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牛白血病
Enzootic bovine leukosis
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牛地方流行性白血病
(EnzooticBovineLeukosis)

摘要

牛地方流行性白血病(EBL)是由反轉錄病毒(retrovirus),即牛白血病病毒(BLV)感染成牛所引起之疾病。所有年齡的牛都會受到感染,包括在胚胎期也不例外。大部份感染的牛都沒有臨床症狀,但一部份的牛(約30%)在三歲以後會發展成淋巴球過多症(lymphocytosis),另外小部份的牛會在各種內臟器官發展成淋巴肉瘤(lymphosarcomas)即所謂腫瘤(tumours)。自然感染的病例亦曾發生在水牛、羊和水豚(capybaras)。如果有臨床症狀的話依被感染的器官而有所不同。有淋巴肉瘤的牛幾乎都會突然暴斃或在臨床症狀出現數週或數月之後死亡。

病原的鑑別:藉周邊血液淋巴球之培養可以分離出病毒,再用電子顯微鏡觀察病毒,並且也可以用牛白血病病毒(BLV)抗原偵測試驗來鑑定。藉由聚合酉每 鏈反應(PCR)可以從周邊的血液裡偵測出潛伏病毒的去氧核醣核酸( proviral DNA),也可以由聚合酉每 鏈反應(PCR)和原位雜交(in situ hybridisation)從腫瘤處偵測出潛伏性病毒的去氧核醣核酸( proviral DNA)。

血清學試驗:最廣為被大家使用的方法是用瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)檢查血清和用酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)檢查血清和乳汁。這些方法被許多國家用來作為成功地根除這疾病的基本工具。也可以用其它的試驗,例如放射性免疫試驗(radio-immunoassay)。在商業上已經有許多瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)的試驗套組可供使用。

需要的疫苗和生物診斷製劑:目前仍沒有對抗牛白血病病毒(BLV)的疫苗可供使用。

A.診斷技術

造成牛的淋巴肉瘤有許多的原因,但目前最被大家所知的是反轉錄病毒(retrovirus)即牛白血病病毒(BLV),它會導致牛地方流行性白血病(EBL)。一般在仔牛發生時稱為牛散發性白血病(SBL),它的感染局限在這年齡的動物造成皮膚和胸腺的淋巴瘤並有腫瘤的散佈。造成牛散發性白血病(SBL)的原因目前仍不明白。它們也可能造成不屬於牛散發性白血病(SBL)或牛地方流行性白血病(EBL)的淋巴肉瘤。

雖然任何年齡的動物都會感染牛白血病病毒(BLV),但腫瘤(淋巴肉瘤)最典型的出現時間是在三歲以上的動物。它們的感染經常都沒有臨床症狀,祗有30 ~ 70%的感染牛會有持續性的淋巴球過多症並且祗有0.1 ~ 10%會發展成腫瘤。它所發生的症狀則視腫瘤生長的部位而定,一般可能包括消化系統障礙、神經症狀、厭食、體重減輕、虛弱或全身衰弱等。表面的淋巴結可能很明顯的腫大,此時觸診時可以摸得出來。屍體解剖時,淋巴結和廣泛的組織都可以發現腫瘤細胞的浸潤。最常發生病變的器官是皺胃、右心耳、脾臟、腸道、肝臟、腎臟、重瓣胃、肺臟和子宮等。比較容易產生持續性淋巴球過多症或腫瘤的牛可以在遺傳基因上來做區別。它們會造成免疫系統功能的減弱或是增加牛隻的淘汰率。根據Emanuelsson等人報告,感染牛白血病病毒(BLV)的牛群產乳量會降低(總產乳量會降低2.5 ~ 3%)、它們的淘汰率會增加並且更容易受到其它傳染病例如乳房炎、下痢和肺炎等的感染,但對生育率的影響則不明顯(6)。

病毒可以經由試管內培養周邊血液淋巴球而偵測出來。在活體內,病毒存在血液的淋巴球以及腫瘤細胞裡,它的基因體會併在宿主細胞的去氧核醣核酸(DNA)內成為潛伏性病毒(provirus)。病毒亦會藏在各種體液的細胞裡(鼻、氣管、唾液、乳汁)。自然的感染得看這些被感染的細胞的去向而定,特別是污染血液的針頭、外科手術器械、用來做直腸檢查的手套等都會成為此病的傳染途徑。除去以上的感染途徑之外其它水平感染的機會可以說是很小。但是在有些地區吸血昆蟲很多的地方也可能由機械的方式傳染給其它的動物。

雖然許多種類的動物可以經由接種病毒而感染,但自然感染則祗限於牛(歐洲牛和印度肩峰牛)、水牛、羊和水豚等。羊在實驗接種病毒時的感受性很高,並且常會發展成腫瘤,它發生的年齡比牛還小。在實驗感染鹿、兔子、鼠、天竺鼠、貓、狗、猴子、羚羊和豬時可以在體內產生持續性的抗體。

牛白血病病毒(BLV)可能出現在上一世紀的歐洲,然後在上半世紀的期間再傳到美洲大陸。它可能因為從北美洲進口加拿大荷蘭乳牛再將病毒帶回歐洲和其它的國家(7)。

有許多實驗試圖瞭解牛白血病病毒(BLV)是否會造成人的疾病,特別是喝了感染病毒的乳牛之牛乳。到目前為止還無法證實它會傳染給人類,所以一般均認為牛白血病病毒(BLV)對人不會造成危害。

1.

病原菌的鑑別

牛白血病病毒(BLV)是一個外源性(exogenous)的反轉錄病毒(retrovirus),它和人的T-淋巴細親和性病毒1和2(HTLV-1和HTLV-2)不管在構造上和功能上都很有關聯。本反轉錄病毒(retrovirus)主要的靶細胞(target cell)則是B淋巴球。病毒粒子主要含單股核糖核酸(RNA)、核蛋白p12、病毒核酸蛋白質膜(中心)蛋白質p24、穿透膜醣蛋白gp30、被膜醣蛋白gp51和數種包括反轉錄酵素之酉每 類。潛伏性病毒去氧核醣核酸(proviral DNA)是大部份由病毒的基因體(genome)所反轉錄而形成的,它以隨機的方式併入宿主細胞之細胞核的去氧核醣核酸(DNA)裡,它在活體裡保有,但通常並不會形成完整的病毒粒子(virions)。當這受感染的細胞在試管裡培養時,通常都是用淋巴球和一指示細胞株(indicator cell line)共同培養,而藉著促細胞分裂劑(mitogens)使它生產出具有感染性的病毒(11)。

1.5毫升含乙二胺四醋酸(EDTA)血液裡的單核細胞(mononuclear cells)可以在合成聚合物/鈉metrizoate密度梯度(ficoll/sodium metrizoate density gradient)裡被分離出來,然後培養在2 x 106牛胚肺(FLB)細胞,並使它生長在40毫升含20%胎牛血清(fetal calf serum)的最低基本培養基(minimal essential medium, MEM)裡3 ~ 4天。病毒所造成的融合細胞(syncytia)會形成在細胞層。短期培養時可以不用牛胚肺(FLB)細胞,而直接將單核細胞培養在24-孔塑膠盤內3天(8)。這培養之上清液裡的p24和gp51抗原可以用放射線免疫試驗(RIA)、酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)或瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)測出來,病毒粒子則用電子顯微鏡來觀察。另外一種不同於細胞培養來偵測病毒的方法是接種在羊體內。這種方法可以在接種後六週測到特異性的抗體而證實它的感染。

用聚合酶鏈反應(PCR)來偵測牛白血病病毒(BLV)之潛伏性病毒的方法已經被許多從事這方面的工作者提過,但它至今仍未標準化,而且它沒有在各種不同情況下用這方法做過的比較試驗報告。許多用來構建吻合基因組的gag、pol和env部位的引子(primers)都曾經被使用過,但它們的結果差異很大。運用來自牛白血病病毒(BLV)gp51部位之引子的診斷套組在將來可能會被研發出來,但這個技術祗能被局限在那些有分子病毒學設備的實驗室裡使用。

2.

血清學試驗

牛感染本病毒後是終身性的,並且會產生持續性的抗體反應。在感染3 ~ 6週後即可測得抗體的存在。而由母體得來的抗體則維持6 到7個月之後便會消失。被動免疫抗體和主動感染產生的抗體無法加以區分開來。被動免疫抗體主要是保護仔牛免受感染,但也可能祗是延長病毒的潛伏期而已。分娩期前後的乳牛可能因為血液循環中的抗體轉移到初乳的關係,所以在這期間可能無法測出血清中的抗體,這時候所採集的血清可能會得到陰性的反應結果(約分娩前後兩至三週的時間),所以此時不能判定沒有感染並且需要重覆再做試驗,這種情況在使用瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)時最容易發生。

在抗體的試驗中以針對病毒的gp51和p24抗原時最容易偵測出來。大部例行的瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)都是偵測病毒的醣蛋白gp51,因為它們出現得較早並且存在的時間也較長。這些試驗的操作方法已經有許多報告(3,5)。

E1和E4這兩種牛血清樣本主要是為了比較各種瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)之間的不同。E1缺乏對p24的抗體(但它可以在瓊脂膠體免疫擴散反應中測出來),它被用來作為抗原製作時的標準化。E4被用來作為OIE的標準血清,並用以刻劃試驗的敏感度。這些血清最早是由歐洲經濟共同體(EEC,現在稱為歐洲聯盟)的參考試驗室所製備,屬於OIE會員的國家都可以取得這血清。必須針對E4先刻劃出一個國家標準,如此可以使標準血清統一使用於全國。

(a)

瓊脂膠體免疫擴散反應

瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)針對由動物個體所得來的血清樣本具有相當高的特異性和敏感度。它很容易操作,但不適合用在牛乳的樣本,因為它的敏感度和特異性都不高。它是用來作為撲滅本病最有效率的武器。商用的試驗套組已經上市。所有瓊脂膠體免疫擴散反應最低的敏感度要求是要能在1/10倍E4的稀釋下仍能測出牛白血病病毒(BLV)的抗體。

(1)

瓊脂膠:用含有8.5%氯化鈉,pH值為7.2之0.2M的Tris緩衝液製備成0.8 ~ 1.2%的瓊脂或瓊脂醣(agarose)溶液。瓊脂的製備方法是將24.23公克的三甲胺(Tris methylamine)溶於1公升的蒸餾水中並用2.5M的鹽酸調整pH為7.2。氯化鈉(85公克)溶於250毫升的三甲胺/鹽酸並製備成1公升的溶液。加入瓊脂醣(8公克)後在4.55公斤壓力下的壓力鍋加熱10分鐘。這配製成的混合溶液每15毫升分裝於容器內貯存在4℃下約六週。

(2)

抗原:抗原必須含牛白血病病毒(BLV)gp51的特異性醣蛋白。抗原的製備是用適合的細胞培養系統例如與牛白血病病毒共存的小羊胎腎單層細胞(fetal lamb kidney cell monolayer)。用來製備牛白血病病毒(BLV)抗原的細胞必須不能含有牛無細胞病變病毒性下痢病毒(noncytopathic bovine viral diarrhoea virus)、牛反轉錄病毒(bovine retroviruses)、牛似免疫缺失病毒(bovine immunodeficiench-like virus, lentivirus)和牛融合細胞病毒(bovine syncytial virus, spumavirus)等。在37℃下培養3 ~ 4天後用維持培養基(maintenance medium)取代成長用培養基(growth medium)。細胞在培養七天後用標準胰蛋白酵素/乙二胺四醋酸(EDTA)溶液來消化收成。細胞懸浮液用500g離心10分鐘,然後在成長培養基裡重新配成細胞懸浮液。30%的細胞再回收培養,其餘的則捨棄。收集所有培養後的上清液,並濃縮成50-100倍。濃縮的方法可將收集之培養液放入visking tubing透析膜內並浸泡聚乙二醇(polyethylene glycol)或先用硫酸銨(ammonium sulphate)使之沉澱後再做超過濾(ultrafiltration)或用聚乙二醇使之沉澱後在含聚丙烯醯胺珠子的玻璃柱(polyacrylamide bead column)裡脫鹽(desalting)和體積分離。抗原主要含gp51,但也可能含p24。

抗原可以用以下的方法藉對E1的滴定來將醣蛋白gp51標準化:將抗原做兩倍階梯式的稀釋。當這最高的稀釋倍數對未稀釋的標準血清E1所形成的沉澱線和由抗原和血清有相等的距離時則被視為1單位。在測試血清抗體時採用二單位的抗原。

(3) 已知的陽性對照血清:陽性的對照血清是來自自然感染或實驗感染的動物(牛或羊)。這含抗原和對照抗血清的兩個小孔之間所形成的沉澱線會很清析明顯。當需要做敏感度實驗時可以將對照陽性血清做稀釋,這會呈現一個微弱的陽性反應。
(4) 已知的陰性對照血清:使用由未受感染動物(牛、羊)得來的血清。
(5) 被測試血清:可以用任何動物的待測血清。
  ˙ 試驗步驟
(1)

用熱水浴將瓊脂溶化並倒入皮氏平皿內(每個直徑8.5公分的皮氏平皿倒入15毫升)。放置4℃冷卻約一小時後再將瓊脂鑿成小孔。以對角的方式鑿成圍繞中間孔的六個小孔。可用各種不同大小的孔徑,但比較理想的孔徑是全部為6.5毫米的直徑,小孔之間的距離則為3毫米。為了得到最好的判讀結果,瓊脂製備好當天即應使用。

(2) 抗原放在中央的小孔,測試血清則放在陽性對照血清的對側小孔內。每一個平皿內必需有一個陽性對照血清,弱陽性對照血清和陰性對照血清供判定參考用。
(3) 平皿在室溫下(20 ~ 27℃)作用置於密閉有溼度的容器內,然後在作用24、48和72小時判讀。
(4) 結果的判定:如果被測試血清和抗原形成一特異性的沉澱線並且和對照血清所形成的沉澱線一致的話則判定為陽性。如果被測試血清和抗原沒有形成特異性的沉澱線並且對照血清的沉澱線沒有變曲的話則判定為陰性。可能會產生非特異性的沉澱線,但它們並不會融入陽性對照的沉澱線或使其彎曲。假若對照血清的線彎曲並朝向抗原的小孔,而沒有和抗原形成可目視的沉澱線則這受測血清可判定為弱陽性反應。假若無法判讀為陽性或陰性的話,並不能就以此來證明感染的存在與否。如果對照組沒有得到期望的結果則並不能算是一次有效的試驗。如果血清呈現不完全或是弱陽性反應結果的話可以加以濃縮後再重做一次。

(b)

酵素結合免疫吸附試驗(國際貿易所要求應做的試驗)

可以用間接(indirect)或阻斷(blocking)酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。它們已經有商業上的產品(例如Bommeli, Dako)。通常用來測試血清和乳汁都有它們各自的試驗套組。酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)有足夠的敏感度用來測試整個樣本庫的血清。酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)是在固相的微孔盤內操作。牛白血病病毒(BLV)的抗原被用來覆蓋在微孔盤內,它可以用直接或藉補捉的多源或單源抗體(polyclonal or monoclonal antibody, Mab)。抗原的製備方法和用在瓊脂膠體免疫擴散反應(AGID)的抗原製備方法是一樣的,並且事先經過磷酸緩衝溶液(PBS)的稀釋(例如1/10)。商業上購買的試驗套組通常都有預覆膜。它們可能加了例如cathon和bronopol之類的保存劑,以防止牛奶樣本酸敗。

˙ 間接酵素結合免疫吸附試驗

和牛白血病病毒(BLV)抗原的製備一樣,用培養中未感染的相同的細胞株來製備對照陰性抗原。在37℃60分鐘將這抗原結合在微孔盤上。在經過洗淨和乾燥的例行過程之後將經含Tween 20緩衝液適當稀釋後的200μl測試樣本血清(血清適合稀釋例如1/25,牛乳則稀釋1/2或不稀釋)加入微孔盤孔內。在2 ~ 7℃之下感作一夜。在洗淨後加入100μl的抗牛免疫球蛋白G辣根過氧化氫酵素軛合物(anti-bovine IgG-horseradish peroxidase conjugate),再於室溫下感作30分鐘。將微孔盤洗淨和乾燥後加入 100μl 的四甲替聯苯胺(tetramethyl benzidine)或其它的受質。再置於室溫15分鐘後用1M的硫酸(H2SO4)使其反應停止,再測它的吸光度。這含陰性抗原之小孔所得到的吸光度讀數可被含陽性抗原小孔所得到的吸光度扣除。

˙ 阻斷(blocking)酵素結合免疫吸附試驗

小孔內用適合稀釋倍數(例如1/100)的牛白血病病毒(BLV)抗體於4℃之下感作18小時來使其包覆。微孔盤在洗淨之後加入稀釋的牛白血病病毒(BLV)抗原(例如1/10)然後在37℃感作2小時。經洗淨後分別加入欲測血清和對照血清,並於4℃感作18小時。經過洗淨的過程之後加入經過生化素處理的牛白血病病毒(biotinyl-BLV)抗體,並將微孔盤在37℃之下感作1小時。微孔盤再洗淨之後加入過氧化氫酵素共軛的抗生朊(peroxidase-conjugated avidin)(約1/10,000的稀釋倍數)。玻璃盤再經過一次洗淨之後加入色原質(chromogen)。在12分鐘後將這顏色反應停止,並讀取它的吸光度。

˙ 酵素結合免疫吸附試驗的敏感度

計算本試驗的敏感度可以參考附錄G中歐洲經濟共同體(EEC)88/406/EEC在診斷布氏桿菌病(Brucellosis)和牛地方流行性白血球增生病(EBL)時所用的方法。 當E4的標準血清樣本的稀釋倍數是樣本庫內的受測血清的個體血清樣本數目之10倍稀釋倍數時這E4標準血清樣本的測試必須為陽性(例如血清庫的組成是50件個體血清樣本時E4的稀釋倍數為1 份對10 x 50,即為1/500,在此濃度下測試結果必須為陽性)。同樣的用來測試牛乳之樣本庫時E4的標準血清樣本的稀釋倍數是樣本庫內的受測牛乳的個體牛乳樣本數目之250倍稀釋倍數時這E4標準血清樣本的測試必須為陽性。當祗針對個體的樣本(血清或牛乳)做測試時,E4血清稀釋1/10(在陰性血清)或1/250(在陰性牛乳)當這被測試的個體樣本有同樣的稀釋倍數時必須認定為陽性。

B. 需要的疫苗和診斷用生物製劑

對牛白血病病毒(BLV)gp51的抗體可以有效的保護牛避免受到牛白血病病毒(BLV)的感染。在實驗下用不活化牛白血病病毒(BLV)、被固定感染的綿羊胎腎(FLK)細胞和純化的gp51等來接種時祗能保持很短暫的保護效果。同時也發現一種由感染牛散發性白血病(SBL)動物所建立的的細胞株(cell line)BL3在接種牛時也祗能得到短暫的保護。和產生保護作用有關的抗原特性可能是一種腫瘤相關性移植抗原(tumour-associated transplantation antigen)(12)。綿羊細胞祗能合成env基因,而產生gp51和gp30和主要結構蛋白p24,它在牛會產生血清學的反應(1),重覆注射這些細胞可以對牛產生保護作用。

用表現牛白血病病毒(BLV)gp51之重組牛痘病毒(recombinant vaccinia virus)來作為羊的疫苗時可以產生保護作用(9)。但它們都無法產生足夠可測得之中和抗體的量。Portetelle等人同時也發現重組的牛痘病毒即使在抗-gp51的抗體減少時也可以產生足夠保護羊的效果(10)。因此認為在產生免疫來對抗牛白血病病毒(BLV)的過程中細胞免疫反應(cell-mediated immune)可能扮演重要角色。由帶有牛白血病病毒(BLV)env基因之密碼順序(coding sequence)的重組牛痘病毒和酵母菌可以得到展現出來的gp51。這些都可以達到對羊的保護效果(4)。

雖然目前對牛白血病病毒(BLV)在免疫上的特性已有非常的瞭解,但是至今在商業上仍然沒有可供使用的疫苗。

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