗:最廣泛被使用的血清學試驗是補體結合試驗(complement fixation test)和卡片凝集試驗(card agglutination test)。這些試驗的敏感度和特異性會存在一些差異,所以在現場時必需小心地評估各種情況。酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)、點式酵素結合免疫吸附試驗 (dot ELISA) 及間接螢光抗體試驗 (indirect fluorescent antibody test)都可以用來做為診斷的工具。

核酸-基礎試驗(nucleic acid-based tests)是最近發展出的試驗方法,它可以診斷出低感染量的潛伏性帶原牛(carrier)和媒介壁蝨(tick vectors)上之蟲體。目前它們主要被用在實驗室裡做為診斷的工具,它可以配合血清學試驗做為更進一步的確診之用,並且可以在鑑別帶原牛和做為流行病學研究時提供一項非常有用的標準化試驗。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:許多國家已使用活的或不活化疫苗來預防牛隻受 A. marginale 的感染。含活的 A. centrale 蟲體的疫苗最廣泛被使用,它可以部份地預防受有毒性的 A.marginale 之感染。

A. centrale 所製備的疫苗是以低溫或冷凍的方式保存。冷凍疫苗由於可以有效地保持疫苗之品質並且可以預防被其它病原的污染因此常被推薦使用。

Centrale 疫苗並不完全具有安全性,所以一般祗先推薦使用於仔牛,它可以藉非特異性的免疫反應來減低疫苗的不良反應,這種情況發生時可能需要用四環素(tetracycline)或亞胺碳(imidocarb)來治療。經過一次疫苗注射之後的 6 ~ 8 週可以產生部份免疫,並且可以維持數年之久。在美國已有經不活化 A. magrinale 製備成的商用疫苗可供使用。

 

A.

牛邊蟲症的爆發常是因為感染 Anaplasma marginale 的緣故。 A. centrale 的感染祗能造成中等程度的貧血症狀,但在野外則很少爆發臨床症狀。在分離出的 A. marginale 中已發現有邊蟲蟲體本身和其它伴隨蟲體(appendages)(14),它曾經被命名為 A. caudatum,但事實上是否能構成一個有效的品種則仍有疑問。

A. marginale 最常發生於熱帶和亞熱帶國家,和一些溫帶的區域。 A. centrale 最初是發現在南非,然後再經由進口對抗 A. marginale 的疫苗而傳播至其它的國家包括澳洲和一些南美、東南亞和中東等國家。

Anaplasma spp. 最早被認為是屬於原虫的寄生蟲,但後來研究發現它並不符合原虫的特性。所以後來它們被歸類於 Rickettsiales 目中之 Anaplasmatacea 科。這個科有:AnaplasmaAegyptianellaHaemobartonella Eperythrozoon (24)

Anaplasma spp.是藉著節肢動物之媒介體(vectors)的機械或生物方法來傳播。有一個非常詳細的傳播途徑之研究報告指出,有 14 個品種的壁蝨可以用試驗方法來傳播 A. marginale (15)。這些品種的壁蝨是 Argas persicusOrnithodoros lahorensisBoophilus annulatusB. decoloratusB. microplusDermacentor albipictusD. andersoniD. occidentalisD. variabilisHyalomma excavatumIxodes ricinusRhipicephalus bursaR. sanguineus R. simus 但作者認為在這些品種之中 R. bursaH. excavatum O. lahorensis 等並還未被完全確定,而被鑑定為 A. persicus 之品種也可能是 A. sanchezi 或是 A. radiatus 另外,在南非Rhipicephalus e. evertsi Hyalomma m. rufipes 在實驗中被證實可用來做為傳播的媒介體(22)。實驗中雖然有少數可經由卵巢(transovarial)傳播,但它經常都是在運動場上傳播的,即使祗有一種宿主的 Boophilus 之品種也不例外。雄性壁蝨可能是比較重要的媒介體。 由實驗的結果來看媒介體的活動力並不和傳播速度有必然的關係。 在澳洲和非洲等國家 Boophilus 品種的壁蝨是傳播邊蟲症的重要媒介體,另外,也有很明顯的證據顯示一些如Demacentor 的品種在美國是重要傳播媒介體。

其它各種不同叮咬性的節肢動物也會以機械方式傳播邊蟲症,特別是在美國這情形特別明顯。在實驗的情形之下已證實許多品種的Tabanus(馬蠅)和Psorophora 屬的蚊子都可以充當傳播的媒介體(23)。自然環境下傳播邊蟲症的叮咬性昆虫所扮演的角色目前仍未有充足的資料,但視每個地區的不同似乎有很大的差異。A. marginale 也可以藉著在施打預防其它疾病的疫苗時而傳播,所以在預防注射的時候必需每隻動物都使用乾淨的針頭。同樣的,其它未經消毒的外科儀器也會經由機械途徑而傳染。

主要 A. centrale 的生物方式媒介體似乎是多種宿主的壁蝨,特別是在非洲最明顯,它包括 R. simus 在內之壁蝨都是經由這個方式來傳播的。但是平時常見的牛壁蝨(B. microplus)並未被證實為是此種方式傳播的媒介體。這之所以在 B. microplus為害地區用 A. centrale 來做為疫苗防疫本症有很大的關聯性。

邊蟲症最明顯的症狀是貧血和黃膽,而黃膽常是在疾病發生後較晚才出現。邊蟲症不會出現血色素血症(haemoglobinaemia)和血色素尿(haemoglobinuria),所以它可以此來和焦虫症(Babesiosis)做鑑別診斷。焦虫症通常是在同一區域出現的一種地方性疾病。邊蟲症唯一能確診的方法是診斷出它們病原體的存在。

1.         病原體的鑑別

從死亡動物身上所取得的樣本必需包括由肝、腎、心、肺和周邊血管所採集的乾燥薄抹片。假如無法在動物死亡之後立即做屍體解剖的話,則採集的樣本最好是由周邊的血管,因為器官在這種情況下都會受到細菌的污染而使得鑑別邊蟲症的工作更加困難。用於診斷焦虫症的大腦抹片並不適合用來做為邊蟲症的診斷(12),但是它可用來做為和焦虫症的鑑別診斷之用。

製備抹片最好來自器官的血液而不是器官的組織,因為如此才可由完整的紅血球來觀察邊蟲的存在。器官的抹片可在室溫下放置數天之久而不影響其觀察的效果(12)

由活的牛所得到的樣本包括血液薄抹片和加入抗凝劑所採集到的血液。空氣風乾薄血液抹片可置於室溫之下至少一週仍有滿意的觀察效果。加抗凝劑的血液樣本則在製備抹片之前需貯存於 5之下。它可以在當製備的血液抹片沒有預期的效果時做為預備之血液樣本。另外,由於它有較低的濃縮紅血球容量 (PCV) /或紅血球數目所以對於在這疾病的恢復期祗有出現少許的蟲體之時較容易檢查出本病的蟲體。

和牛寄生蟲(Babesia bovis)比較,由於邊蟲蟲體較不容易在微血管內的血液中被發現,所以從頸靜脈或較大血管所採集的血液來製備抹片比較能得到滿意的結果。由於邊蟲的形態不容易觀察,因此抹片不能混有其它雜質,如果含有殘渣雜質之污點的話可能在診斷時會產生混淆。用於檢查焦虫症的厚血液抹片(thick blood films)並不適合用來診斷邊蟲症,因為一旦邊蟲從紅血球中游離出來便很不容易被觀察出來。

由血液和器管所製備的抹片都用無水甲醇(absolute methanol)固定 1 分鐘後再用 10% Giemsa 染色液染色30 分鐘。染色後用自來水沖洗 3 ~ 4 次使除去多餘的染色液,然後再讓其自然風乾。抹片在油鏡下用 x 700 ~ 1,000 倍觀察。

Giemsa 染色的抹片, A. marginale 的形態呈顏色較濃、圓形、直徑約 0.3 ~ 1.0μm 寄生於紅血球之內的蟲體。這些蟲體大部份都位於或靠近紅血球的邊緣。 A. marginale 和 A. centrale 兩者的區別是後者的蟲體大部份都位於紅血球的中央。許多國家都是藉適當的染色劑來做邊蟲的快速染色檢查。

紅血球被感染的比例得視這疾病的階段和嚴重程度而定。當感染 A. marginale 時最嚴重的寄生蟲血症(parasitaemias)是超過 50% 的紅血球都受到感染。此時單一個紅血球內經常同時感染多個蟲體。

當疾病在進展的過程中,連續約 10 天的時間裡蟲體每天以成倍的數目繁殖,達到高峰後再以同樣的速率減少下來。在血液抹片裡無法檢測出蟲體時,動物可能會持續數週相當嚴重的貧血現象。從感染中恢復後的大部份牛隻可能會變成潛伏狀態,並且終生感染。

螢光抗體染色(fluorescent antibody stain)可以做為另外一種選擇的染色法。它主要是應用於由死後動物身上所製備的抹片,因為它比 Giemsa 染色有更高的敏感度(12)。以直接螢光抗體從死後動物所採集之樣本來診斷邊蟲症的方法在Johnston 等人的報告中已有非常詳細的敘述 (12)。簡單地說它的步驟是血液或器官製成的薄抹片用丙酮固定10 分鐘後置於空氣中乾燥。加入取自純邊蟲感染牛血清分離出的球蛋白並標示異硫氰酸鹽螢光素(fluorescein isothiocyanate-labelled),並置於 29℃ 及高相對溼度下感作30 分鐘。將這抹片用 pH7.2 之 0.012 摩爾的磷酸緩衝溶液(PBS)洗 5 分鐘,並連續洗兩次。在抹片仍潮溼的情況下將蓋玻片蓋上,置於螢光顯微鏡底下觀察。

一個較昂貴的診斷方法是用被疑為受感染動物之血液注入於切除脾臟的仔牛,這個方法常被用來做為本病的確診之用,特別是用在診斷潛伏性感染的情況時。它是用約500 毫升被疑為受感染動物的血液在加入抗凝劑之後以靜脈注入切除脾臟的仔牛,接種後至少每隔 2 ~ 3 天做一次血液抹片檢查。一般約四週後,但有時候會多達八週以上,如果這切除脾臟的仔牛的血液抹片出現有邊蟲時則證實感染了邊蟲症。

最近發展出用核酸-基礎(nucleic acid-based)的試驗用來診斷 A. marginale 的潛伏性感染。另外,也有用放射性 RNA 探測(radioactive RNA probe) 的方法來診斷,它在濃度低至 0.000025% 的寄生蟲血症下之血液都可以診斷出來(9)。另外一種用聚合酵素鏈反應 (PCR)- 基礎的解析敏感度方法,可以測出 0.0001% 的被感染紅血球,而在這濃度之下事實上祗有一小部份的帶原者可以被檢查出來(10)。受感染的壁蝨也可以用同源 DNA 探測法(cloned DNA probe)來診斷(11)。

核酸-基礎(nucleic acid-based)的試驗如果用在疾病出現後的發展期時可以做為將來診斷和流行病學的研究參考。

2.        血清學試驗

邊蟲感染恢復後經常都變成終身感染的帶原者。但是,除了偶而有復發的情形之外,大部份在疾病恢復後即無法由血液抹片中檢查出邊蟲。所以,發展出一些血清學的方法來檢查這些潛伏性感染的動物。

邊蟲症的血清學診斷上的特性是在許多的研究報告上它們不管在敏感度或是在特異性上的差異都很大。它們主要的原因是缺乏對這些試驗做完整的評估之故,特別是對這疾病的長期存在之感染特性的檢測能力。本節所述及的試驗最適合用來做為廣泛的資料建立之用,比方用於流行病學的研究。在做為證明疾病感染之用途時必需要非常小心,除非這試驗已做了適當的評估並配合當地區的情況已經加以標準化。

另外,必需注意的是在 A. marginale A. centrale 兩者之間在血清學方面存著很高的交叉反應的現象。由於診斷用的抗原往往是來自同源和異源的品種,所以在許多情況下所得到的結果常常很難加以判斷。

(a)       補體結合試驗

這試驗是按照標準的補體結合(CF)試驗方法來進行的。經過紅血球溶血(例如在French加壓細胞)後所取得的含邊蟲蟲體之抗原,將它們洗淨並去除血紅素和細胞殘渣。現在最常用的方法是微滴定技術,因為它們祗要使用很小的量來滴定。補體結合試驗的標準(3)和微滴定(4)之操作技術已經被確立了。雖然多年來補體結合試驗已經被廣泛地使用,但是越來越多的證據都顯示它的敏感度很差,而且無法有效地診斷出帶原者的感染。

(b)       卡片凝集試驗

卡片凝集試驗(card agglutination test, CAT)的優點是它的反應很敏感、試驗可以在實驗室裡或野外進行以及它可以在幾分鐘內就得到試驗結果。它的缺點是可能會發生非特異性的反應。CAT 抗原是 A. marginale 粒子的懸浮液。它是用至少 109 邊蟲感染的紅血球之血液以靜脈接種的方式注入切除脾臟的仔牛體內。當產生邊蟲的寄生蟲血症超過 50% 時,將這仔牛宰殺後取其紅血球,並經過洗淨、溶血後取其成塊的邊蟲粒子。最後將它用超音波振盪處理後洗淨再放入染色溶液裡重新製成抗原的懸浮液。

這試驗是將原來的方法稍微加以改良,其操作方法如下:

(1) 所有試驗的成份在使用前都必需置於室溫(25 ~ 26℃)底下(保持這固定的室溫對這試驗來說是非常具關鍵性的)。

(2) 在這測試卡片的每一圓圈裡 (一個上面劃有許多直徑18毫米小圓圈的透明塑膠或玻璃片)放入 0μl 的牛血清因子(bovine serum factor, BSF)、10μl 的測試血清和 5μl CAT 抗原。每一圓圈內的液體不能觸碰在一起。每一張卡片上必需有陰性和弱陽性的對照血清。

BSF血清是選自已經有高粘合素(conglutinin)的動物血清。假如不知道粘合素的濃度的話也可以使用沒有感染邊蟲健康動物之新鮮血清,一般均用 Jersey 品種的仔牛。BSF必需以等份的小量貯存於 -70℃ 之下,每一次試驗時取一份使用。使用BSF的目的是使試驗增加敏感度。

(3) 用玻璃攪棒將它攪拌均勻。在每一次的混合之後用乾淨吸紙將攪棒擦拭乾淨以免互相污染。

(4) 將這試驗卡片放置於有溼度的密室裡,以 100 ~ 110rpm 搖動7分鐘。

(5) 立刻在有光照背景下判讀。抗原形成特殊的凝集現象(分成 1+ 3+等數級)時則判定為陽性。如果沒有特殊的凝集現象時則判定為陰性。

(c)        酵素結合免疫吸附試驗

酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)是用正常的紅血球抗原(陰性抗原)和感染 A. marginale 的紅血球抗原(陽性抗原),它們已被證實對偵測A. marginale感染的血清有相當可靠的結果(8)。雖然它祗使用單一種抗原來源,但是它可以除去那些因對正常紅血球成份所產生的自體抗體(iso-antibodies)之非特異性但具有高濃度反應強度的血清。這試驗可以正確地鑑別出 100 種來自感染 3 年後之牛的已知陽性血清,3%的陰性血清、2% Babesia bovis 4%B. bigemina 血清得到陽性的結果。這單一抗原ELISA 的非特異性反應之問題可以因這已知的副單位抗原(defined subunit antigens)而得到解決的辦法,特別是對重組抗原(recombinant antigens)而言更是如此。另外一種競爭抑制(competitive inhibitionELISA 的反應是利用一主要表面蛋白之重組和一單源抗體(monoclonal antibody)26),它將來也可以做為一種可靠的診斷方法。

這兩種抗原的操作方法如下:

˙ 陰性抗原

收集切除脾臟之仔牛的血液,並放入鈉乙二胺四醋酸(EDTA)裡。紅血球用 PBS 清洗三次,並在 5℃ 下用 5,000g 離心10 分鐘。在最後一次離心之後用 PBS 稀釋10 倍並使之通過 Whatman CF11 纖維素玻璃柱的方法將白血球除去。再一次離心,並將一份體積的紅血球用兩份體積的 PBS 稀釋,並將之分裝成等份的 2.5 毫升容器然後置於液態氮裡。需要時將它置於室溫下使之溶化,並在 0℃ 及 100W 下超音波振盪 30 分鐘。最後再稀釋成在 ELISA 中所需使用的量即可。

˙ 陽性抗原

用之前做為生產陰性抗原的仔牛以接種的方式使之感染 A. marginale。當它到達寄生蟲血症 80 ~ 85% 時採取 500 ~ 1,000 毫升的血液,並按照前面所述的方法操作和貯存。當需要時取出來如以上所述處理,並做適當的稀釋即可。

˙ 試驗步驟

使用平底 96- ELISA 微量反應盤(flat-bottomed 96-well micro-ELISA plates)。陽性和陰性的每一批新的抗原用標準抗原做棋盤滴定 checkerboard titrations),並決定其操作範圍,它通常是 1 400150 ~ 200μg蛋白質/毫升)。將稀釋的抗原(200μl)加入到反應盤的每一個小孔內,一半的反應盤做為陽性,另一半的反應盤則做為陰性的測試。這反應盤用玻璃膠帶密封,並在 4℃ 下放置隔夜。之後移除抗原溶液,並用含 0.1%的 Tween 20 的 PBS(PBST)將這反應盤洗三次,最後用 1% 含正常馬血清的 PBS 溶液在 37℃ 下作用 60 分鐘使其作用停止。

阻止作用之後,在加入 200μl 的測試血清(測試血清用含 1% 馬血清的PBST 稀釋成 1/400 到 1/800)之前,用PBST 將反應盤洗五次。這反應盤用玻璃膠帶密封並在 37℃ 下感作 2 小時。接著將小孔用 PBST 洗五次,然後加入 200μl 用含 1% 馬血清的 PBS 稀釋成 1/400 的軛合第二抗體(用辣根過氧化物酵素軛合的山羊抗-牛免疫球蛋白G )。再將這反應盤密封並在 37℃ 之下感作 2 小時。在感作之後,將這軛合物移除,並在加入 200μl 製備好的新鮮基質(substrate)之前,用 PBS 將小孔洗五次。

基質是用下列方法製備而成:再結晶的 5- 氨基水楊酸以 1 毫克/毫升的比例溶化於 pH6.8 37的磷酸緩衝液裡,然後每1毫升的溶液裡加入 2μl 30% 過氧化氫。在加入基質之後將這反應盤密封並在 22下輕微攪拌 30 分鐘。反應盤於是立刻在 492nm 下用反應盤判讀器(plate reader)來讀結果。每一個反應盤的第一欄經常都被用來做為對照(blank)。

每個樣本的淨讀數(net readings)的計算方式是陽性抗原的結果減去陰性抗原的結果。約 20 個陰性血清和標準 A. marginale 陽性血清都被用來做為每一批試驗的例行配置。計算出這 20 個標準陰性血清的平均淨吸附讀數 (mean net absorbance reading)(加上二標準偏差)做為它的 門檻threshold)。所有其它的淨吸附量的決定是根據這 門檻來使其有一致性。陽性血清則是被用來決每一批的試驗是否在正常狀況下操作。

(d)    點式酵素結合免疫吸附試驗

ELISA 比較點式酵素結合免疫吸附試驗(dot ELISA)更具快速、便宜和操作簡單的優點。以下所述的 dot ELISA 已知具有高達 93% 的敏感度和96%的特異性(18)。

˙   抗原的製備

(1) 收集高寄生蟲血症的血液放入含EDTA的容器裡。

(2) 除去血漿,並用 pH3.0 的 0.1 摩爾甘氨酸緩衝液(glycine buffer)清洗紅血球。

(3) 用 pH7.4含朊酵素抑制劑 (3.5mM 連四硫酸鈉)和 0.01% 鈉乙基汞化水楊酸鹽(thiomersal)的PBS清洗紅血球。

(4) 在每次清洗後移除這血塊黃層。

(5) 紅血球重新用 PBS 製成 1/5 的稀釋液,超音波振盪後並經過三次冷凍溶解過程,這溶解物再做一次超音波振盪。

(6) 再用等量含 1%Nonidet P-40 的 PBS 混合後培養在 25℃ 下 3 分鐘。

(7) 邊蟲蟲體用分層離心法將之收集起來。

(8) 將這蟲體塊用冷的緩衝液(155 mM 氯膽鹼,5 mM HEPES〔N-2-烴乙基對二氮己環,N-2-乙磺酸〕, pH7.4)清洗三次。

(9) 這蟲體塊用 PBS 再重新製成懸浮液,並測其含蛋白質的濃度。

抗原(1.0μl / 圓盤,25μg 蛋白質/毫升)被點附於圓盤上(直徑6毫米)並用紙自硝化纖維處切開。含抗原的圓盤讓其自然風乾。在圓盤上的抗原若保持在 -20℃ 或4 ℃ 之下可維持2年的穩定性,如果保持 25℃ 則至少可維持 3 個月。

˙    試驗步驟

(1) 將抗原點附的圓盤放在平底微量反應盤內的小孔。

(2) 所有的過程都在 25℃,並且用 200μl 的作用容量。

(3) 必需包括已知的陽性和陰性血清以及對照的抗原。

(4) 用含 0.5% Tween 20 的PBS 加入每一個小孔裡,並感作 15 分,來使作用停止。

(5) 用最初 1/200 的稀釋濃度,並在含 0.05% Tween 20 之PBS 下感作1 小時來測試血清。

(6) 用含 0.1% Tween 20 的 PBS 做三次 10分 鐘的清洗。

(7) 將鹼性硫酸酵素蛋白A軛合物 (alkaline phosphatase-protein A conjugate)用含 0.5% Tween 20 的 PBS 稀釋至 1/500,並加入小孔感作 30 分鐘後,除了最後一次是用 PBS 之外其餘都照前面所述的方法清洗。

(8) 加入 0.1摩爾pH9.5 含硝藍四唑/5--4--引羥磷酸(nitroblue+etrazolium/5-bromo-4-chloroindoxyl phosphate)的 tris 緩衝液,並使其有 10 ~ 20 分鐘的著色時間。

(9) 呈不同密度的紫色點時表示是陽性反應,圓盤上沒有顯示顏色時表示是陰性反應。

(e)       間接螢光抗體試驗

間接螢光抗體試驗(IFA)祗能由一人操作在一天完成,所以它在診斷的數量上受了很大的限制,所以一般來說,較喜歡用其它的血清學試驗方法。此試驗的操作方法和第 3.2.8 章牛焦虫症的方法一樣,但這裡則是用 A. marginale 感染的血液來製備抗原血液抹片。這試驗主要碰到的問題是它的非特異性螢光反應。在發生寄生蟲血症(5 ~ 10%)之後所採得血液最適合用來做為本試驗的抗原。在製備抗原抹片之前用酸性甘氨酸緩衝液來清洗紅血球可以減少因抗體附著於被感染的紅血球而導致的非特異螢光(19)。感染的紅血球用 0.1 摩爾的甘氨酸緩衝液(pH3.0,在 4℃ 下 1,000g 離心15 分鐘)清洗二次然後再用 pH7.4 PBS 清洗一次。

B. 疫苗和診斷用生物製劑之必要條件

許多有邊蟲症地方性疾病流行的國家都曾用許多不同的免疫方法來防止邊蟲的感染,但到目前為止沒有令人滿意的結果(16)。用病原性較低的 A. centrale 來做疫苗是最廣泛被使用的方法,它可以和 A. marginale 產生交叉免疫的效果,但北美國家並未用它來做為疫苗。在澳洲每年大約使用 700,000 劑量的 A. centrale 疫苗。另外的方法是用 A. marginale 藉著在牛以外的動物,如鹿或羊等(25)的繼代方式來使其減低毒性而製成的疫苗。在美國有商用的不活化疫苗。在乳牛方面有發生過因接種不活化疫苗而導致初生仔牛有自體溶血的疾病,但由於在製造技術上的改進可以使這問題得到解決。

本章是以 A. centrale 製造的活毒疫苗來舉例說明。它包括了感染有感受之切除脾臟的仔牛和如何取得它的血液來製造疫苗。所有製造過程中的詳細內容除了根據本章所述之外也可以看參考文獻(56)。

A. centrale 疫苗可以視實際需要、輸送過程和液態氮或乾冰的取得容易與否來決定用冷凍或低溫的方式貯存。在大部份的情形裡都用冷凍的方式保存,因為這種保存方式可以使每批生產後的品質做全程的控制,但是它的缺點是輸送成本較高並且比低溫保存方法較不容易輸送。產品必需對可能的污染做嚴格的控制,但同時也會增加它的成本。

1.         種菌的管理

(a)       種菌的特性

A. centrale 1911 年在南非被分離出來,然後在南美洲、澳洲、非洲、中東和東南亞等地區被用來做為疫苗。它能對中等毒力的病原(例如澳洲)提供部份但適當的保護(5)。在潮溼的熱帶地區由於 A. marginale 可能會有很強的毒力,所以由 A. centrale 所製備的疫苗對某些動物來說可能仍不足以保護動物免受感染。

A. centrale 通常祗會造成溫和的感染,特別是用在 9 個月以下的仔牛時。曾經有報告說當它接種於成牛時會有嚴重的反應發生。

在切除脾臟的仔牛體內經過快速繼代之後會使A. centrale 的毒性減低 5)。

(b)       穩定物的製備和貯存

具感染性的材料可貯存於液態氮或乾冰使其成為冷凍之穩定物。二甲亞(Dimethyl sulphoxide, DMSO)因為可以在穩定物溶解後一同由靜脈投與血管,所以常被推薦用來做為低溫保存劑(cryopreservative)。其它有一些關於這冷凍技術的報告(5),但這裡簡單摘要如下:收集被感染的血液,置於 4℃ 下並在攪拌下緩緩加入低溫保存劑 (4 摩爾 DMSO 溶於 PBS),調配成血液/低溫保存劑的比例為 1:1,DMSO 的濃度最後成 2 摩爾。全部稀釋的操作過程是在冰浴下進行的,這稀釋的血液最後被分裝到合適的容器裡 (例如,5 毫升的低溫試管),並儘快置於液態氮的容器裡加以冷凍保存。

(c)        合格的疫苗

A. centrale 所製成的疫苗是否適合使用可以用接種到有感受性的動物身上來做實驗。先觀察它對疫苗的反應情形,然後用具有毒力的當地 A. marginale 來攻擊。在過程中用染色的血液抹片來觀察它產生寄生蟲血症的情形,並且由它呈現出的濃縮紅血球容量(PCV)來判斷此疫苗的安全性和有效性。可以牛血清來做血清學試驗以測定這分離物純化的程度,供為安全性的參考,並且避免過程中可能的污染。

2.         製造方法

(a)       冷凍疫苗的生產

將小玻璃管浸入預熱至 40的水中,使這一定量的冷凍穩定物(5 ~ 10毫升)溶解。這溶解後的物質置於冰中儘速使用(在 30 分鐘內)以靜脈接種於具感受性且切除脾臟的仔牛身上。

每天自頸靜脈採血做染色抹片檢查,以隨時掌握仔牛產生寄生蟲血症的情形。1 x 108 / 毫升 (頸靜脈血液約含 2% 的蟲體)的蟲體是製造疫苗時所需的最低蟲體含量。如果沒有辦法達到這個蟲體量時,必需再以 100 ~ 200 毫升的血液接種到第二隻切除脾臟的仔牛身上做次繼代。

用套管針由頸靜脈或頸動脈處以無菌方式採集血液,並加入肝素(heparin)做為抗凝劑(5國際單位肝素/毫升血液)。

在實驗裡這感染血液用等量含3摩爾甘油和5毫摩爾葡萄糖的 PBS 37下稀釋(甘油最後的濃度是 1.5 摩爾)。這稀釋液放置於 37 30 分鐘使其均衡化後再分裝到適合的容器裡(例如5毫升的低溫小玻璃管)。這些小玻璃管再用液態氮以每分鐘 10的速度加以冷凍,並以液態狀況貯存(7)。

在有甘油的情況下可以用 DMSO 來做為低溫保存劑。它的操作方法和製備穩定物的方法一樣(1720)。

假如要稀釋甘油化的疫苗,這稀釋劑必需含1.5摩爾的甘油和5毫摩爾葡萄糖的PBS13)。用 DMSO 低溫保存的疫苗如果要再做稀釋時,必需要用原來低溫保存之血液一樣濃度的 DMSO21)。

(b)       低溫疫苗的生產

低溫疫苗的生產方法和冷凍疫苗的生產方法相同,但它們必需在最短的時間內使用完畢。這感染的血液必需稀釋至每劑含 1 x 107 蟲體的疫苗。最合適用來做為稀釋劑的溶液是以平衡的鹽溶液所配成之 10% 滅菌牛血清,這平衡的鹽溶液每公升裡含有下列成份的鹽類:NaCl7.00公克)、MgCl2.6H2O0.34公克)glucose (1.0公克)Na2HPO42.52公克)、KH2PO40.90公克)和NaHCO30.52公克)。

假如無法取得稀釋液的話也可以用檸檬酸右旋葡萄糖(acid citrate dextrose)(20%〔體積/體積〕)或檸檬酸磷酸右旋葡萄糖(citrate phosphate dextrose)(20%〔體積/體積〕)來做為抗凝劑,並提供適量的葡萄糖作為蟲體活存之用。

(c)        疫苗的使用

使用冷凍疫苗時必需先將含疫苗的小玻璃瓶置於預熱至 40的水中溶解,並用適當的稀釋液稀釋成所需的濃度。如果是製備成甘油化的疫苗時必需將它保存在低溫之下,並且在 8 小時之內使用完畢 7)。假如是用DMSO 做為低溫保存劑的話,疫苗一定要用冰塊保存,並且在 15 ~ 30 分鐘內使用完畢(20)。

低溫保存疫苗一定要置於冰箱,並且在製備好 6 天內使用完畢。

疫苗所使用的 A. centrale 雖然是經過減毒,但並非絕對安全。因此建議當可以利用非特異性的免疫反應時儘量減少疫苗的使用。較大的動物注射疫苗時會有嚴重疫苗反應的危險,雖然它們不是經常都會出現,但是如果用在經濟價值較高的種畜或懷孕動物身上時,必需在注射疫苗後的第 4 6 週之間仔細觀察它的反應。臨床上衰弱的動物必需同時投與推薦劑量的氧四環素(oxytetracycline)和亞胺氮(imidocarb)。

免疫的保護效果會在 6 ~ 8 週內產生,並且通常可維持數年之久。

邊蟲和焦虫的疫苗經常都同時使用,但我們建議不可和其它的疫苗一起使用。

3.         過程中的控制

(a)       疫苗生產動物的來源和維持

使用沒有感染邊蟲和其它任何由壁蝨媒介之疾病的仔牛做為培養製造疫苗之邊蟲的來源。假若以上的仔牛不容易取得時,另一個辦法是將仔牛養在沒有壁蝨感染的環境裡,特別是用在製造疫苗的仔牛更需要如此。

這仔牛必需養在沒有任何傳染病和壁蝨以及可能叮咬的昆虫之環境裡。如果沒有合適的飼養設備時可能會變成這當地傳染性疾病的傳播來源,所以地區性製造的疫苗的優點必需要和它以上所提及之可能產生的危險之間做一個客觀地評估(5)。

(b)       外科手術的操作方法

做為生產蟲體的仔牛必需切除其脾臟以便使其產生最大量的蟲體來製造疫苗。手術前最好按照一般的外科手術的麻醉方法來麻醉仔牛。其它詳細的外科技術,包括手術前和手術後的過程請參考文獻報告(5)。

(c)        接種前仔牛的篩選

做為接種用的仔牛必需檢查是否沒有疫苗生產地的任何經血液感染的疾病,它包括寄生蟲、邊蟲病、小型焦蟲病和錐蟲病等。檢查的方法是在做脾臟切除手術之後定期做血液染色抹片檢查,如果可能的話也做血清學的檢查。如果發現任何仔牛感染了以上所提的疾病時必需將之淘汰。同時也要檢查是否感染任何其它的疾病,這些疾病包括牛地方流行性白血球增生病、粘膜病、牛傳染性鼻氣管炎、赤羽病 Akabane disease 、牛流行性熱(ephemeral fever)、藍舌病、口蹄疫和牛瘟等。檢查的方法得視這疾病在當地的流行情形以及可用的診斷方法取得的方便程度,但最後都至少要做成對血清的血清學檢查,在某些情況還得做病毒的分離鑑定(720)。

(d)       接種後寄生蟲血症的監控

必需測出血液中蟲體的濃度。蟲體的數目已有精確的計數方法(5),但也可以藉計算紅血球的數目和依照寄生蟲血症(感染紅血球的百分比)的情形來算出感染的蟲體的濃度。

(e)       血液的採集

所有的儀器在使用前必需經過確實的滅菌處理(例如經過高壓滅菌鍋處理)。一旦到達所需要的寄生蟲血症時用含有肝素的容器在嚴格的無菌操作下採集血液。最好是將仔牛麻醉後用封閉的採血迴路系統(closed-circuit collection system)來操作。

六個月的仔牛約可採集到 3 公升高度感染的血液。如果這頭仔牛要讓它繼續活存的話則必需用適合的血液再做輸血,否則這仔牛在採取全部血液之後必需立刻撲殺。

(f)         疫苗的分裝

所有的操作過程必需在適合的環境下進行,例如在薄板狀的流動箱 laminar flow cabinet 內,並且必需依照標準的滅菌程序。並且在分裝的過程中用機械或磁性攪拌器使血液和所有的稀釋溶液能充份地混合均勻。

4.         分批控制

低溫疫苗無法針對它們每批的生產做力價、安全性和滅菌程度的測定。冷凍的疫苗則視每個國家而有所不同。以下為澳洲製造冷凍疫苗的方法。

(a)       滅菌和防止污染

每批的疫苗和稀釋溶液都做無菌的標準測試。

疫苗是否有受其它病原污染的檢查方法是將疫苗接種於牛,用血清學方法針對可能污染的病原做測試。這裡可以利用測試接種後之牛的力價測定方法(參考第 B.4.c 節)。根據每一個國家所流行疾病之不同,疫苗可能存在的污染病原為牛地方流行性白血球增生病、牛傳染性鼻氣管炎、粘膜病(mucosal disease)、牛流行熱(ephemeral fever)、赤羽病(Akabane disease)、Aino病毒、藍舌病、副流行性感冒、口蹄疫、粗皮病(lumpy skin disease)、狂犬病、里夫特谷熱(Rift Valley fever)、牛瘟、傳染性牛胸膜肺炎、Jembrana病、水胸病(heartwater)、小型焦蟲病原和錐蟲、流產布氏桿菌、柯克斯體(Coxiella)和鉤端螺旋體(Leptospira)等(7)。

(b)       安全性

疫苗的反應是由接種後的牛來觀察(參考第 B.4.c 節),觀察其寄生蟲血症和對濃縮紅血球容量(PCV)的壓制情形做為安全性的參考。祗有在致病原程度等於或低於先前所測量的標準時才能做為疫苗之使用。

(c)        力價

疫苗溶解後並用適合的稀釋液稀釋成 1/5013)。將這稀釋液培養在 30 8 小時後,再用2毫升劑量以皮下方式接種於五頭牛。採取血液製作染色抹片來觀察感染的情形。所有接種動物都受到感染時,則表示這批疫苗可以使用。稀釋 1/50 後測試為有效之疫苗在推薦使用時是以等張溶液再稀釋成1/5倍。

(d)       免疫有效時間

一次的接種後可產生部份但長期的免疫作用。至今仍沒有證據顯示重覆注射疫苗可以產生免疫的加強效果(boosting)。

(e)       穩定性

貯存於液態氮的疫苗可以保存5年的時間。但一旦溶解後它的效果就會很快地降低。溶解後的疫苗不能再重新冷凍保存。

(f)         保存劑

不需加入任何保存劑。在疫苗分裝時加入青黴素(500,000單位/公升)和鏈黴素(370,000μg/公升)。

(g)       注意事項(可能的危險)

這疫苗不會感染人類。當產品用液態氮貯存時,它在貯存、輸送和處理時和其它用低度冷凍的物質所用的方法相同。

5.         成品的測試

(a)       安全性

參考第 B.4.b 節。

(b)       力價

參考第 B.4.c 節。

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