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錐蟲病
Trypanosomosis
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錐蟲病 (采采蠅媒介)

摘要

采采蠅媒介錐蟲病(Tsetse-borne trypanosomosis)是由數種品種之錐蟲屬(Trypano-soma)原蟲寄生蟲所導致的複合性感染之疾病,它是由純非洲之采采蠅屬(Glossina, tsetse fly)所媒介傳播。這疾病可以感染所有的哺乳類,但從經濟的角度來看錐蟲病以感染牛造成的影響最大。它主要導致的病原是 T . congolense錐蟲、 T . vivax錐蟲和 T . brucei brucei 錐蟲(布魯氏錐蟲)。

病原的鑑別:可以用許多不同的寄生蟲檢查技術,包括溼、厚或薄血液抹片的顯微鏡檢查以及微量血球容積比(microhaematocrit)離心技術。微量血球容積比離心技術是敏感性最高的寄生蟲檢查技術,如果配合位相差(phase-contrast)或是暗視野(dark-ground)顯微鏡的檢查時敏感度則更高。其它正在發展中的試驗包括偵測抗原的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)以及用聚合酵素鏈反應(polymerase chain reaction)來偵測寄生蟲DNA的技術等。

血清學試驗:間接螢光抗體試驗是目前使用在種別特異性抗體測定上最準確的血清學技術。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:目前沒有生物製劑產品可供應用。

A.診斷技術

采采蠅媒介錐蟲病(Tsetse-borne trypanosomosis)是由數種品種之錐蟲屬(Trypano-soma)原蟲寄生蟲所導致的複合性感染之疾病,它是由純非洲之采采蠅屬(Glossina, tsetse fly)所媒介傳播。這疾病可以感染所有的哺乳類,但從經濟的角度來看錐蟲病以感染牛造成的影響最大。它主要導致的病原是 T . congolense 錐蟲、 T . vivax 錐蟲和 T . brucei 錐蟲(布魯氏錐蟲)。T . uniforme 錐蟲、 T . simiae錐蟲和 T . sui s 錐蟲較少見的錐蟲品種。在非洲和中南美洲 T . vivax 錐蟲也會藉由其它的叮咬昆虫之媒介來傳播。采采蠅媒介錐蟲病(Tsetse-borne trypanosomosis)也會感染人類而導致昏睡病(sleeping sickness),它引起的錐蟲品種是Brucei gambiense 錐蟲或是Brucei rhodesiense 錐蟲。

錐蟲所引起的臨床症狀和死後的病變並非屬於錐蟲病的特徵性病變,所以必須藉由寄生蟲的檢查技術例如用顯微鏡找出虫體的存在或是用各種不同的抗體或抗原來做血清學的試驗以做為確診的根據(6)。

1.

病原的鑑別 (國際貿易所要求的試驗)

由於寄生蟲血症一般非常低而且呈波動性,所以寄生蟲的檢查技術雖具有很高的特異性,但它們的敏感性卻相當低(亦即可能會產生一定比例的假陽性結果)。陰性的結果並不能代表沒有受到感染,所以要做最後的確診時必須將陰性結果再做重覆的試驗。

有許多寄生蟲的檢查技術可供使用,它們各有不同的敏感度,選用那一種方法得視實驗室的設備條件。

˙ 直接的檢查方法

最簡單的檢查方法是做溼、厚和薄的血液抹片,但這些檢查方法的敏感度很低。

(a)

溼血液抹片

這個方法是在顯微鏡玻片上置一滴血液然後覆上蓋玻片。用 x40倍物鏡的顯微鏡來檢查。可以看到錐蟲在紅血球之間的活動。

(b)

厚血液抹片

將一滴血液置於玻片上,然後再用玻片的邊緣將之抹開成直徑約2公分的範圍。在空氣中搖動使之加速乾燥,不需加以固定。用緩衝溶液配成的4% Giemsa染色液染色30分鐘(根據製造廠商和操作人員技術的不同而有不同的染色時間和染色液稀釋濃度。以製造的說明為標準做各種不同時間和濃度的比較來找出最合適的結果)。將玻片洗淨之後用 x100倍油鏡來檢查。由錐蟲的特徵性形態可在顯微鏡下很容易地就看出來,但錐蟲可能在染色過程中受到損傷,而增加品種判斷的困難。

(c)

薄血液抹片

這個方法主要是用來鑑別錐蟲的品種。它是先置一小滴血液於玻片上然後將之抹於另一片玻片。塗抹的方法是用一玻片置於另一玻片之邊緣上並使其成30°的角度,兩玻片的接觸點平均沾著血液之後,將玻片往上拉到玻片的另一端,而使血液成一層均勻而且薄的膜。在空氣中搖動使之乾燥,用甲醇固定3分鐘,再用和厚血液抹片一樣的方法來染色。染色後用水龍頭水輕輕洗過,待其乾燥之後用 x100倍油鏡的顯微鏡下檢查(另一方法是固定2分鐘後再加入May-Grunwald染色液後放置2分鐘,然後加入等量的緩衝液後放置8分鐘,最後讓溶液流乾)。這個方法可以看出錐蟲的特徵性形態。

以上的檢查方法也可以應用在從淋巴結穿刺所得到的樣本。

血液抹片下的錐蟲可以根據以下特性來加以分別。

T . vivax 錐蟲:

蟲體長20 ~ 27μm,波動膜(undulating membrane)不明顯,有游離的鞭毛,末端圓,激動體(kinetoplast)大並且位於尾部。

T . brucei 錐蟲(細長型): 平均長度為29μm,波動膜很明顯,有游離的鞭毛,激動體位於近尾端。
T . brucei 錐蟲(粗短型): 蟲體大小12 ~ 26μm,波動膜很明顯,沒有游離的鞭毛,激動體位於尾端。
T . congolense 錐蟲: 蟲體很小的品種(8 ~ 20μm),波動膜不明顯,沒有游離的鞭毛,激動體不位於尾端。
T . theiler i錐蟲: 體型較大的品種(60 ~ 70μm),波動膜很明顯,體部末端較尖,激動體大而且不位於尾端。

˙ 寄生蟲濃縮技術

(a)

微量血球容積比離心技術

微量血球容積比離心技術(microhaematocrit centrifugation techniques)是診斷 T . congolense 錐蟲和T . vivax 錐蟲最敏感的方法(8)。但需要用特殊的試驗設備,所以在野外時常無法操作。

以下是Woo(14)所提供的操作方法:

(1)

用含有肝素的毛細管採集所需的血液。將血液填滿至毛細管3/4的長度。

(2)

用塑膠粘土或是用燒的方式將毛細管的一端封起來,注意不要使管內的血液燒焦。
(3) 將毛細管封口一端朝外放入微量血球容積離心機離心。為了使離心機保持平衡,必須以對稱的方式放置。
(4) 栓緊螺旋蓋,將離心機蓋子蓋起來。
(5) 在 13,000xg 下離心5 分鐘。
(6) 用兩片大小為25 x 10 x 1.2毫米的玻片將毛細管固定住或是用膠帶將三根毛細管粘住一起固定。
(7) 將毛細管置於凹槽,在上面加蓋並使凹槽內經水流通過。
(8) 檢查白血球層/血漿的連接處。用 x 10倍物鏡顯微鏡來看錐蟲的活動,如果用 x 40倍的物鏡來觀察時會更清礎。
(b)

暗視野/位相差白血球層技術

這是一種對錐蟲感染的檢查更進一步改良的方法(5)。它用上述(1)到(5)同樣的操作步驟之後,將毛細管距離白血球層之下面1毫米處截斷,使其包括紅血球的最上層,並包括其上1公分的血漿。將毛細管的內容物放於乾淨玻片上,將之混合並蓋上蓋玻片。最後用位相差或是暗視野顯微鏡來觀察,可以很容易看到在活動的錐蟲。 可以根據下列的方法來分辨不同品種的錐蟲:

T . vivax 錐蟲:

體型較大,活動力很強,可以穿過整個視野,但有時會暫時停止活動。

T . brucei 錐蟲: 具不同大小,在一特定區域內迅速活動。
T . congolense 錐蟲: 體型較小,遲鈍,前端會粘著在紅血球上。
T . theiler i錐蟲: 體型大小比具有病原性的錐蟲還大二倍。

如果沒有位相差或暗視野顯微鏡的話,可以將一般顯微鏡的聚光器上面拿掉和/或將遮光板關起來,也可以得到位相差的效果。

(c)

血球容積比測定法

測定血球容積比對判斷貧血的程度有很大的幫助,並且因此可以瞭解這疾病演變的階段。樣本的準備方法是用微量血球容積離心技術(1)到(5)相同的步驟,然後將毛細管置於判讀上讀出結果。結果是以紅血球佔全部血液的百分比來表示。

(d)

試管內培養

曾經有研究人員從人和動物試驗樣本的試管中分離出T . brucei 錐蟲。最初的報告證明由微量血球容積測定法得到陽性反應的樣本用培養的方法時也一樣可以得到陽性的結果。另外如果微量血球容積測定法得到陰性的結果時,用培養的方法時可能會得到陽性的結果(11)。這試驗和用鼠接種的方法有一樣高的敏感度,因此可以提供診斷T . brucei 錐蟲很有用的資料。

˙ 動物接種

接種小白鼠是診斷 T . brucei 錐蟲感染最敏感的方法。用0.2毫升的血液樣本注入兩隻小白鼠的腹腔內。然後每周採血三次,用溼抹片法來檢查是否有錐蟲的出現。

˙ 免疫學的方法:酵素結合免疫吸附試驗

有關診斷錐蟲症的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)的抗原偵測法已有報告(7)。最初的報告指稱這反應的敏感度相當高,而且對T . brucei 錐蟲、T . congolense 錐蟲和 T . vivax 錐蟲的診斷有很高的特異性。但是在野外試驗的結果它對 T . vivax 錐蟲的檢查結果很不一致,有些認為這方法可以得到很好的診斷結果而有些卻認為它的敏感度比預期的還低,還有一個研究報告聲稱這試驗的特異性比預期的低很多。它仍不失為一個好的試驗方法,但必須先要瞭解產生這不一致結果的原因。

˙ DNA增幅法

研究人員已經可以用聚合酉每 鏈反應(PCR)做DNA的增幅(amplification)來分辨出T . congolense 錐蟲和T . brucie 錐蟲的亞種(4)。這個試驗非常敏感,甚至於樣本中祗有單一錐蟲存在也能檢查出來。它的特異性也非常高。這試驗需要很特殊的設備和經過嚴格訓練的人員來操作,所以目前不適合在所有的實驗室裡操作。它可以一次測試大量的樣本,所以很適合做大規模的疾病調查之用。

2.

血清學試驗

有許多檢測抗體的技術被用來作為錐蟲症的診斷方法,包括微量盤ELISA(3)和卡片採血凝集試驗(1)。一般來說它們的敏感度都很高,但是特異性卻很低。因為有些會和其它的原蟲產生交叉反應,所以無法作為錐蟲品種鑑別之用(10)。它能確認出曾經有過錐蟲的感染,但無法得知是否是最近受到感染或是此感染已經很久以前就痊癒了。依目前的發展來看可以選擇使用螢光抗體試驗,因為它可以檢測出品種特異性的抗體。

˙ 間接螢光抗體試驗

新的製備錐蟲抗原技術(2)已經取代了老的方法(13)。這方法包括用80%冷丙酮和含0.25%福馬林的生理鹽水製成的混合液來固定活的錐蟲體。

˙ 試驗步驟(9,12)

(1)

由高度寄生蟲血症的血液或是錐蟲懸浮液來製備薄抹片。置於空氣乾燥之後用丙酮固定5分鐘。

(2) 用指甲油在玻片上劃兩個直徑為5毫米的圓圈。
(3) 兩個圓圈內分別放入測試的血清及稀釋成1/40的血清,圓圈不能有缺口。
(4) 將這製備好測試抗原的血清在37℃下置於有溼度的密閉盒中30分鐘。
(5) 在4℃下用磷酸緩衝溶液(PBS)將它洗三次,每次洗5分鐘,並慢慢攪動。再將玻片風乾。
(6) 加上標示抗體(兔或山羊抗-牛免疫球蛋白G結合異硫氰酸鹽螢光素)。
(7) 如上法再做培養和洗淨。用蒸餾水清洗,將玻片風乾。
(8) 在玻片加上PBS或是緩衝甘油然後蓋上蓋玻片檢查其螢光。

B. 需要的疫苗和診斷用生物製劑

目前沒有生物製劑產品可供應用。

˙ 致 謝

本章的一部份是採錄自1992年版的手冊中之錐蟲症一章。這一章最早是由P. Finelle所篇著的。

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