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羊沙門氏桿菌流產病
Salmonellosis (S. abortus ovis)
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沙門氏桿菌症

摘 要

人與動物之沙門氏桿菌症 (Salmonellosis) 是一種傳染性疾病,主要由兩種沙門氏桿菌 (Salmonella enterica 和 Salmonella bongori) 所引起。雖然沙門氏菌是腸道內主要的細菌,但事實它也廣泛分佈於環境之中,而且經常在農場的排放物、人類的污水和任何有受到糞便污染的物體中被發現。很多國家都已發現沙門氏桿菌症的感染,但是在動物密集飼養的地方,特別是養雞場和養豬場最為普遍發生。 此種疾病幾乎可感染所有家畜,幼齡和懷孕動物的感受性最強。本病最常見之臨床症狀是腸道疾病,但也會有其它的症狀如急性敗血症、流產、關節炎和呼吸道疾病等。許多動物也可能會受到感染但無臨床症狀,而此類潛伏性感染動物常會造成人類的食物中毒的來源。

病原菌的鑑別:診斷是根據(病原菌的分離)從屍體解剖時無菌操作採樣的組織或是從糞便、直腸拭物或環境中,分離得病原菌。當有生殖道的感染發生時,此時應該採集胚胎胃內容物、胎盤和陰道內拭物或許在禽類則採集蛋的樣本來做培養。

沙門氏桿菌之分離有不同之方法,它包括預先增菌 (pre-enrichment),使受損的沙氏桿菌復活,接著再以含抑制其它細菌的增菌培養基 (enrichment media) 及可區別沙門氏桿菌和其它細菌之選擇性瓊脂培養基 (selective plating agars) 培養等。

分離到的病原菌可以各種不同的生化學和血清學的試驗作確認。沙門氏桿菌的抗原可以分為體抗原 (O) 、鞭毛抗原 (H) 和Vi ,它們可以用特異性血清來分類辨別,血清學的變異情形可以按照 Kauffman-White 體系裡的抗原來分類鑑別。許多實驗室可以將所分離的病菌送至參考實驗室做全部血清學的確認。

血清學的試驗:一般較喜歡從族群中採集代表性樣本來做血清學試驗,但除非在流行的狀況下否則參考的價值很有限。在禽類養殖場,可以用全血來做雛白痢的快速診斷。在實驗室裡,可用試管內凝集試驗做為所有禽畜產品出口的檢驗。目前亦可以用酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 來做血清學的試驗。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:沙門氏桿菌的疫苗有許多不活化疫苗,也有一些活毒疫苗可供使用。不活化疫苗在某些情況下使用,雖有很好的效果,但一般情形下效果則不很明顯,它可以加上佐助劑來加強。野外使用的效果資料非常缺乏,但可以用實驗裡的測試來提供很好的參考。用實驗動物來做安全性的無害測試,在不活化疫苗方面,可以用增菌培養基來做無菌試驗。另外,疫苗對環境的影響及穩定性等可以用基因方面的研究來做更一步的評估。

沙門氏桿菌屬的特殊系統命名法

沙門氏桿菌的分類多年來一直有許多的爭議。根據最近對沙門氏桿菌更之命名分類法,沙門氏桿菌屬包括兩個菌種:Salmonella enterica 和 Salmonella bongori(9,12)。S. enterica 可根據生物化學上不同的特性細分成六個次種,有些和以前的次屬有關,這些次種包括:

 ˙ 次種 Ⅰ = 次種 enterica
 ˙ 次種 Ⅱ = 次種 salamae
 ˙ 次種 Ⅲa = 次種 arizonae
 ˙ 次種 Ⅲb = 次種 diarizonae
 ˙ 次種 Ⅳ = 次種 houtenae
 ˙ 次種 Ⅵ = 次種 indica

S. bongori 之血清型分類則附以符號 Ⅴ 來表示,以避免和 S. enterica subsp. Enterica 血清型名。沙門氏桿菌的血清型分類,是根據它們的脂多醣 (lipopoly-saccharide)(O) 抗原和鞭毛蛋白質 (H) 抗原上的許多不同,以 Kauffmann-White 體系的方法來加以分類,目前為止已經可以分類出 2,375 種不同的血清型 (12,13),而且數目仍在增加之中。目前知道最常感染人以及肉用動物的血清型是屬於次種 1 。其它次種的血清型則常發現於兩棲類,有些 S. arizonae 之血清型和禽類與羊的疾病有關。

本章是根據先前約定的習慣,使用較老的命名法 S. typhimurium 來表示 S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium,並與 S. pullorum 和 S. gallinarum 之間做一個區別。

A. 診 斷 技 術

沙門氏桿菌症 (Salmonellosis) 是由兩個品種的沙門氏桿菌 (Salmonella enterica 和 S. bongori) 所引起的人類和動物的傳染病。雖然沙門氏菌是腸道內的細菌,但事實它也廣泛分佈於環境之中,經常在農場的排出物、人類的污水和任何受到糞便污染的物體中被發現。很多國家都已發現有沙門氏桿菌症的感染,但是在動物密集飼養的地方,特別是養雞場和養豬場最為普遍發生。

本疾病感染所有飼養的動物,幼齡和懷孕動物的感受性最強。最常發現的臨床症狀是腸道症狀,但也會有不同的症狀如急性敗血症、流產、關節炎和呼吸道症狀等。許多動物也可能會受到感染但不會出現臨床症狀,此種感染的動物常會造成人類的食物中毒的來源。

感染的過程、臨床症狀、死後的病變和流行病學的型態之不同仍依據感染菌之血清型和被感染動物之品種的不同而有所差異。有些血清型祗感染特定的宿主,例如 S. choleraesuis 祗感染豬,但是大部份的血清型在許多種動物都可以造成疾病 (14,18)。許多的血清型證明可以造成人類的食物中毒,動物管理員、獸醫、屠宰場工作人員,以及實驗室的工作人員,都可能在工作中直接感染本菌。

最常出現的臨床症狀是腸炎 (enteritis) ,但有時也會出現敗血症、生殖道感染的流產和關節炎等。其症狀和病變不具有特徵性,特別是在禽類和豬感染沙門氏桿菌時,常祗有不顯性的臨床症狀 (14)。

造成的疾病一般稱為沙門氏桿菌症 (Salmonellosis),但也可以用副傷寒桿菌 (paratyphoid) 的名稱,例如豬的副傷寒桿菌病,在禽類稱為雛白痢 (pullorum disease) 或桿菌性白痢 (bacillary white diarrhea) 以及家禽傷寒 (fowl typhoid) 等,分別指感染 S. pullorum 和 S. gallinarum 所產生的疾病(14)。

在做詳細的流行病學調查時,必須要對菌株做分類,傳統上用生物化學和血清學的方法及對一些血清型噬菌體 (phage) 來分類。近年來用病原菌質體 (plasmid) 的外廓和染色體的DNA來做基因型的分類,已得到非常好的結果。質體外廓 (plasmid profile) 的分析可以提供非常快速和相當簡便的方法來分辨菌株,並且可以用於人醫和動物醫學上沙門氏菌分佈的調查。並不是所有的沙門氏桿菌菌株都帶有質體 (plasmids),因此可以用染色體的分類法來彌補那些沒有質體的菌株在分類上的不足 (18)。

沙門氏桿菌之分離和鑑別依據適當品質的樣本、合適的培養基和不同血清型的發育特性。特別是適應於宿主之菌株。

許多國家有訂定針對動物感染沙門氏桿菌的控制計劃,以便保護消費者的權利。歐洲聯盟(European Union)的人畜共同傳病最高指導機關(Zoonoses Directive)92/117/EEC,要求對250隻以上之禽種畜場與孵卵場做 S. enteritidis 和 S. typhimurium 的監測 (4)。在輸送到達當天培養雞箱內襯死亡或淘汰雞,視雞群的大小,在4週齡以及產蛋前兩週,至少採集60個以上糞便樣本做培養檢查,成雞則每隔二週採樣一次。在孵化場則每隔兩週收集胎糞 (meconium) 和未脫殼的雞蛋 (dead-in-shells) 做檢查。假若血清學的試驗能提供和這系統相同的監測,則也可以應用於孵化場的檢查。

1. 病原菌的鑑別

視臨床症狀發生情況的大小、實驗室的設備、流行病學上的資料和所做試驗的目的來決定採樣的頻率和樣本的型式。

做細菌檢查之個體樣本,應在使用抗生素治療之前儘快以無菌的方式採樣。樣本的採集最好在急性的病程發生時,或是在死亡後立刻進行。在密集飼養的養雞場裡必須同時採集環境中的樣本,例如墊料或房舍的內面的拭取物,來檢查病原菌之存在與否,這方法是最有效的方法但成本也很高。在送至實驗室的過程中,必須注意避免樣本互相污染。樣本必須包裝在低溫之下,而且要註明詳細的採樣資料。如果可能的話,體型較小的動物可以收集一到二隻生病或已死亡的整隻完整樣本,送到實驗室做檢查 (17)。

˙ 沙門氏桿菌分離之培養基 (3,6,8,11,17)

(a)

預先加強培養基

因為在環境、動物飼料和食物所採集得的樣本中,所含的沙門氏桿菌量都非常低,所以必須用例如蛋白棟緩衝水溶液 (buffered peptone water) 來增菌以幫助細菌的分離。預先增菌培養基是可以使這數量很少而且可能已經因冷凍、加熱或崩解而損壞或將近死亡的沙門氏桿菌復活,而使分離的過程會更順利些。

(b)

增菌培養基

這些是含抑制其它細菌而不會影響沙門氏桿菌生長的選擇性添加劑之液體或是半固體培養基。雖是如此,但是有些仍對某種的沙門氏桿菌有毒性,例如亞硒酸鹽 (selenite) 對 S. choleraesuis 有毒性,鹼性亮綠 (brilliant green)則對 S. dublin 有毒性。利用溫度的昇高也可以增加培養基選擇性分離的,在很多實驗室裡都使用溫度 43℃,但是有些培養基在 43℃ 時會產生抑制沙門氏桿菌的生長,例如連四硫酸鹽 (tetrathionate) 和 Rappaport-Vassilliadis 培養基會抑制 S. dublin 的生長。運動性選擇性增菌培養基添加0.1 ~ 0.15% 營養瓊脂,可以加強沙門氏桿菌分離的敏感度,以及和其它細菌混合生長的繼代時,可增加沙門氏桿菌的生長比例來使其更容易分離出沙門氏桿菌。要增加沙門氏桿菌的分離率必須注意培養基的配方、培養溫度和接種的樣本之量等。選擇性增菌培養基如加入連四硫酸鈉(sodium tetrathionate) 的 Muller-Kauffman 液體培養基、亞硒酸鹽 (selenite) 培養基、鹼性亮綠 (brilliant green) 的 Rappaport-Vassiliadis 液體培養基或半固體的 Rappaport's 培養基。

(c)

選擇性覆蓋培養基

這些是固體選擇性的瓊脂,在某種程度上培養基可以區分細菌的生長。它們可以抑制其它細菌的生長,並提供一些沙門氏桿菌的主要生化特性的區別資料 - 通常它們不會發酵乳醣但會產生硫化氫 (H2S)。於 37℃ 培養下 24 和 48 小時後判讀結果。在這培養基上形成沙門氏桿菌的特徵性菌落,可以和其它細菌的菌落加以區別,但是變形桿菌 (Proteus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas) 和檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter) 則例外。偶而也可分離出可以發酵乳醣的沙門氏桿菌,而且硫化氫的產生也有很大的差異。 S. abortus ovis 的生長速度相當慢,它在非選擇性血液培養基裡通常需要培養 72 小時以上。這類固體選擇性培養基有;鹼性亮綠瓊脂培養基、去氧膽特靈檸檬酸鹽 (deoxycholate-citrate) 瓊脂培養基和亞硫酸鉍 (bismuth sulphite) 瓊脂培養基。其它有更多的此類培養基,可以由文獻中以及培養基的目錄中找到。

˙ 菌落的鑑別

可疑的菌落必須在選擇性和非選擇性培養基內做次培養來確保沒有其它細菌的污染,例如變形桿菌等。假如培養基裡有多量純粹的生長時,可以將這可疑的菌落用多價沙門氏桿菌分類血清在玻片上做凝集反應 (10,12)。有些菌落可能不會產生凝集作用,這時需要用生物化學的試驗方法來加以確認。這些試驗可以用醣蛋白凍水 (peptone water sugars) ,或是商業用系統例如 API,或是組合培養基例如三醣鐵瓊脂培養基 (triple sugar iron agar) 等,來做為篩別其它細菌之用 (5)。

可以用特異性血清直接在玻片上做凝集反應來判定其 O 因子 (factor) 和H抗原以及在某些特殊狀況下之 V i抗原。如果是具有雙相 (biphasic) 的細菌時,必須將已知細菌相的的抗血清加入半固體培養基裡,來繼代以測定其相的分類。先以抗數種因子之血清作篩別試驗,再進一步使用單價分類血清 (monovalent typing sera) 。大部份的實驗室對常具的血清型都能夠加以分類,但最好還是利用參考實驗室的設備來確認所分離到的細菌,並且也可以得到這細菌的噬菌體之類型,假如可能的話還可以得到它的質體外廓 (plasmid profile) 的資料。 許多血清型的變異株可以進一步用生物化學的試驗方法來確認,例如用麥芽醣 (maltose) 和衛矛醇 (dulcitol) 等,它們可以用來區分 S. pullorum 和 S. gallinarum。同樣的,所有分離出的細菌都必須做抗菌物質的敏感性試驗。

2. 血清學試驗

˙ 感染的動物及畜群之血清學鑑別

有許多的方法可以用來診斷動物的沙門氏桿菌感染。在禽類方面可以使用全血的試驗,它是用染色之抗原來進行的血清凝集試驗 (SAT),它用來鑑別 S. pullorum/gallinarum 的感染,效果非常好而且已經有 50 年的歷史了。因為 S. enteritidis 具有和 S. pullorum/gallinarum一樣的 D 群體抗原 (group D somatic antigen),所以也可以用同樣的方法來檢驗。近年來其它的試驗如酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA)(1,15) 已經被發展用來做為禽類的 S. enteritidis 感染的診斷,以及養殖動物的其它沙門氏桿菌的感染之診斷。有些已經成為例行診斷的試驗並且可以在市面上買得到。文中僅挑選那些已經完全被評估過,並且已被做為沙門氏桿菌感染的例行診斷試驗方法,其它的試驗則祗在發展的階段,因此在這裡不予多述。

˙ 影響血清學診斷的因素

1.

血清學的試驗是用來診斷群體的感染而不是做個體感染的診斷。

2. 檢查出為陽性血清反應的動物可能不再感染沙門氏桿菌。同時持續在排出沙門氏桿菌的動物,可能用血清學陰性反應。同樣的道理也可以用在細菌培養上,糞便培養的結果為陰性時,並不代表這動物就未受到感染。但它們都不會成為主要的困擾。檢查出為血清學陽性的動物可能不再排出沙門氏菌,因為它們體內的循環抗體量可能一直維持很高的濃度,而在這群體中的其它動物可能仍是在感染的狀態。最近剛感染的動物可能血清檢查的結果為陰性,因為它們可能還未產生足夠的抗體,或祗是感染毒力較低的血清型,但如果用適當方法追蹤檢查的話,它們應該終究會產生抗體的反應。
3. 初生動物因為免疫系統還未健全,所以在血清學上無法對菌體脂多醣 (LPS) 抗原產生反應,直到 2 ~ 3 週齡時才能有此免疫能力。但它們會對鞭毛蛋白抗原產生血清學的反應。 雞可以從胚胎的卵黃囊裡被動得到母體來的抗體,這可以證明上一代族群已受到感染。
4. 在沙門氏桿菌感染之後,免疫球蛋白的濃度可以在 2 ~ 3 個月維持很高的量。如果有免疫球蛋白M 的話,則可以證明最近感染了沙門氏桿菌。
5. 疫苗接種的預防方法用在控制沙門氏菌的感染已經行之有年,所以假如是用血清學來診斷的話,必須分辨是疫苗所引起的抗體反應,還是真的感染了沙門氏桿菌。
6. 抗生素的治療對血清學試驗所造成的影響仍不清礎。有些人發現經過抗生素治療之後血清力價會減低,但有些人則認為沒有影響。但是不管怎麼說,如果使用過抗生素來治療沙門氏桿菌症的話,用血清學方法作診斷還比用培養的方法來得可靠。
7. 已有超過 2,000 種以上不同血清型的沙門氏桿菌,而且它們在血清學上可能會有交叉反應的現象,例如 S. typhimurium 和 S. enteritidis。
8. 在家禽方面,可以檢查雞蛋卵黃囊裡的沙門氏桿菌之免疫球蛋白,所以也可以從雞蛋篩檢雞群有否感染沙門氏桿菌。
9. 可以用濾紙圓盤 (filter-paper discs) 來採集血清,如此可以得到較長時間的保存,並且也可以減少運輸上的費用。

(a)

全血試驗

全血試驗 (whole-blood test) 可以在農場上對雛雞白痢和家禽傷寒做很迅速的診斷。全血試驗的敏感度很差,而且如果由沒有經驗的人操作時,會得假陽性和假陰性的反應發生。染色的雛雞白痢抗原祗能測出菌體抗體 (somatic antibody) 的反應,目前沒有商用測鞭毛抗體 (沒有針對沙門氏桿菌pullorum/gallinarum) 的反應劑。含有纖毛的抗原可能會造成假陽性反應的結果。 如果要知道全血試驗的詳細情形請看第 3.6.5 章 家禽傷寒和雛雞白痢。

(b)

快速玻片凝集試驗

將血清 (0.02 毫升) 和多價結晶紫染色的抗原 (0.02 毫升) 混合。將玻片輕輕搖動 2 分鐘後再作判讀。所有的材料在使用之前必須都恢復到室溫。

測試的血清必須沒有污染並且不能有溶血。經過一段時間的存放之血清,測試前最好先離心。測試火雞的血清時,混合時間最好延長為 3 分鐘。

為了防止可能有短暫性的非特性反應發生,陽性或可疑血清必須在 56℃ 下30 分鐘使之不活化後,再重覆做一次試驗。

(c)

血清凝集試驗

血清凝集試驗 (SAT) 相當不敏感,許多年老的動物,由於其他腸道細菌之作用,使它血清含有低量之抗沙門氏桿菌凝集素 (agglutinins)。單一的樣本沒有什麼參考價值,成對的血清是試驗最低的要求。這試驗的成本非常低,抗原可以隨時準備,而且不需要什麼貴重的設備。血清凝集試驗也可以用微滴定的方法來進行,而且也可以用來測定體抗原和鞭毛抗原的力價。製備血清凝集試驗的抗原時,最好有標準血清做品質的控制。

˙ 體抗原的製備

(1)

從沙門氏桿菌的原培養基中,取出後培養在以血液培養基基底 (BAB) 的培養皿內,或其它的培養基內,做單一菌落培養。在 37℃(±2℃) 下放置隔夜。

(2) 選擇一平滑的菌落做血清凝集試驗,以確有所需要的體抗原存在。
(3) 用滅菌白金耳將選定的菌落接種到置於一般的容器 (universal container)內之營養瓊脂培養基之斜面 (nutrient agar slope) 上.
(4) 在 37℃(±2℃) 下培養 8 ~ 12 小時。
(5) 在安全箱內,以2毫升的無水酒精與滅菌洗下培養菌,放入滅菌的容器內。
(6) 在室溫下讓它靜置 4 ~ 6 小時,以便使酒精能將細菌殺死及讓鞭毛脫離。
(7) 在 1,000g 下離心 5 分鐘。倒棄上液,然後加入足夠的石碳酸食鹽溶液,使其混濁度相當於 2 號 Brown's 管的混濁度 (約1 08 /毫升) 或其它合適的標準。
(8) 用已知血清為標準血清作滴定,以確保抗原中含有所需要因子。
(9) 貯放在 4℃ 的冰箱內以備使用。

˙ 鞭毛抗原的製備

(1)

從沙門氏桿菌的原培養基中,取出後培養在以血液培養基為基底 (BAB) 的培養皿內或其它的培養基內。在 37℃(±2℃) 下放置隔夜。

(2) 繼代於Craigie's 試管或其它容器內的半固體培養基 (約 0.3%) ,使其產生最適合的鞭毛抗原。假如是雙相 (biphasic) 的血清型時,必須加入可以抑制相關相的H抗血清。
(3) 用玻片凝集反應來檢查沙門氏桿菌是否在需要的相位內。假如正確的話,再接種到 20 毫升的營養液體培養基裡。在 37℃(±2℃) 下培養 12 ~ 18 小時使之有最合適的生長(假如相位對的話再繼代回半固體培養基)。
(4) 抗原的懸浮液加入40% 甲醛 (formaldehyde) ( 需要帶手套並且在安全箱內操作) ,然後再放置隔夜。
(5) 以適當分類的血清作血清凝集試驗來測試這抗原。

˙ 試驗步驟

(1)

最好的篩別方法是將血清稀釋成 1/20。即將血清以生理鹽水稀釋成 1/10 後,取 0.25 毫升加入 0.25 毫升的抗原中。

(2) 在測定體抗原時,放在 50℃ 的水浴中 24 小時,測定鞭毛抗原時4小時。
(3) 將呈陽性反應的血清再稀釋成 1/20 到 1/320,然後再用適當的抗原重新測定一次。
(d)

用酵素結合免疫吸附試驗來鑑別 S. enteritidis

有兩個主要基本的方法來測試 S. enteritidis 的特異性免疫球蛋白 G(IgY):間接 ELISA(1) 和競爭"三明治型"(competitive "sandwich type") ELISA(15)。

間接 ELISA 是使用偵測性抗原包覆在微滴定盤內的小孔裡。在使用阻斷反應劑來減低非特異性的結合之後,將測試樣本加入小孔內。用抗體/酵素的標示結合物來結合樣本內的特異性抗體。可以使用許多不同的抗原,包括脂多醣 (LPS)、鞭毛、SEF14 纖毛、細胞外膜蛋白和粗抗原等。

競爭"三明治型"(competitive "sandwich type") ELISA 是使用一種特異性反應劑 - 單株抗體 (Mab) - 來包覆小孔。跟著再加入純或粗抗原溶液。加入測試血清之後再加入標示結合的單株抗體,假如樣本內含有特異性抗體的話這標示結合的單株抗體不會和抗原結合。可以同時加入測試血清和標示結合物而使操作的時間縮短。可以製備 S. enteritidis 的脂多醣 (LPS)、鞭毛和SEF14 的單株抗體。

兩種試驗系都有其優缺點。間接 ELISA 較簡單而且可以買到所有雞、火雞、鴨和哺乳類等之沙門氏桿菌血清型之反應劑。競爭性 ELISA 可以使用於所有品種的動物,而且一般看起來顯示比較有特異性,但它的缺點是不易買到所有血清型的反應劑,而且它仍有一些結合上的問題,所以它的敏感度比間接 ELISA 的敏感度還低。在野外時兩種試驗都會產生假陽性反應。

兩種試驗方法都可用血清、卵黃或由濾紙圓盤釋出的重組乾燥血液,它們可能經過抗菌劑的處理,但仍未喪失它們的抗體力價。可區別不同血清型的沙門氏桿菌感染會產生的差異,在血清型B群和血清型D群之間會產生一些交叉反應,最好能使之減少。能使沙門氏桿菌之特異性抗體完全被吸附時,將反應停止的 "截止"點,目前還沒有適當的方法可以測定出來。

ELISA 可以用自動化處理,因此可以執行大量樣本的檢驗工作。主要的問題是需要很昂貴的儀器,而且所需的反應劑的成本也是非常驚人的。

舉國際畜疫會在 Weybridge 的參考實驗室所用之 ELISA 為例做說明。所需要的配備列述如下。

˙ 設備

Falcon 微滴定 ⅢPVC 試驗盤、適當的吸管和量筒、試驗微盤清洗器、ELISA試驗盤判讀器、405 ~ 410 nm 的測試用濾光刪和 630 nm 的參考用濾光刪。

˙ 抗原

(1)

可以買到商品化的石碳酸-萃取的 S. enteritidis 脂多醣 (LPS)(Sigma 目錄號碼:L6011) 。它可以溶於1毫升的去離子水之後,用 pH7.2 磷酸緩衝溶液 (PBS) 配成濃度為2.5毫克/毫升,分裝成 100ml 再貯存於 -20℃ 之下。使用前用適量的緩衝溶液使之溶解。

(2) 脂多醣抗原可依照 Westphal 和 Luderitz(16) 等人的方法來製備,並且用 Gerhardt 等人的方法,標準化的碳水化合物的濃度,最後調整成 1,000μg/ 毫升。

˙ 血清和標示結合物的稀釋液

將牛血清白蛋白 (BSA)(2 公克) 和 Tween 20(0.05 毫升) 加入PBS(100 毫升)。( 也可以用奶粉 [1 公克] 來取代牛血清白蛋白 ),然後貯存於 4℃ 之下,每週都必須製備新鮮溶液。

包覆用緩衝液:加碳酸鈉 (1.59 公克) 和重碳酸鈉 ( 2.93 公克) 到去離子的水裡 (1 公升) 並調整成pH9.6 ( 也可以將一碇 0.05M Sigma 碳酸-重碳酸緩衝溶液 [目錄號碼:C-3041] 溶於去離子水[ 100 毫升]) 。 貯存於 4℃ 之下,並且每二週更新一次。

基質緩衝溶液:用 10% 的二乙醇胺 (diethanolamine) 溶液於去離子水內。分裝前必須將二乙醇胺溶液預熱至37℃,用1摩爾的鹽酸將酸鹼度調成 pH9.8。貯存於 4℃ 之下,並且每二週更新一次。

酵素軛合物:將羊抗-雞免疫球蛋白和鹼性磷酸酵素軛合 (例如ICN 免疫生物產品,也可得自 Sigma:A9171)。也可以用其它動物的抗-雞免疫球蛋白。貯存在 4℃,並用稀釋液稀釋成適當濃度,每週更新一次。

酵素基質:將一碇ρ-雙鈉硝基苯磷酸鹽 (ρ-nitrophenyl phosphate disodium)(5毫克) 溶於基質緩衝液 (5 毫升)裡,使用前30 分鐘之內配製,貯存於陰暗處。

˙ 標準對照

(1)

陽性對照抗血清是來自四隻肌肉接種 106 S. enteritidis 的一週齡無特定病原(SPF)雞。

(2) 陰性對照血清A是來自四隻一週齡無特定病原(SPF)雞。
(3) 陰性對照血清 B 是來自 58 隻一週齡沒有感染沙門氏桿菌的種雞。血清置於一起並分裝成 100μl 並貯存於 -20℃之下。

B. 疫苗和診斷用生物製劑條件

已有許多不活化疫苗被用在各種品種的動物,來控制各種不同血清型的沙門氏桿菌症。疫苗一般使用加熱或福馬林使之不活化。許多國家也使用活毒疫苗,這些包括半粗糙菌株 (semi-rough strains),例如家禽傷寒的 9R 和 S. HWS51。另外一種減毒方法是,使用特別成長因子的變異株 (auxotrophic mutants) 來預防沙門氏桿菌的感染,這方法曾被前東德使用過。這使用分子生物技術的變異株來製造的變異株疫苗,已經在家禽方面開始被使用,這些包括 aroA 變異株和表現腺甘酸環酵素 (adenylate cyclase, CYA) 和環腺甘酸接受器蛋白 (cyclic adenosine monophosphate receptor protein, CRP) 的基因密碼之變異株 (2)。

1. 種菌的管理

(a)

種菌的特性

所有的死毒和活毒疫苗之細菌株(或各別的菌株),必須要有詳細的來源資料和有穩定的表現型 (phenotypic) 和/或基因型 (genetic) 特性記錄。活毒疫苗菌株必須有穩定特性之標記,以便和野外菌株做一區別。所有的標記和減毒必須在穩定狀態,最好是來自兩個獨立的變異株。

(b)

培養方法

種菌必須在前述許多適合沙門氏桿菌生長的培養基裡繁殖和繼代。培養基裡不能含有血清或是動物的組織。培養基可用固體培養基、放於 Roux 玻璃瓶,或是使用液體培養基,此可利用大量發酵的設備來配合。

(c)

疫苗之檢定

(1)

純化

疫苗所用的菌株必須做如下之檢查:

˙ 將細菌懸浮液做成抹片後用格蘭氏 (Gram) 染色檢查。
˙ 非選擇性培養基中培養必須均質化。
˙ 用生物化學試驗方法來檢查其代謝上所需要的條件。
˙ 檢查其標記和噬菌體類型。
˙ 用特異性抗血清來做凝集試驗。

(2)

安全性

用小白鼠來測 LD50 (50% 致死劑量) 或 ID50 (50% 感染劑量 )。用10 倍的野外使用活毒疫苗劑量或是兩倍的死毒疫苗劑量,經由推薦的注射部位,接種適當的年齡動物。觀察動物是否有不良反應發生,活毒疫苗應在一系列的繼代在感受性動物後沒有毒力恢復的情形。亦可以考慮做疫苗重覆注射免疫之測試。

(3)

效果

必須做實驗室和野外的測試來證明疫苗的有效性。實驗室的測試,包括接種推薦劑量和年齡動物下後之攻擊試驗。效力試驗所得的資料也可以用來做為每一批疫苗效力測試的基礎資料。疫苗的野外效力測試常會遇到許多的困難及問題。

(4)

環境的評估

使用活毒疫苗時必須測試它在環境中存留的能力,以及感染暴露在此疫苗菌株下的其他動物的可能性。

2. 製造方法

製造疫苗時必須要在乾淨合適的房舍內,並且祗允許操作人員進入。必須小心避免感染區和未感染區之間的交叉污染,以及操作人員和環境之污染。操作人員不得感染任何疾病,操作人員進入疫苗生產區和動物室必須穿戴安全衣帽。

生產疫苗的菌株必須來自原始的種菌株,繼代的次數則視過程中株菌的有效檢定而定。疫苗的菌株必須培養在合適的培養基,例如營養培養基,並且要保持培養基的新鮮度,在有或無空氣的狀況下,於 37℃ 培養 24 小時。用沉澱或離心的方法來收集菌體。另外,菌苗也可以固體培養基後收集,例如使用營養瓊脂固體培養基。活毒疫苗,可以用 pH7.0的PBS 來稀釋成懸浮液或加以冷凍乾燥。

使菌株不活化的時間,必須是可使細菌全部不活化再加上 33% 以上的時間,不活化個過程必須使每個菌體都要能平均地接觸到。

不活化劑疫苗的防腐劑、賦形劑、多劑容器內的穩定劑,或任何加入疫苗的物質等都必須不會影響對免疫的效力者

3. 製程中的管制

必須注意下列幾點:

  • 由目視監控懸浮液,由格蘭氏染色及培養在非選擇性培養基檢視其均質程度。
  • 用特異性抗血清做玻片凝集反應。
  • 用比濁法 (turbidimetry) 和/或玻片計數法來計算細菌的濃度。
  • 接種非選擇性培養基,或可使細菌恢復生長的營養培養基,以測試不活化的效果(死毒疫苗)。
  • 在冷凍乾燥的前和後,檢視活菌數(活毒疫苗)。

4. 分批管制

(a)

滅菌

參考第 1.4 章的方法來作無菌及無其它生物物質污染之測試。

(b)

安全性

以小白鼠在實驗室裡做 LD50 和 ID50 的測試,以間接算出它在接種動物上的安全性。每一批所生產的疫苗必須依照產品的說明,以至少兩倍劑量的死毒疫苗或是 10 倍劑量的活毒疫苗來接種標的動物。

(c)

力價

測定疫苗力價的方法是,用小白鼠和/或其它品種的實驗動物接種疫苗後作攻擊試驗,以及標的動物的免疫反應血清學試驗。

(d)

免疫的有效時間

無法找到疫苗免疫有效時間的資料。根據工作人員的心得,認為死毒疫苗可以提供 6 個月的保護期,而活毒疫苗則可提供一年以上的保護。但是必須要注意的是,如果有強毒的菌株攻擊時,疫苗仍可能失效。

(e)

穩定性

缺乏有關死毒疫苗穩定性的資料,但是由於含有脂多醣 (LPS) 所以它們應該有很好的穩定性。活毒疫苗的穩定性可由細菌數目的計算來做估計。

(f)

保存劑

乙基汞化水楊酸鈉 (thiomersal) 可能是最廣泛被使用的保存劑。

(g)

注意事項

由於死毒疫苗含有脂多醣 (LPS) 所以可能會造成懷孕動物的流產,同樣的活毒疫苗不能使用於懷孕的動物。如果使用內毒素測試的話,可以避免使用雙倍劑量時發生之危險。疫苗在接種部位可能會造成腫脹等副作用。

5. 成品的測試

(a)

安全性

用雙倍劑量來測試死毒疫苗的安全性,活毒疫苗則用 10 倍劑量接種標的動物來做安全性的測試。

(b)

力價

測試疫苗的力價來反應出疫苗在標的動物使用的效力,並且必須用一套合適的標準來應用於每一批生產的疫苗。也可以用 O-H 抗體的產生反應來測死毒疫苗的效力,但必須要注意的是,血清中的抗體祗是宿主體內對抗沙門氏桿菌的防禦系統之一部份。另外也可以用小白鼠的 LD50 來測定疫苗的效力。

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