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馬A型流行性感冒
Equine influenza (virus type A)
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馬流行性感冒

摘要

馬流行性感冒是由正粘液病毒科(family Orthomyxoviridae)的流行性感冒A,B屬(genus InfluenzavirusA、B)裡的兩種A亞型(subtypes)流行性感冒病毒所引起的急性呼吸系統疾病。在具有高感受性的動物感染時,其臨床症狀是發熱(pyrexia)和激烈的乾咳並伴隨著粘液性化膿性的鼻分泌物。免疫的動物感染後,可能有些症狀不會出現。一般而言,流行性感冒在一群有感受性的族群裡會以非常快的速度傳播。診斷動物是否感染流行性感冒病毒是根據由急性呼吸症狀的動物身上分離出病毒,或是比較急性期和恢復期的成對血清的抗體力價增長的情形。也可以用酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)的方法,檢查呼吸道分泌物裡存在的病毒抗原。依流行病學研究選擇合適的病毒株,製成不活化疫苗可以減低疾病的傳播速度和嚴重程度。

病原菌的鑑別:雞胚胎或細胞培養可以用來作為病毒的分離方法。病材的來源是用棉花棒採取鼻咽部的分泌物或是在鼻和氣管的洗出物中。雞蛋最適合用來作為分離馬流行性感冒病毒之用。

是否有病毒增殖是用血球凝集試驗(HA)來檢查,若是在細胞培養中,則是以血球吸附試驗(HAD)來檢查,紅血球是來自雞或天竺鼠。如果血球凝集反應或血球吸附試驗的結果是陽性時,可以接著用特異病毒株的抗血清(strain-specific antisera)以血球凝集抑制試驗(HI)來做病毒的分型。所採集的分離株必須以最快的速度送至世界參考實驗室(國際畜疫會和世界衛生組織)以便做病毒的分型和病毒株的收集。如果樣本所得的結果是呈陰性反應(也就是在第一次繼代之後血球凝集反應或血球吸附試驗呈陰性反應)時,應再重新繼代。從預防注射過之馬匹所採集到的樣材可能需要繼代五次以上才能分離得到病毒。

血清學試驗:診斷是否有流行性感冒的感染一般都需要採集成對的血清來進行比較才能確定。當然視臨床症狀時,應立即採集其血清樣品(即為第一次血清),第二次採集的時間則是在二週之後。血清需經過熱處理使之不活化(heat-inactivated)並且先做一些預處理的手續,以減少非特異性的反應發生。血清抗體力價是以血球凝集抑制試驗,或單一輻射溶血(SRH)試驗。單一輻射溶血試驗不需要先做前處理和血清的連續稀釋。血球凝集抑制試驗(HI)和單一輻射溶血試驗可以得到類似的結果,但是馬匹經免疫後再感染時,使用單一輻射溶血試驗敏感度會比較高。

疫苗和診斷用生物製劑之必要條件:馬流行性感冒病毒之疫苗是經過雞胚胎或是組織培養增殖的 1 和2 亞型病毒株,它們經過濃縮和純化後再用福馬林或是β-乙丙內酯(beta-propiolactone)加以不活化。疫苗的保護力是以血球凝集試驗檢測免疫後產生之抗體高低而定。抗體反應,一般來說都非常短,因此必須用多次免疫來維持較高的保護抗體。使用佐劑可以延長抗體的產生時間和濃度。

流行性感冒疫苗已廣泛被用來作為本病的預防,在歐洲、美國和亞洲競賽馬匹經常都做疫苗的預防注射。有些國家的騎術協會(equestrian organizations)都會強制要求所有的賽馬接受疫苗注射。但仍有許多國家如印度、中國及澳洲還沒有廣泛地使用本病疫苗,澳洲和紐西蘭至今仍為非疫區。疫苗的基礎免疫分別是在第0、1和6個月注射一次疫苗,之後每年至少補強注射一次。有些地區每隔3 ~ 6個月就做一次預防注射。

疫苗用在預防A/馬/1型(A/equine/1)病毒有非常好的效果,但是經常有報告指出當爆發A/馬/2型(A/equine/2)病毒感染時則疫苗失去預防的效果。疫苗無法產生足夠的免疫力的主要原因是疫苗產生的力價不夠、疫苗免疫時程不當和疫苗的病毒已非時下流行的病毒株而致產生的抗體之抗原性不符合。一個改良的方法是在疫苗製程中,先在試管內(in vitro)測試疫苗的效價(單一輻射溶血試驗)之後,才加上佐劑。在馬,抗體高低與其保護力的相關性已確認。目前已進行的監控計劃,即是先對全部馬流行性感冒病毒的抗原變異趨勢做通盤的瞭解之後,再提供疫苗株選擇的依據。

A.診斷技術

馬流行性感冒的由兩種副型病毒所引起的:它是屬於正粘液病毒科(family Orthomyxoviridae)的流行性感冒A,B屬(genus InfluenzavirusA、B) 裡,A屬中的兩種亞型(subtypes)流行性感冒病毒亞型1 (H7N7) 和 亞型2 (H3N8)。雖然它們並不是人類真正的流行性感冒病毒,但是它仍會感染,這種感染雖不常發生,且可能不會有臨床症狀,但是對實驗室的研究人員來說仍有潛在的危險性。

所有的流行性感冒病毒對有感受性的宿主包括雞胚胎和培養細胞都有很高的感染性,因此在處理感染的雞胚胎或培養細胞時必須非常小心以避免產生交叉污染的現象(17)。標準病毒株不能在一般的診斷實驗室裡繼代,至少不能和待診斷的樣本在同一時間和同一地點一同操作。在操作病毒過程之前和之後,所有實驗設備和地點都必須徹底清潔和消毒,以避免病毒的污染。最好是在生物安全防護設施中(biohazard containment)操作

在臨床症狀出現的同時,必須儘快進行採樣的工作,這些採樣工作包括用棉花棒採取鼻咽部的分泌物或是在鼻和氣管的洗出物,洗出物的取得是用內視鏡來操作。拭子(swabs)可用鐵線前端綁棉花 / 紗布,採取樣本時,必須穿透鼻縱膈深入到鼻咽部並停留約一分鐘,以便吸附所需的粘液。取得粘液之後,立即置入輸送保存液中,輸送保存液為含40%甘油的磷酸緩衝溶液(PBS)或含2%磷酸類胰朊酵素(tryptose phosphate)、2%抗生素溶液(青黴素[10,000單位],鏈黴素[10,000單位]溶於滅菌蒸餾水[100毫升])和2%抗黴菌素(fungizone)(250公克/毫升)的磷酸緩衝溶液(PBS)。假如樣本在1 ~ 2天內就用來接種時,可以貯存在4℃,但是如果要保存更久時,則必須存放在 -60℃ 或更低的溫度。輸送樣本時,最好使用冰塊。

每次祗做一個樣本的處理,將拭子上的粘液擠出,並將拭子妥善處置後丟棄。如果樣本有細菌污染之虞,可加入抗生素,加抗生素的樣本可以用冰塊保存30分鐘,其餘的樣品則貯存在 -60℃之下。作用15分鐘並以1,500g 離心 30 分鐘以除去細菌和雜渣,取上清液用來接種。樣本不適合用過濾的方法,因為流行性感冒病毒可能會被吸附在過濾器上。

1.

病原的鑑別

本病毒可以藉由雞胚胎或是細胞培養中接種而分離。用A / 馬 / 2 病毒株接種在雞胚胎和Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞來做比較發現,MDCK對病毒的增殖有選擇性,故從樣品接種分離到的病毒不見得為造成疫情的最主要病毒株,因此雞胚胎較適合用於病毒分離,特別是用於疫苗株的選定時(6)。

(a)

雞胚胎

將受精蛋置於溼度保溫箱內(37 ~ 38℃),並且每天翻轉兩次,在10 ~ 11天之後照蛋檢查胚胎,選取含活胚胎的雞蛋備用。用酒精將氣室的部位洗淨,並將蛋殼鑽一小孔。每個樣品接種三個雞蛋,分別各接種0.1毫升的樣本到羊膜腔(amniotic cavity),將針頭退出大約1公分時再接種另一0.1毫升到尿囊腔(allantoic cavity)。另外,樣本也可單獨注入到尿囊腔。最後再用石臘或膠帶將洞口封往,再將蛋培養在34 ~ 35℃下2 ~ 3天。

收集上述蛋在4℃下放置隔夜以殺死胚胎,並減少收集病毒時雞胚胎的出血量。將蛋殼外部消毒好之後,用吸管收集羊膜腔和尿囊腔的液體,每次收集的液體都分開放置。這些收集好的液體用PBS配成0.5%雞紅血球(RBC's)或0.4%天竺鼠紅血球懸浮液,進行血球凝集(HA)試驗,沒有產生凝集反應的紅血球當試管或玻璃盤傾斜時會往下流。如果沒有凝集反應發生時,再這些採集液體混合後再重新在雞蛋裡繼代;所有凝集反應陽性的樣本,則將其分成等份貯存在 -70℃,取其中一份用血球凝集試驗來測力價。如果它的力價在1/16以上的話,再用抗血清做亞型1 和亞型2 的病毒分型。如果力價不高的話,將凝集反應陽性的樣本再繼代。為了避免產生缺損干擾病毒顆粒(defective interfering particles),可先將其稀釋至1/10、1/100、1/1,000等不同濃度再接種增殖。選擇陽性反應最高的樣本留下並貯存起來。繼代次數可能需要高達五次以上,特別是從接受過疫苗免疫的馬所取得的樣本。

(b)

細胞培養

如果無法取得雞胚胎的話,可以用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞株(MDCK, ATCC CCL34)的細胞培養方法來分離馬流行性感冒病毒。細胞在試管裡長滿後再接種樣品,每個樣品做三重覆,分別取0.25 ~ 0.5毫升如前述方法處理後的樣品接種於試管內。培養基內不含血清,但含有2μg/毫升的胰蛋白酵素(trypsin),並每天檢查其細胞有無細胞病變作用(CPE)。如果發現呈陽性反應,或是無細胞病變作用的樣品培養七天之後,取其上清液做血球凝集試驗。力價如果大於 1/16 時,立即做分型試驗;如果呈陰性反應或是力價小於 1/16 的樣本,則再繼代。

另外,也可以用血球吸附試驗來篩檢培養細胞。這個方法是用來檢測細胞表面有否病毒抗原。吸出培養液之後,用磷酸緩衝溶液洗試管後,加入一或二滴雞或天竺鼠紅血球懸浮液。小心轉動試管然後置於22℃(±2℃)下30分鐘。以磷酸緩衝溶液洗掉未結合的紅血球,然後在顯微鏡底下檢查是否有血球吸附的現象。

(c)

血球凝集酵素

剛分離的馬流行性感冒病毒之分型,最好是用特異性抗血清來做血球凝集抑制試驗。不同動物所產生的抗血清會有交叉反應(cross-reactivity),惟雪豹(ferrects)所產生的抗體最具特異性(10)。最初分離之物質可以用Tween 80/乙醚來處理以除去病毒的感染力,並減少交叉感染的機會。特別是對 A/馬 / 2 病毒株來說,用這方法處理之後,可以增加血球凝集試驗的效果(7)。

可以用巨量(macro-)和微量的試驗(microtests)方法來進行血球凝集抑制試驗。將抗原稀釋成1/4或1/8血球凝集反應的力價。經處理(減少其非特異性)的抗血清,以磷酸緩衝溶液連續稀釋,在加入抗原之後,將這混合物在22℃(±2℃)下作用30分鐘。再加入紅血球(0.5%雞或0.4%天竺鼠紅血球),輕緩混合之後在22℃(±2℃)下作用30分鐘。微量試驗的磷酸緩衝溶液、血清和抗原都是使用0.025毫升,然後再加0.05毫升的紅血球懸浮液。而在巨量試驗裡,全部都用0.5毫升。力價即完全抑制凝血的最高血清稀釋倍數,所謂抑制凝血是當試驗盤傾斜時血球會朝下流的狀態,抑制情況不完全亦視為有凝集反應發生。所採集的樣本必須以最快的速度送至世界參考實驗室(國際畜疫會和世界衛生組織),以便做病毒株的抗原變異監控計畫和新毒株的收集等。

必須同時做標準抗原以確認病毒,包括:亞型1(例如,A/equine/Prague/56及 A/equine/Newmarket/77)和亞型 2 (例如,A / equine / Miami / 63 、A / equine /Fontaine-bleau / 79、A / equine / 2 / Newmarket / 93 及 A/equine / Kentucky / 94) 。另外,如果有同一地理區域內的新近分離病毒株也應一併加入。標準抗原必須以 Tween 80/ 乙醚處理以避免互相感染。待測試抗原和標準抗原必須用反稀釋(back-titrated)的方法來確定它們的抗原含量。

(d)

神經醯胺酵素

分類神經醯胺酵素(neuraminidase)必須用特殊的抗血清並且無例行可遵循的技術可供參考,所以這分類的操作最好是在參考實驗室裡進行。

(e)

用酵素結合免疫吸附試驗來檢測病毒抗原

在無法進行分離病毒的實驗室,欲由鼻分泌物檢測有否流行性感冒病毒抗原存在,可以用單株抗體(Mab)對病毒核蛋白(nucleoprotein)進行抗原捕捉酵素結合免疫吸附試驗(antigen capture ELISA) (1,2,8)(已有商業化之產品)。

ELISA可以給提供一個很迅速的試驗結果,但不能用來取代病毒的分離,因為送到分離實驗室來分類病毒以便做整個防疫的監控以及取得新病毒的變異株才是最重要的。在資源有限的情況下,先以酵素結合免疫吸附試驗篩得陽性反應樣本,再採集該樣本來做病毒的分離。

˙ 試驗步驟

(1)

將 100μl 等量的鼻拭物萃取液分別置於以多株兔抗-H3N8抗體(polyclonal rabbit anti-H3N8)被覆的微試條(microstrips),然後在22℃(±2℃)下感作90分鐘。用含有0.05%Tween 20 的磷酸緩衝溶液(PBST)洗三次。

(2) 加入用緩衝液稀釋 1/150的100μl 單株抗體 - 蔊菜過氧化物酉每 軛合物(Mab-horseradish peroxidase conjugaete),然後在37℃下感作一小時。用PBST將微試條(microstrips)洗六次。
(3) 加100μl 等量的四甲替聯苯胺(tetramethyl benzidine)於22℃(±2℃)下感作10分鐘。加入100μl濃度為0.18M 的硫酸(sulphuric acid)使反應中止後再於450 nm 下測其吸光度。

試劑可洽世界畜疫會參考實驗室(Newmarket,[參考第707 ~ 721頁的表])。

2.

血清學試驗

可以血清學方法檢測成對血清之抗體力價是否有增高判定。是否感染不管是否要分離病毒,都必須做這試驗。血球凝集抑制試驗和單一輻射溶血試驗為兩種相同效果而且簡單又廣泛被使用的方法。也可以用補體結合(CF)試驗,但是它未標準化或普遍化。

(a)

血球凝集抑制試驗

使用之前所述的標準抗原,如果可能的話,也使用最近發生病例的抗原。為了增加本試驗抗原的敏感度,所以先用Tween 80/乙醚來處理抗原,特別是針對A/馬/2病毒抗原更需如此。經過親水處理過的抗原可以自國際畜疫會參考實驗室取得(德國,慕尼黑)。抗最近分離A/馬/2病毒之冷凍乾燥抗血清可以自國際畜疫會參考實驗室取得(Newmarket)。試驗最好是用適合的稀釋設備在微滴定盤內操作。血清先做預處理以便去除非特異性的血球凝集試驗,並且在56℃下30分鐘加以不活化。預處理包括以下之一:(a) 白陶土和紅血球吸附,(b) 高碘酸鉀(potassium periodate),或 (c) V. cholerae受器-破壞酵素(receptor-destroying enzyme)。以上述三種方法之一處理,都可以得到相同的結果。處理過的血清用磷酸緩衝溶液稀釋,加入1/4力價的抗原,溫和攪拌後於22℃(±2℃)作用30分鐘。再加入紅血球30分鐘後判讀結果。凝集抑制試驗的力價是能完全抑制血球凝集試驗的最高稀釋倍數的血清。成對的血清力價如果增加4倍以上時,表示最近有受過病毒的感染(17)。

˙ 血球凝集抑制試驗微量法

必須準備下列的材料:以Alsever's溶液配成的雞紅血球(1%[體積/體積]濃縮細胞)、U-型底的微滴定盤、磷酸緩衝溶液(PBS)、流行性感冒病毒(全病毒或是經過Tween 80/乙醚處理的病毒)、高碘酸鉀(KIO4)和甘油等。

˙ Tween 80/乙醚處理病毒

(1)

40毫升感染的尿囊液加入0.5毫升含10%(體積/體積)Tween 80的磷酸緩衝溶液,使 Tween 80 的最終濃度為 0.125%(體積 / 體積)。

(2) 在室溫下溫和混合5分鐘後加入20毫升的乙醚(diethyl ether)使其最終濃度為33.3%(體積),並在4℃下將這懸浮液充份攪拌15分鐘。
(3) 待靜溫分層之後,收取含病毒的水層至另一玻璃容器,鬆開瓶蓋讓乙醚隔夜自然蒸發掉(7)。

˙ 血球凝集力價測定

(1)

全排的小孔加入25μl的磷酸緩衝溶液。

(2) 第一孔加入25μl的病毒(稀釋 = 1/2),連續稀釋並留下最後一孔作為對照。
(3) 所有小孔再加入25μl的磷酸緩衝溶液。
(4) 所有小孔加入50μl 的 1% 紅血球。讓其在 22℃(±2℃) 下作用30 分鐘。血球凝集反應的力價是能使部份血球產生凝集反應的最高病毒稀倍數。

˙ 血清的預處理

(1)

將一份(150μl)的血清和兩份(300μl)剛製備好的0.016 M 高碘酸鉀溶液(38毫克溶於100毫升的PBS)混合均勻之後置於22℃(±2℃)下15分鐘。

(2) 再加1份的3% 甘油磷酸緩衝液來中和過量的高碘酸鉀溶液,混合後置於22℃(±2℃)15分鐘。
(3) 在56℃之水浴下加熱30分鐘使之不活化。

˙ 試驗步驟

(1)

微量滴定盤內的每一個小孔加入25μl的磷酸緩衝溶液。

(2) 加入 25μl 的血清於第一孔做 1/8 ~ 1/512 的連續稀釋,並留下最後一孔作為對照。
(3) 將抗原稀釋成有4 血球凝集單位的劑量(4 x 最低凝集劑量,亦即力價÷4)。
(4) 每一孔加入 25μl 並在 22℃(±2℃) 下作用30分鐘。
(5) 每一孔加入 50μl 的 1% 紅血球,並在 22℃(±2℃) 下作用30 分鐘。
(6) 將試驗盤傾斜 70°來判讀結果,如果沒有凝集反應發生,則視為陽性。
(b)

單一輻射溶血(SRH)試驗

本試驗用的瓊膠中,含有病毒抗原、定量的紅血球及天竺鼠補體。瓊脂打小孔並放入待測血清。流行性感冒病毒抗體和補體會使被覆抗原的紅血球溶解,而形成一圍繞小孔的明顯溶血環,可以量出這溶血環的大小(9,15,16)。

這試驗可以用特製的免疫擴散盤(Hyland, Miles Scientific)來操作,但也可以用培養皿。綿羊紅血球以 Alsever's 溶液洗三次。補體可以由市場上購買或是用健康天竺鼠的血清。抗原是用尿囊液或是純化的製備物,使用血球凝集抑制試驗裡相同的病毒株。以高碘酸鉀或氯化鉻(chromiium chloride)使病毒附在紅血球上,將附有抗原的紅血球和補體混合,並加於含上1%的瓊脂(低熔點)的磷酸緩衝溶液。必須注意在任何時候溫度都不能超過42℃,將上述混合液適量分注於試驗盤,於4℃靜置隔夜。在瓊脂上打直徑2 ~ 3毫米和距離12毫米的小孔,小孔距離試驗盤的邊緣是6毫米。製備好的試驗盤在4℃下可以保存1 ~ 2週之久。每一個抗原製備而成的試驗盤都必須先經過已知的陽性和陰性抗血清的測試。

血清用56℃作用30分鐘使之不活化,但不需要再做進一步的處理。成對血清需於同一試驗盤上做二重覆之檢測,且所有血清均需在對照試驗盤同時檢測,對照試驗盤含除了病毒之外的所有成份做測試。或許,另外一種不相關的病毒,例如 H1N1 病毒可以用於對照的試驗盤內。對羊紅血球有溶血性的血清必須先用羊紅血球預先吸附。溶血區應該是清楚不模糊或半透明。溶血區域可以由溶血範圍的大小測量出來。

˙ 材料

氯化鈉、氯化鉀、HEPES(N-2-羥乙基對二氮己環,N-2-乙磺酸)、病毒抗原、牛血清白蛋白 (BSA)、NaHPO4、KH2PO4、瓊脂、對照抗血清、NaOH、氯化鉻(chromium chloride)、作為補體的天竺鼠血清、3毫米的瓊脂打孔器、塑膠盒、測量溶血區域的工具、透明塑膠免疫試驗盤(6 x 11公分)、打孔器的模板、水浴器、保溫箱和鈉疊氮化物(sodium azide)。

˙ 反應劑的製備

(1)

生理鹽水/HEPES溶液:0.85%氯化鈉(4.25公克/500毫升),0.05M HEPES(5.95公克/500毫升)和0.02%鈉疊氮化物(sodium azide)。用氫氧化鈉調成 pH6.5 的溶液。

(2) 生理鹽水/HEPES/BSA溶液:同以上溶液相同,祗是另外加入0.2%(重量/體積)的牛血清白蛋白 (BSA)。
(3) 將抗原稀釋成有4 血球凝集單位的劑量(4 x 最低凝集劑量,亦即力價÷4)。
(4) PBS(倫敦)/PBS "A":氯化鈉(10.00公克),氯化鉀(0.25公克),Na2HPO4(1.45公克),KH2PO4(0.25公克)和鈉疊氮化物(0.20公克)。用蒸餾水調成1公升。
(5) 溶於磷酸鹽緩衝溶液的瓊脂:放PBS "A"於有攪拌子的燒瓶裡,緩緩加入10公克的瓊脂,再用高壓鍋使之完全液化。分注到玻璃瓶並貯存於22℃(±2℃)備用。
(6) 病毒抗原:收集含病毒的尿囊液並貯存在 -70℃。當製備致敏化綿羊紅血球時,劃一短的滴定曲線來決定使用尿囊液最適當的體積。流行性感冒H7N7 病毒株通常都是產生明顯的溶血區,但 H3N8 病毒株有時會產生模糊的溶血區,因此需要用離心的方法來濃縮病毒。
(7) 綿羊紅血球:將血液與等量的Alsever's溶液混合,並貯存在4℃。因為每一隻綿羊的紅血球特性都有不同,所以需要先做採血檢查。在使用前,將這血液保留二天,如果無菌操作做得好的話,可以保存三週之久。
(8) 補體:收集約300 ~ 350公克仔天竺鼠的血液,並分裝成小量貯存於 -70℃。使用前用冷水退冰並保存在4℃以備用。
(9) 血清的處理:使用未稀釋的血清。用56℃熱處理30分鐘使之不活化。避免重覆冷凍解凍。

˙ 試驗步驟

(1)

用生理鹽水/HEPES至少將綿羊紅血球洗三次。

(2) 用生理鹽水/HEPES製備8%紅血球(體積/體積濃縮細胞)溶液,先計算試驗盤的數目,使每盤有1毫升的量並且有1 ~ 2毫升的多餘。
(3) 加入預量好的尿囊液到8%的紅血球溶液裡。將這混合液在4℃之下靜置10分鐘。可能會有血球凝集發生。
(4) 非常緩慢地加入CrCl3(以0.85%氯化鉻稀釋成1/400),CrCl3加入的量為上述病毒/紅血球懸浮液總體積的一半。在22℃(±2℃)下放置5分鐘,並不時攪拌之。
(5) 用1,500相對離心力將致敏化的紅血球離心5 分鐘,使其沉澱下來。
(6) 用生理鹽水/HEPES溶液再配成懸浮液,並且再一次用1,500相對離心力離心 5 分鐘。
(7) 再用PBS "A"將紅血球配成8%的懸浮液。

在致敏化的過程中,用高壓鍋將瓊脂熔化。在使用之前,吸取7.8毫升的量到環球瓶(universal bottle)並保持在42℃的溫度。在作用前,檢查看瓊脂是否已冷卻到42℃。

˙ 試驗盤的準備

(1)

將0.9毫升以病毒致敏化的綿羊紅血球加入7.8毫升的瓊脂(42℃)裡,迅速但溫和地混合。

(2) 加入0.3毫升的未稀釋天竺鼠血清。倒入置於水平台面的免疫試驗盤裡,並混合均勻。不加蓋,靜置5分鐘,使其凝固並自然乾燥。
(3) 加上蓋子並置於4℃潮溼的盒子裡備用。
(4) 製備含未致敏化紅血球的對照盤以檢查非特異性的溶血。另外,也可以用不相關的流行感冒病毒(例如,人類H1N1病毒)致敏化綿羊紅血球作為對照盤。每一批製備好的試驗盤可以貯存數週之久。
(5) 用瓊脂打孔之模版在瓊脂上打3毫米的小孔 - 可以做16個測試血清和1個陽性對照血清的測試之用。在抗原對照的試驗盤上,準備五列的8個小孔。
(6) 用吸管吸取10μl,經過熱不活化的測試血清和陽性對照血清並放置到適當的小孔內。在34℃下放在有溼度的盒子內20個小時。
(7)

測量溶血直徑,減去小孔的面積即可計算出溶血區面積。

表1. 抗原滴定的範例說明
紅血球 病毒 CrCl3 最後在PBS內之容積
2毫升 0.6毫升(0.3/1) 1.3毫升 2毫升
2毫升 1.2毫升(0.6/1) 1.6毫升 2毫升
2毫升 1.8毫升(0.9/1) 1.9毫升 2毫升

最適當的抗原量是以可造成最大最明顯的溶血區域為標準。

對照血清:每一試驗盤需有一小孔為亞型 - 特異性抗血清。

˙ 結果的判讀

有效的結果是陽性和陰性對照血清所得的結果必須和以前的測試結果相符合。對照血清的溶血區必須清楚並且變化不能超過原先預估值的10%。結果可以用平方毫米來表示,也可以和對照血清值按比例計算。對照盤裡陽性結果的血清必須用羊紅血球吸附。為了達到正確診斷的目的,急性感染和在恢復期的馬血清必須在同一試驗盤上做二重覆的測試,如果恢復期比急性期馬血清的溶血區域還大的話,即顯示感染了馬流行性感冒。若恢復期血清中的抗體含量在急性期血清的二倍以上,則其溶血區的增加會很明顯。增加的區域可以用連續稀釋的標準抗血清所繪出的標準曲線圖計算出來。

B. 疫苗和診斷用生物製劑之必要條件

馬流行性感冒病毒疫苗可以是不活化亞型 1 和 2 之全病毒,以及或是次單位(subunit)疫苗,不一定含佐劑。

1.

種毒的管理

(a)

種病毒的特性

國際畜疫會和世界衛生組織的參考實驗室(Newmarket)進行的疾病監控計畫可提供作為疫苗之合適病毒株的資料(13)。推薦的疫苗病毒株每年六月發表在國際畜疫會的公報上。 疫苗必須含有亞型 1 和亞型2 病毒的代表病毒株。

亞型 1:屬於亞型 1 的病毒株,例如:A/equine/Prague/1/56 或可以用更新近分離的流行病毒株(5)。

亞型 2 :混合的亞型 2 病毒抗原變異株(3)。所使用的疫苗中包括最近分離流行的病毒株是相當重要的。典型的歐洲病毒株,包括:A/equine/Suffolk/89、A/equine/Borlange/91,及A/equine/Newmarket/2/93等。典型的美國代表病毒株,則為 A/equine/Kentucky/94。偶爾在歐洲可發現似美國株的病毒,反之亦然。在那些大陸相連的許多地區之馬群所用的疫苗必須包含一種以上的亞型 2 病毒。基於偶有分離出類似邁阿密病毒的報告(4),有些疫苗也會包含最初的原型(original prototype)病毒株A/equine/Miami/63,。但如果祗用類似 Miami/63 作為疫苗的話,無法對目前流行的大部份病毒提供足夠的保護作用。

(b)

培養方法

病毒株可以來自國際畜疫會參考實驗室(參考第707 ~ 721頁之表)。被選擇作為疫苗的病毒株必須記錄它的來源和繼代的歷史。病毒株是在10日齡的雞胚胎之尿囊腔內或是細胞培養,例如 Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細胞中增殖。每一個病毒株必須分開操作,病毒生長情形的監控是用血球凝集試驗,每一次繼代的病毒在血清學試驗上必須有相同的結果,血清學的方法例如血球凝集抑制試驗或是單一輻射溶血試驗。假如是以細胞培養的方式增殖病毒中的話,必須以雪貂血清和單株抗體來確認其抗體性,以避免在種毒株和實用種毒株(working seed virus)的繼代過程中混雜入變異株病毒。種毒株和實用種毒株在檢查過外源性抗原之後,將其小量分裝以冷凍乾燥的方式貯存在 -20℃ 或在 -70℃ 之下,並且詳細做好貯存狀況的記錄。

每一批作為疫苗的種毒株必須同時處理,以確保它們能有相同的組成、測定有否外源性物質,並完全定性。作為抗原性時,血球凝集抑制(HI)反應的抗血清或單株抗體(Mabs)可以取自國際畜疫會和世界衛生組織的參考實驗室。

每一批實用種病毒株必須源自種毒株,並且要有相同的組成份、沒有外源性抗原,以及完整的定性。小量分裝實用種病毒株以作為疫苗生產之用。

每一批的種病毒株和實用種病毒株必須來自無特定病原(SPF)的雞胚胎或是至少要來自健康雞群的雞胚胎。

假如是使用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞作為增殖疫苗病毒之用的話,必須先建立種細胞株(master cell lines),並且要貯存在液態氮裡以及根據國家防疫當局指導(National Control Authority Guidelines)來測定沒有外源性抗原的污染。

種毒株之外源性抗原之檢查,包括黴漿菌(mycoplasmas)和其它可能感染馬之病毒。必須以適當的技術來操作,包括以有感受性組織細胞培養並觀察有否細胞病變作用(CPE)或運用螢光抗體來做抗原的檢查等。

一般常見的馬呼吸道病原,如馬泡疹病毒(herpesviruses)1,4,2、馬微小核醣核酸病毒(picornaviruses)、馬病毒性動脈炎(viral arteritis)和馬腺病毒(adenoviruses)等都不能存在於疫苗之中。

必須做標準無菌試驗(standard sterility test)以確定疫苗中無雜菌污染,並以小動物進行毒性試驗(Toxicity test)。

(c)

每個選定的疫苗毒可先製造一批原形(prototype)疫苗,用檢定標準測試其純度、安全性等,以確認該疫苗是否適用。種毒株必須是經增殖可產生高力價,以便產生足夠的抗原量,使標的動物免疫後可產生良好的抗體反應。

另外,用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞來繁殖的種毒株必須在培養過程中沒有抗原變異株(antigenic variants)的產生,因為它已無法代表這原始的種毒株來作為疫苗的製造了。

2.

製造方法

具有作為製造疫苗之種毒株必須先建立種毒株批貯系統(seed-lot system),並且使種病毒株有穩定一致的特性。每一病毒株都分別接種由健康雞群取得的9 ~ 11日齡雞胚胎之尿囊腔裡。這些雞胚胎在合適的溫度下培養2 ~ 3天,然後收集尿囊液。每個病毒株的懸浮液必須分開收集並且加以不活化,如果需要的話,還可加以純化。最後依所需加入合適的佐劑和抗菌保存劑。

單價病毒(monovalent virus)在製備好之後,必須根據國家防疫當局(National Control Authority)的規定方法,立刻加以不活化。假如是使用福馬林(40%甲醛)或是β-乙丙內酯(2-oxetanone)時,其濃度不能超過0.1%。最理想是將病毒保存在4℃之下,並在收集後5天之內加以不活化,病毒不活化必須要完全。檢測是否不活化的方法是接種0.2毫升未經稀釋以及稀釋1/10和1/100之單價病毒到雞胚胎的尿囊腔裡(每組用10個雞胚胎),然後在33 ~ 37℃下培養三天,每一種稀釋濃度的雞胚胎至少有八個必須仍能存活,從活存的雞胚胎的尿囊腔內各抽取出0.5毫升的尿囊液,並將接種同一稀釋濃度的尿囊液放在一起。每一不同稀釋濃度所採的尿囊液在不稀釋下,取0.2毫升接種到10個的雞胚胎,再接種之雞胚胎尿囊液需沒有血殘凝集反應,顯示病毒已完全不活化。有些國家防疫當局要求在培養中至少要有高於80%的雞胚胎能存活,但這可能很不容易達到,故其標準則依其所需而定。病毒在進行不活化之前必須先做細菌及黴菌的無菌測驗。

單價的病毒可用高速離心或其他國家防疫當局要求的方法加以濃縮純化來操作。在適當的環境條件下進行濃縮和純化是相當重要的,因為,例如適當的溫度可以使病毒的病原性保持不變。 當依照國家防疫當局訂定的方法將單價病毒接種在雞胚胎,以檢查時這單價的病毒不含有活的流行性感冒病毒。

3.

製程中的控制

有關製程中的控制必須應用在不活化過程之前後,以及濃縮和純化過程之前後。 製程中的控制包括:(a) 病毒株的鑑別(用血球凝集抑制試驗);(b) 無菌;(c) 病毒的力價;(d) 血球凝集素(haemagglutinin)的含量(用雞紅血球凝集單位 - CCA);和 (e) 免疫上的血球凝集(HA)反應之活性(用單一輻射溶血試驗)。

˙ 單一輻射溶血(SRH)試驗

單一輻射溶血 試驗是檢測血球凝集 反應之活性非常可靠的方法,它是以 μg 血球凝集 來表示。一般它用於人類流行性感冒疫苗之例行的力價測定之用 (20) 。

不活化馬流行性感冒疫苗的力價視免疫上活性凝集素的濃度而定(14,18,19)。

如果祗用雞紅血球凝集單位(CCA)來檢測疫苗抗原的含量,可能會導致錯誤的判斷,因為這試驗祗是反應出病毒株凝集紅血球的能力。病毒分解之後,會使紅血球凝集單位測量出的血球凝集反應之力價有明顯地增加的現象。紅血球凝集單位的方法無法測出血球凝集反應時之抗原特性(當抗原失去激起抗體之能力時,仍可能保留其和紅血球結合的能力)。

有些馬流行性感冒疫苗可能含有一種以上A/馬/2(H3N8)亞型的病毒變異株,在這種情況下,疫苗接種後的動物不可能由血清學試驗的結果而單獨對A/馬/2型病毒的力價做判斷,因為同樣的亞型之間會產生交叉的免疫反應。也就是因為如此,用一種可靠的方法,例如單一輻射溶血試驗在疫苗不活化的前後以及混合和加入佐劑之前後,來檢測它單獨組成的力價是非常重要的。

在單一輻射溶血試驗先用已知血球凝集含量的病毒,做出的參考曲線,再和製備疫苗的病毒做比較。抗原在含有對凝集素有特異性之抗血清的凝膠上做擴散試驗,擴散的距離和製備的抗原內所含的凝集素之量有直接的關係(11)。

進行單一輻射溶血試驗的標準試劑可以由世界衛生組織取得。目前有的反應試劑,包括 A/equine/1、Prague/56(H7N7)、A/equine/2/Miami/63及A/equine/2/Kentucky/81(H3N8)。最近流行的 A/equine/2 病毒的試劑仍在準備中。

 

4.

批次控制

(a)

無菌

防止其它生物物質污染和無菌的測試方法,請看第1.4章。

 

(b)

安全性

(1)

按照生產廠商的推薦劑量,以肌肉注射的方式注射於兩個部位,將疫苗接種至少兩匹馬以上。四週之後,再接種一次。在第二次接種之後,繼續觀察10天。全身或局部都不能產生任何的異常才算合格。

(2) 假如疫苗是準備使用於母馬,則按照推薦的防疫注射計畫,將兩劑量的疫苗最少注射兩匹懷孕的母馬來做測試。
(c)

力價

當病毒抗原和佐劑混合之後,必須取少量的疫苗在生體內用馬和天竺鼠來測定其力價。雖然紅血球凝集單位和單一輻射溶血等的方法被用來作為測定疫苗產品病毒株的抗原定性試驗,但在試管內做疫苗的定量測試時,佐劑則會產生干擾的現象。在國家防疫當局的同意下,每批次的再檢測(repeated batch tests)可以用天竺鼠來進行。

(1)

馬的血清學反應

在活體內進行力價的測定時,必須要用血清學試驗測定為陰性的馬匹來接種,並且必須將這測定抗體對凝集素所產生之反應所用的血清學測定方法,加以標準化。

用該地區最近所分離出的病毒來篩選出可能含有抗體的幼馬。假如是使用血球凝集抑制試驗作篩選的話,那麼A/馬/2病毒必須用Tween 80/乙醚先處理以增加試驗的敏感度。另外,可以用單一輻射溶血試驗來建立對A/馬/1和A/馬/2病毒的陰性反應之整體的瞭解。

測試疫苗的效力時,應按照推薦的部位注入一劑量的疫苗於五匹有感受性之血清學陰性馬(seronegative horses),直到如標籤所示第二次推薦劑量的時間過後,才再用第二次推薦的疫苗劑量注入各馬匹。

從每一隻馬收集三個血液樣本,第一個是在開始注射疫苗時,第二個是在第一次注射疫苗之後一週,第三個樣本則是在第二次注射疫苗之後的二週。

用血球凝集抑制試驗或是單一輻射溶血試驗來測試疫苗免疫血清內所含之A/馬/1和A/馬/2病毒的抗體(參看第A.2.a和b節)。

在第二次疫苗注射之後,所採集的血清之抗體力價和原始採集的血清比較不應低於1/64,先行稀釋的1/8應一併計入。假若第一次疫苗注射之後,所採集的血清之力價發現有記憶反應發生時,這結果將不予記入。用相同數目的馬匹取代有記憶反應的馬匹之後,另外再如上所述做補充試驗。另外,抗體也可以用單一輻射溶血試驗來檢測,這時抗體的力價不得低於 150mm2。

每一個實驗室的血球凝集抑制試驗,甚至於單一輻射溶血試驗在敏感度上都不儘相同。所以在敏感度的比較時,必須用標準血清來做對比,以確保每一個不同的實驗室都能得到可以互相比較的結果。標準血清可以取自國際畜疫會標準實驗室。另外,在測試時,疫苗導致的抗體產生量,至少要和標準疫苗剌激抗體的產生量相等,這標準疫苗已做過測試,證明足以產生相關對抗感染的抗體量。

(2)

馬的病毒攻擊試驗

在某些情況下,曾有報告描述用病毒攻擊的方法來研究疫苗的保護能力,特別是無法確定疫苗是否對某些異化的病毒產生保護能力之時。這攻擊試驗的方法是在第二次的疫苗注射六匹馬/仔馬的兩周後,使其暴露在具有毒力的流行性感冒病毒之下。然後和沒有接受疫苗注射的相同數目之馬匹做比較,比較的方式是看它們的臨床症狀、排毒的情形和血清學的反應等(11,12)。攻擊的時間記錄在報表上,它可以反應出疫苗有效時間之長短。

假如這一批疫苗經過這攻擊試驗得到一個滿意的結果時,同樣種毒株所製備的疫苗可以在國家防疫當局的同意下,免除做例行的疫苗測試。

(3)

天竺鼠的血清學反應

不含有特異性抗體的天竺鼠注入疫苗的推薦劑量。在21天之後,採集血液樣本,分離血清之後,在56℃下30分鐘使之不活化,並用上述馬血清的方法來處理血清。

用製備疫苗的病毒株作為抗原來測試所採得的血清。待測血清用一系列的兩倍稀釋法,並調配成每個稀釋濃度含0.025毫升。個別加入0.025毫升經過乙醚或是Tween 80/乙醚處理的抗原懸浮液,並使其含四個血球凝集單位(HA units)。讓這混合液在22℃(±2℃)之下,作用30分鐘後再加入0.5毫升的0.5%雞紅血球懸浮液。再讓它在22℃(±2℃)下靜置1小時,並注意仍能完全抑制血球凝集的最後血清稀釋濃度。每一個被測血清所含的抗體力價不能低於已測試對馬具有保護效果之疫苗所產生的抗體力價。

 

歐洲葯典(European Pharmacopoeia)也可以用來作為控制馬流行性感冒病毒疫苗的參考。

(d)

免疫有效時間

疫苗產品所附資料宣稱的免疫有效時間必須在按照推薦的防疫計畫之下,要和能維持有效抗體量的時間一致。所宣稱的抗體量必須能通過攻擊試驗(看第B.4.c.2節),或是以現有已出版的比較報告為根據。

(e)

穩定性

疫苗必須貯在5±3℃之下,並且避免光照。疫苗產品所宣稱的有效期限(shelf life)必須和在天竺鼠體內,按照特定時間所做的力價測定相符合(看第B.4.c.3節)。

(f)

保存劑

一般均不含保存劑。

(g)

注意事項(可能的危險)

疫苗在打開後一小時內,必須使用完畢。但接種疫苗時,必須注意儘量做到無污染,並且祗有健康的馬匹才可接受疫苗注射。偶爾可能會發生短暫的局部性和全身性的反應,所以接種後,應該有24 ~ 48小時的休息。

5. 成品的測試

(a)

安全性

如第B.4.b.1節所述,一旦原始種病毒株做好完備的安全性試驗之後,以後批次懷孕母馬的例行安全性試驗,則可以省略。

(b)

力價

看第B.4.c.3節。最低限度每批生產的疫苗必須用天竺鼠做血清學試驗。

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