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牛傳染性鼻氣管炎
Iufectious bovine rhinotracheitis
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牛 傳 染 性 鼻 氣 管 炎( Infectious bovine rhinotracheitis; IBR )

  牛傳染性鼻氣管炎是由牛第一型疱疹病毒(bovine herpesvirus 1; BHV1)引起之牛隻傳染性疾病。本病毒已分佈全世界,但丹麥及瑞士已將本病撲滅。

  台灣於 1967 年 Otte 報告有疑似病例之發生,然後 1975 年林敬覆等在竹南鎮發現達肉牛病例及分離到病毒,至 1985 年呂榮修等發現由本病毒引起之小牛非化膿性腦脊髓炎及潰瘍性口炎,至 1986 年在高雄縣初次爆發本病,10 個酪農戶 1383 頭乳牛共有 156頭發病,發病率平均為 1.2 %。1987 年再因進口牛引發本病之全面性大流行,共有 80 戶 1,491 頭牛隻發病,死亡頭數為 121 頭(8.12 %)、流產 54 頭(3.12 %),造成農戶重大損失。

  本病臨床症狀以上呼吸道症狀為主徵,有粘液樣或化膿性的鼻液,發病時亦可見結膜炎。一般常見的症狀為,發燒、沉鬱、無食慾、流產、泌乳下降。同時本病毒亦可感染生殖道,造成膿皰陰戶膣炎或是龜頭陰莖炎。本病的感染率很高,若於發病時給予適當的症狀療法則死亡率很低。許多感染是沒有症狀,而是呈持續感染(Persistent infection)若有二次細菌感染,則可造成更嚴重的呼吸器病,病理檢查可發現鼻炎、喉炎、氣管炎。

    病原的証實:在急性感染期可採取鼻腔拭子,或採取死後臟器來分離病毒,許多由牛來源的細胞株均可用於病毒分離,如繼代之肺、腎或 MDBK 細胞株,本病毒接種 2至 4 天後會產生細胞病變效應(Cytopathic effect; CPE)。病毒可由標準血清中和試驗確診,或由單株抗體染色感染細胞確診。BHV1 分離株可由去氧核醣核酸(DNA)限制分析作更進一步分類。而目前發展之病毒 DNA 偵測方法,以聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction; PCR)對本病毒在精液樣品的檢測效果很好。血清學檢查:抗體檢測最常用的是血清中和試驗(Serum neutralization; SN)與酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。另乳汁中的抗體亦可用 ELISA 檢測。疫苗與生物診斷試劑:減毒與死毒疫苗均有,疫苗必需能保護牛隻免於被感染,同時減少排毒,疫苗不可以產生疾病、流產及其它局部或全身的反應,同時疫苗株基因要穩定。

I. 診斷技術

  BHV1 是 Alphaherpesviridae 亞科中 varicellovirus 屬中的一員,病毒的基因組含有雙鏈的 DNA ,可製造 30~40 個結構蛋白,其中位於病毒表面的醣蛋白對於致病與免疫最為重要。經由 DNA 限制的分析可將 BHV1 分為,第一亞型、第二 A 亞型(似 IBR)第二 B 亞型(似 IPV)病毒,第二 B 亞型病毒之毒力較第一亞型病毒為低,雖然如此,但BHV1 之抗原仍只有一種。

   本病主要的臨床症狀是病毒感染後經過 2~4 天的潛伏期,然後會有流涎、流鼻水、發燒、無食慾、沉鬱等症狀,再經數天後,鼻、眼之水樣分泌物會變成化膿樣分泌物。鼻部的壞死病變可能進一步發展成潰瘍、化膿灶,並有偽膜形成阻礙上呼吸道而呼吸困難,造成開口呼吸的臨床症狀。本病亦可能造成流產及泌乳下降。種牛自然配種時,生殖道的感染亦可造成膿陰戶膣炎或龜頭陰莖炎,典型的病變在陰道或包皮粘膜可見到輕微或嚴重的壞死病變,若是經由人工授精而得到感染,可造成子宮內膜炎。在小牛方面,受到 BHV1 感染會造成全身性的疾病,在漿膜會有局部壞死病變,亦有可能造成嚴重的胃腸炎。臨床上有許多感染是無症狀的,腦膜腦炎的症狀通常是與BHV5 混合感染造成。BHV1 感染呼吸道或生殖道未併發其它疾病者通常持續 5~10 天,若有二次細菌感染如巴斯德桿菌的感染,可造成更嚴重的臨床症狀,造成呼吸道更深層的感染。病毒經由上呼吸道感染後在粘膜及扁桃腺複製產生高力價的病毒,然後散播到眼結膜及神經的軸突,再到三叉神經節,少量的病毒血症有時也會發生。在生殖道的感染,BHV1 在陰道或包皮之粘膜複製,最後潛伏在薦椎神經節,病毒的 DNA 可在宿主神經節的神經細胞中終身停留,在有運輸或分娩的緊迫時,潛伏的病毒就重新活化感染其他細胞,造成病毒的排出而可能再感染其他牛隻。

  常見的病變是鼻腔、喉頭、氣管、生殖道等粘膜之局部壞死,病毒經過增殖所產生的 CPE 可直接造成此病變,感染動物在局部曾有強烈的炎症反應,病變恢復後形膿,其中含有大量的白血球。若有細菌二次感染,則會有肺炎。在流產的胎兒,各組織會有很小的壞死點,尤其肝臟特別容易出現。

  感染發生後,通常在 7~10 天後會激起免疫抗體反應與細胞免疫反應,免疫反應可持續終身,但是感染後之免疫保護力卻無法終身保護,牛隻仍會被感染。小牛可經由初乳獲得移行抗體,以免於 BHV1 感染致病,移行抗體的半衰期是 3 週,但有時 6 月齡的小牛仍可測到抗體。本病毒隨著牛隻分佈全世界,其它反芻獸亦會感染 BHV1,但對於本病在畜養牛隻的傳播並無影響。其它動物則不會傳播感染 BHV1,BHV1 之最小感染劑量並不清楚。在感染後,鼻腔排毒可達 10~14 天,鼻液力價最高可達 108~1010 TCID50 / ml,空氣傳染只在非常短距離才可能發生。感染的公牛精液亦可帶有 BHV1,而經由自然配種或人工授精傳播。

  農場對 BHV1 之控制仍以一般的衛生管制方式,其中對新進的牛隻實施 2~3 週隔離檢疫,並以 BHV1 血清陰性的牛才能進入牛群。疫苗免疫是常用的預防方法,疫苗要在証實確實有效與確實安全後才可使用,效力主要以實驗室的免疫攻毒來証明,疫苗的功能通常可預防感染後臨床症狀的發生,亦可減少排毒。使用疫苗後往往無法區分疫苗產生或自然感染產生的抗體,故不能從血清學檢查來摘除感染牛隻。若用基因缺損疫苗或是次單位疫苗,將可協助摘除自然感染的牛隻。如 BHV1 gE 疫苗在某些國家使用,有公司產品搭配可僅偵測缺損之醣蛋白的抗體,故可由此區分自然感染或疫苗接種所產生的抗體,故即使是疫苗免疫的牛群,亦可經由此法檢出自然感染牛隻,使得清除政策變為可行。BHV1 的感染通常是經由臨床,病理和流行病來做初步診斷,若要確診仍需實驗室檢驗,以檢測出致病的病毒或特異的抗體才算完成確診。

一、病原鑑定

樣品採集與處理

  感染牛隻的鼻汁呈漿液性而尚未變成粘膿液性的可採集病牛鼻腔拭子,若是陰戶膣炎或龜頭陰莖炎時則從生殖器採集拭子。拭子應用力從粘膜面採集,包皮部位亦可用生理鹽水洗滌採集。採集樣品後的拭子置於輸送液(細胞培養液含抗生素與 2 % 的胎牛血清),在 4 ℃ 冷藏並迅速送到實驗室。在屍體解剖的病材,採集呼吸道粘膜,其它如扁桃腺、肺、脾、腎、胎盤均需檢查及採集病材供病毒分離。到達實驗室後,拭子在運輸液內振盪,然後去除拭子將運輸液以 1,500 g 離心 10 分鐘。若剖檢採集的組織則以細胞培養液做成 10 % (w / v) 乳劑,再以 1,500 g 離心 10 分鐘。這些樣品的上清液即可用來分離病毒。

  從精液做病毒分離則需特別處理,因為精液內含有一些酵素因子對細胞有毒性,而抑制病毒在細胞內的複製,故一般精液樣品須先處理過後才供病毒分離用。

病毒分離

  用於病毒分離的細胞有許多種,初代或繼代之牛腎、肺、睪丸細胞,胚胎來源之牛胎肺、鼻甲骨、氣管細胞株及 MDBK 細胞等均可適用。細胞可用塑膠或玻璃試管、角瓶等培養,若使用 24 孔組織培養盤,則接種樣品上清液 0.1~0.2 ml,吸附 1 小時後,以 PBS 洗滌後再加入維持液。每天觀察是否有CPE,若有病毒染者通常 3 天內會有葡萄串狀的圓化細胞聚集圍在單層細胞破孔的週圍。有時多核的巨細胞亦可見。若 7 天仍無 CPE 則須再繼代,而以第一代培養細胞經冷凍解凍、離心後,上清液用來繼續接種新的單層細胞。

  要証明 CPE 是 BHV1 病毒感染引起,可用 BHV1 特異的抗體或單株抗體進行中和試驗。方法是先將病毒上清液做 10 倍序列稀釋,每一個稀釋度加入BHV1 特異抗血清或陰性對照血清,在 37 ℃ 感作 1 小時,將此混和液接種細胞,經 3~5 天後計算中和指數。中和指數即為含陰性血清的病毒力價(以log10 計算)減去含特異抗血清的病毒力價,如果中和指數超過 1.5,分離株可認為是 BHV1。若要縮短此分離鑑定過程,可接種 2 份樣品,一份添加特異抗血清,一份添加陰性對照血清,若添加特異抗血清者會抑制 CPE 產生,則分離株可認為是 BHV1。

  另外有以免疫螢光或免疫過氧化酶的染色方法証明產生 CPE 的細胞是否有BHV1 抗原,亦可証明是否為 BHV1 病毒感染。

從精液分離病毒

  最少需 0.05 ml 之原始精液,且需 2 次細胞繼代分離病毒。若是經過稀釋的精液,則要取相當於原始精液的精液量。原始精液通常對細胞有毒性,故接種細胞前要先稀釋,再依照下列方法分離病毒。

  取 0.2 ml 新鮮精液加入 2 ml 胎牛血清(無 BHV1 抗體),用力將它混合,室溫靜置 10 分鐘。用 24 孔組織培養盤,每孔接種 0.3 ml 精液 / 血清混合液到有感受性的細胞上。37 ℃ 感作 1 小時。去除混合液,以 1 ml 維持液將單層細胞洗 2 次,再加入 1 ml 維持液 / 孔。本試驗需含有 BHV1 陰性與陽性的對照,但必需非常小心不可污染到正常的試驗。例如可最後才操作陽性對照,並且使用不同的細胞培養盤。顯微鏡下每天觀察是否有 CPE,若有 CPE,則再用特異性抗體做中和試驗或免疫螢光法來確認。

  若 7 天後仍無 CPE,培養細胞以 -70 ℃ 冷凍、再解凍、離心取上清液,接種新的單層細胞。若經 2 次繼代後觀察 7 天仍無 CPE,樣品則可認為是陰性。從鼻液或臟器分離病毒,取前述已處理過準備供病毒分離的鼻液或 臟器樣品依前述精液分離病毒之步驟開始以 0.3 ml 樣品 接種細胞,然後觀察及繼代以診斷是否有病毒。

病毒抗原偵測

  將鼻、眼、生殖道的拭子直接抹在蓋玻片上,或是離心後,細胞沈澱物(見 I、一、)塗在蓋玻片上,此蓋玻片即可用於直接或間接的螢光抗體染色。在直接免疫螢光法,特異抗血清與螢光物質 fluorescein isothiocyanate 結合,而間接免疫螢光法是抗牛免疫球蛋白與螢光物質 fluorescein isothiocyanate 結合。若要獲得最好染色結果,要選取數隻發燒且流漿液鼻汁牛的樣品,做成抹片、風乾、固定,在 24 小時內完成。牛己經成化膿性或出血性鼻汁所做的抹片結果常是陰性。這種診斷方法的好處是可當天診斷,但是敏感性則比病毒分離為差,這種試驗每次均需含有陽性與陰性對照。死後採取的組織,可以冷凍切片免疫螢光法檢查 BHV1 抗原,亦可使用免疫化學法,其好處是可知道抗原的位置。用單株抗體來診斷 BHV1的人愈來愈多,其特異性較高。但所選擇的單株抗體,必需是對 BHV1 均有的共通抗原(conserved epitope)有鍵結性才可。

   另一個直接快速診斷病毒抗原的方法是酵素免疫吸附法(ELISA),抗原可被微量盤上的單株抗體或多株抗體所捕捉,而檢出帶原樣品,其檢測 BHV1 抗原量須達 104~105 TCID50 才可被檢出,但因為感染 BHV1 之病牛在排毒階段的鼻汁力價可達 108~109 TCID50 / ml 持續 3~5 天,故應用此法仍可檢出帶原牛隻。抗原的偵測相對於病毒分離的優點是不需培養細胞,同時診斷時間在 1 天內即可達成,缺點是敏感性低,若要進一步分析毒株的話,仍需分離病毒。

核酸偵測

  過去 10 年中,有許多方法均可診斷臨床病例中含有 BHV1 的 DNA,包括雜交法與聚合酶鏈反應法(PCR)。在例行的診斷,這些方法,尚未被廣泛的使用,但 PCR 的使用可能會愈來愈多,與病毒分離比較起來,PCR 的好處是更敏感更快速,可於 1~2 天內完成,亦可檢測感覺神經節內潛伏狀態的 BHV1 DNA,缺點是容易污染,要小心預防偽陽性產生。

  目前 PCR 主要用於檢測 BHV1 人工感染或自然感染後精液中之 BHV1 DNA,研究者發現建立最佳的 PCR 反應條件非常重要,包括樣品的準備,鎂離子(Mg2+)、引動子、Tag 聚合酶的濃度及溫度控制的程式,經增幅的基因片斷必需所有 BHV1 株均含有,同時其核酸必需穩定,目前 BHV1 的 TK 基因、gC 基因、gD 基因均有被用來做 PCR 增幅。有實驗証明 PCR 比病毒分離還要敏感,PCR 比病毒分離所偵測的陽性多 5 倍。雖然如此,偽陰性卻不能排除,要証明可能是偽陰性,可在精液樣品之 PCR 反應管內加入對照核酸,以同樣的引動子來增幅,在 PCR 後再進行南方雜交是偵測 BHV1 DNA 最敏感的方法。

區別牛第一型疱疹病毒之亞型

  利用單株抗體和 ELISA 於免疫螢光或免疫過氧化酶法,可將 BHV1 第 1 亞型與第 2b 亞型區別。也可以病毒液或感染細胞抽取 DNA,然後以限制酶切割,再以凝膠電泳分離切割的片斷,由片斷的數目與大小可顯示出 BHV1 的亞型,此種技術對診斷不重要,但對流行病學很重要。

結果判定

  從動物分離到 BHV1 病毒並不表示,一定是由本病毒造成發病,也有可能是因緊迫而活化已潛伏感染的病毒。一個確實的診斷須對發病群動物的 BHV1血清抗體檢查是從陰性轉為陽性或升高 4 倍以上才判定有 BHV1 感染。故對發病牛隻,要間隔 2~3 週分別採血 1 次,以此配對血清做血清中和試驗才有確實診斷結果。

二、血清試驗

血清試驗可用於下面幾個目的:

  急性感染之診斷:同一動物急性期血清與恢復期血清要同時檢驗,血清從陰性轉為陽性或抗體升高 4 倍以上,則表示感染。如進出口牛隻,需要証明無此病毒感染。血清流行病學研究時要了解感染的盛行率。撲殺政策後的監測調查。疫苗注射或攻毒後,抗體反應的評估。檢測血清中 BHV1 的抗體可用血清中和試驗(SN)或各種的ELISA 方法,另外一種血清試驗是間接螢光抗體法。因為 BHV1 病毒感染後還會造成潛伏,故証實動物血清為陽性動物提供了一個有用可靠的感染狀態指標。任何有此病毒抗體的動物均可被視為帶原者,或是潛伏的間歇排毒者,唯一的例外是由乳汁來的抗體引起仔牛的被動免疫,及非感染牛以不活化疫苗免疫者。

  現在應用 ELISA 於牛乳抗體檢測者漸漸增加,若巨集(bulk or pooled)牛乳試驗陰性,則表示泌乳牛有 BHV1 抗體者少於 20 %,此顯示仍有可能存在各別血清陽性的母牛,因此不僅可以巨集牛乳試驗陰性就認為牛群沒有感染 BHV1,應繼續做整個牛群之各別血清試驗。若是為了普通監測的目的,巨集牛乳試驗可估算出某區或某國之 BHV1 盛行情形,但通常還須補充非泌乳牛的資料。

病毒中和試驗

  中和試驗有許多操作模式,通常有影響的是病毒株、血清起始稀釋度、病毒 / 血清感作時間(1~24 小時)、細胞的種類、最後判定時間和判定終點(50 % 和 100 %)。在這之中,影響抗體力價最重要的是病毒 / 血清感作時間。抗體力價在 24 小時感作會比 1 小時感作提高 16 倍,故 24 小時感作往往用於需最大敏感性時使用(如國際貿易檢驗)。有許多細胞均可用於本中和試驗,如牛腎或牛睪丸繼代細胞、牛肺或牛氣管細胞株,及 MDBK 細胞。下面介紹一個可行的中和試驗步驟:

  1.   將血清與對照標準血清放入 56 ℃ 熱水浴 30 分鐘非動化。
  2. 以細胞培養液做血清的 2 倍序列連續稀釋,取 96 孔微量培養盤將血清從原液稀釋至 1024 倍,每個稀釋倍數至少做 2 孔,每孔 0.05 ml。陽性、弱陽性、陰性血清之序列稀釋液亦需與試驗樣品一同操作,另加一組為未加稀釋血清供毒性對照。
  3. 每孔加入 0.05 ml 含有 100 TCID50 的 BHV1,在毒性對照孔則以培養液取代病毒液,細胞對照則是不加樣品血清不加病毒而加 0.1 ml 之培養液。
  4. 將殘餘的病毒原液以培養液做 10 倍序列稀釋至少 4 個梯度,每孔使用0.1 ml,並且每稀釋倍數最少做 4 孔供力價回歸測定。將培養盤置於 37 ℃ 感作 1 小時。每孔加入含 3×104 細胞 / 0.1 ml 的細胞懸浮液 0.1 ml。
  5. 將培養盤置於 37 ℃ 培養 3~5 天。

  從顯微鏡下觀察 CPE,並檢查病毒的回歸力價測定是否為 100 TCID50若為 30~300 TCID50 均可接受)、檢查血清對照、細胞對照。陽性血清對照應在 2 倍序列稀釋的 ± 1 個稀釋度範圍之內,弱陽性對照檢驗結果應為陽性,陰性血清應該沒有中和力價,在細胞對照其細胞應完好不變。血清的力價以可完全中和病毒的血清稀釋倍數之倒數表示。為了定性,任何力價高於 1 可判為陽性,若血清對照顯示有毒性,則樣品判定為沒有結果而須重新測試,或血清重新採集一次供測試,這樣的情形在血清抗體力價高時可用更高的稀釋度做血清毒性對照再來判定。

酵素免疫吸附試驗(ELISA)

  近來用 ELISA 偵測抗 BHV1 的抗體已漸漸取代中和試驗法。目前有好幾種形式的 ELISA 被應用,包括間接 ELISA 與阻斷 ELISA。其中間接 ELISA 的步驟較常被使用。商業上亦有許多 ELISA 套組,大部份也都適合檢測牛乳中的抗體。

  ELISA 的步驟可有許多變化。最常見的有:抗原的準備與吸附,樣品的稀釋度,抗原及樣品的感作時間,受質呈色液的種類。在 ELISA 當做例行使用前,必需先証實其敏感性、特異性與重現性。因此強陽性、弱陽性、陰性血清均應測試。

間接酵素免疫吸附法

  一般間接 ELISA 的原理是將抗原吸附在 ELISA 專用的微量盤,然後將測試樣品加入盤中,如果有特異性抗體,就會與抗原結合,經過洗滌可將未結合的抗體去除,再加入抗牛免疫球蛋白的酵素結合體,再經過洗滌的步驟,加入受質呈色劑,若樣品血清中有特異性抗體就會呈色,可用光電比色計測定,顏色反應的強度與樣品中抗體量呈正相關。下面即是間接 ELISA 步驟的範例:抗原的準備可將 BHV1 接種細胞,當大量 CPE 來時,將細胞與培養液冷凍於 -20 ℃,解凍後以 8,500 g 離心 4 小時,將含有病毒的沈澱物懸浮於小量的磷酸緩衝溶液(phosphate buffer saline; PBS),置於冰上以超音波打散,這樣的抗原製備液以 800 g 離心 10 分鐘後,取上清液為 ELISA 抗原液,使用時做適當的稀釋(以 0.05 M carbonate buffer; pH 9.6)再吸附到微量盤上。亦有許多發表的不同抗原準備方法可參考行之。

  將稀釋過的抗原每孔 0.1 ml 加入微量盤吸附,將微量盤封膠帶,37℃ 過夜感作後將盤內的抗原液倒掉,以 PBS 潤溼清洗 1 次,再加入0.1 ml 含 5 % 牛血清白蛋白的抗原稀釋液,在 37 ℃ 感作 1 小時 PBS 潤溼清洗 3 次,然後再儲存於 -20 ℃ 供反應用。試驗開始前先洗微量盤,加入緩衝液、血清樣品、陽性樣照、弱陽性對照、陰性對照。一般血清樣品以含有 0.05 % Tween 20 的 PBS稀釋 10 倍或 100 倍(依試驗操作說明稀釋)。將微量盤震盪,封好置於 37 ℃ 感作 1 小時。

  將微量盤以含 0.05 % Tween 20 的 PBS 洗過 3 次,加入經適當稀釋的抗牛免疫球蛋白 / 過氧化酶標示抗體,置於 37 ℃ 感作 1 小時。

  加入新鮮配製之受質呈色劑〔如:0.1 M citrate phosphate buffer;pH4,含有 2,2'-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid].2NH4(0.5 mg / ml)〕和 3 % 新配製的 H2O2 (2 / ml),感作適當的時間。

  用微量盤光電比色計測定吸光值。若是測試樣品的吸光值比陰性對照高出 0.2 即可判定為陽性,但這要在陰性對照吸光值在 0.2 以下同時陽性及弱陽性均測試為陽性才可做如此判定。判定無效的測試則重做檢測,對照與陽性閾值之可接受的極限必需由各別實驗中決定。

阻斷免疫酵素吸附法

  阻斷或競爭 ELISA 的原理是阻斷抗原與酵素標幟 BHV1 抗血清結合或由測試樣品中的抗體阻斷抗原與抗 BHV1 單株抗體的結合,有抗體在樣品中就會有阻斷性結合,導至結果顏色減淡。有報告顯示阻斷 ELISA 比間接 ELISA 要來的敏感。

  每一次血清試驗必需標準化,均應含有適當的對照如強陽性、弱陽性與陰性血清。最近歐洲的科學團體亦同意使用強陽性、弱陽性、陰性血清來標準化 BHV1檢驗。這些血清亦被 OIE 之 IBR / IPV 參考實驗室採納為 OIE 國際標準。國際貿易的檢驗 (SN 或 ELISA) 必需能將強陽性、弱陽性均確診為陽性。

II. 疫苗與生物診斷試劑

  目前有數種弱毒與不活化 BHV1 疫苗可供使用。疫苗用的毒株通常都已在細胞繼代多代。有些疫苗株有溫度敏感的特徵,即不可在 39 ℃ 或更高的溫度增殖。弱毒疫苗可以鼻腔接種或肌肉注射。不活化疫苗含有高力價的不活化病毒混以佐劑,不活化疫苗以肌肉或皮下注射。

  標幟疫苗 (marker vaccine) 已有某些國家在用,這些弱毒或不活化標幟疫苗原理是將病毒的單一次單位 (如 glycoprotein D) 經過缺失突變而成,此種標幟疫苗與診斷試劑合併使用可區分出感染牛與免疫牛,因此可執行 BHV1 感染牛之撲殺政策。徹底的免疫計畫應降低感染牛的盛行,此可經由公司的診斷試劑監測。在合理的經濟原則下,感染牛隻可被摘除,如此即可成為 BHV1 之清淨場。

一、種毒管理

種毒特性

  疫苗是用種毒批組 (seed-lot) 系統來製備,種原病毒株 (master seed virus, MSV) 的來源、繼代情形與儲存情形均需記錄、種原病毒株必需要有病毒驗明試驗,種毒批組含有的 BHV1 病毒是經過減毒的活毒疫苗株,毒株可經由細胞多次繼代來減毒,或以低溫馴化來減毒(溫度敏感變異株),或以基因工程來減毒,例如將病毒複製不重要的基因切掉而成,這些毒株應該要含有一些方法可將疫苗毒與野外毒區分開來(如特異溫度生長模式或限制片斷長度多形性)。不活化疫苗使用的毒株並不需要減毒。並且種毒批組不得有污染。

培養方法

  用於生產疫苗的細胞亦用細胞批組系統,病毒應以已建立好的細胞且適合生產疫苗者來培養,如 MDBK 細胞。細胞的來源歷史均應很清楚,必需不含任何外來物,也不能有致癌性。

疫苗效力

  不管用什麼方法製備種毒批組疫苗病毒,種毒批組病毒要做成活毒疫苗者,都必需証明它的效力、安全與純淨。

效力:

  效力必需在實驗室以免疫攻毒試驗來証明,在歐洲藥典的專題論文中有很好的範例,簡單扼要的說,以疫苗免疫 2~3 月齡 BHV1 血清陰性的小牛 5 隻,另 2 隻小牛做對照。所有的小牛在 3 週後以鼻腔攻毒強毒株 BHV1,對照小牛應有典型的 BHV1 感染症狀,免疫小牛應該沒有症狀或僅有輕微症狀。檢驗免疫小牛鼻腔粘膜之病毒力價最少要比對照少 100 倍,其排毒期間最少亦應比對照少 3 天。

安全:

  活毒在給予 10 劑量的病毒量後,小牛不可有局部或全身的反應,不可造成胎盤感染或流產,在小牛連續繼代 5 代後不可回復成強毒。死毒疫苗通常給予 2 個劑量來測試,回復強毒的試驗則不需檢測。

純淨:

   種毒批組不可含有外來的病毒,亦不可有細菌、黴菌、黴漿菌的污染。下列病毒均有可能在病毒增殖過程中污染而成為 BHV1 疫苗中外來的病毒:腺病毒、赤羽病病毒、牛冠狀病毒、牛疱疹第一、第二、第四型病毒、牛小病毒、牛呼吸道融合病毒、牛輪狀病毒、假性狂犬病病毒、藍舌病病毒、牛流行熱病毒、牛白血病病毒、牛乳頭腫症病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛病毒性下痢病毒、牛痘病毒 (cowpox virus)、口蹄疫病毒、瘤狀皮膚病病毒 (lumpy skin disease virus)、惡性卡它熱病毒、副流行性感冒第三型病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、水疱性口炎病毒。因為牛病毒性下痢病毒經常發現污染疫苗,故需特別留意不可污染到此病毒。

二、製造方法

  所有用於製造疫苗的原料均不可有所污染。從種原細胞 (master cell seed) 繼代超過 20 代的細胞就不可再使用,從 MSV 來的種毒不可使用超過 5 代,不管是遺傳工程疫苗株或傳統弱毒株均照此規則使用。當足夠的細胞長滿時即可接種疫苗。培養液中可加些抗生素,當病毒複製達高峰時,即可採收上清液。在活毒疫苗的製作,將上清液的雜質去除,加入安定劑,冷凍乾燥與分裝即可。在傳統不活化疫苗的製作,先將上清液搖均勻再加入不活化劑,如此可保証不活化的效果。在不活化後,要測試病毒是否完全被不活化,此最少要經過 2 次的細胞繼代來証明。不活化後的病毒懸浮液加入佐劑混合後分裝即可。疫苗製造應依優良藥品規範指導守則來生產疫苗。

三、生產管制

  生產用的種細胞與種毒必需証明沒有污染。在接種病毒前,細胞應有其正常的形態,可在細胞培養時,觀察有無 CPE 來檢驗。未接種的對照細胞一直到生產組採收時仍應保持正常的形態,採收的病毒上清液需做病毒力價測定。生產不活化疫苗則需測試病毒是否完全不活化。最後階段未分裝的疫苗要測試有無污染。其它的管制依照優良藥品規範來實行。

四、批別控制

  下面的幾項試驗每一批均需測試。如何操作批別控制的指引範例可在歐洲共同體指導手冊中找到,或是歐洲藥典或是美國農業部的國家管制標準中找到。

無菌:

  不可以有細菌、黴菌、黴漿菌及其它外來的病毒。

安全:

  在不活化疫苗使用 2 劑量,或弱毒疫苗使用 10 劑量分別打入 BHV1 血清陰性的小牛不能產生副作用。

效力:

  可依本章效力檢查試驗,檢測一代表批即可。在活毒疫苗,每一批的病毒力價必需測定,不可高於安全劑量的 1 / 10,亦不可少於標示的力價。在不活化疫苗,效能的評估可用小牛評估效力。

免疫力保護期限:

  此在疫苗病毒的批組測試即可,一個有效力的 BHV1 疫苗應該至少產生1 年的免疫保護力。

穩定性:

  活毒疫苗在有效期限到期前 3 個月要做病毒力價試驗,同時要測定濕度,防腐劑的濃度與 pH 值。在死毒疫苗則測乳劑的粘度與穩定度。

防腐劑:

  必需証實防腐劑的效力,在疫苗有效期限到期前,防腐劑在各階段的濃度是否有所變化均應檢測,此濃度應與防腐劑標準量相一致。

安全注意:

  BHV1 對人並無病原性,不需特別注意製造者的安全措施,但一般的無菌與隔離操作仍須注意。

五、最後產品測試

安全:

  每樣產品最少接種 2 隻有感受性的小牛每隻 2 劑量(不活化疫苗)或 10 劑量(活毒疫苗)疫苗,均需証明安全。

效力:

  見本章 II、四、及符合國家檢定標準。

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