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日本腦炎
Japanese encephalitis
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日 本 腦 炎

摘要

日本腦炎(Japanese encephalitis)病毒是一種藉由蚊子傳播(mosquito-borne)的黃病毒屬(Flavivirus),它主要是引起馬的腦炎(encephalitis)。此病毒也會感染人類,並造成豬的流產。豬扮演一個可以加強此病毒之毒力的角色,鳥類也會造成本病毒的傳播。

馬日本腦炎的確診需賴從感染或是死亡的動物體內分離出病毒,但由於病毒的分離率通常都很低,所以用臨床、血清學和病理學方面的檢查也是非常有效的診斷方法。

病毒的鑑別:病毒分離時,採取出現日本腦炎臨床症狀的感染馬或死亡馬匹的腦部組織。病毒分離的過程中還包括未離乳小白鼠和細胞培養的接種。用生理鹽水緩衝液配成的含有牛血清(或牛血清白蛋白)和抗生素的腦組織懸浮液以腦內接種的方式接種於2 ~ 4日齡的小白鼠。假如小白鼠在14天之內顯示出神經症狀而導致死亡時,可以再用細胞培養的方式來確認病毒。分離病毒之細胞培養雞胚胎、豬或倉鼠腎細胞、非洲綠猴腎(VERO)細胞、MD-BK細胞株和蚊子中進行。

有些培養細胞會出現細胞病變作用(CPE)但是通常都不很明顯。需用血清學的方法來確認在小白鼠或是組織培養裡的病毒。

血清學試驗:抗體測定是瞭解目前馬群中感染的情況,也可以針對個體用來作為是否感染日本腦炎的診斷。血清學的試驗方法包括病毒中和試驗(VN)、血球凝集抑制(HI)試驗和補體結合(CF)試驗。由於病毒中和試驗可以區分日本腦炎病毒或是其它黃病毒屬(Flavivirus)的感染,最具有特異性。病毒中和試驗最好是用病毒斑減少試驗(plaque reduction test)來操作。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:有來自感染的小白鼠腦組織或感染細胞之懸浮液所製成的疫苗可供應用。

A.診斷技術

日本腦炎(Japanese encephalitis)病毒是一種馬的疾病,它是由蚊子傳播(mosquito-borne)的黃病毒屬(Flavivirus)所引起感染動物的腦炎臨床症狀,最後可能導致死亡(3,4)。此病毒也會感染人類,並造成豬的流產。豬扮演一個可以加強此病毒之毒力的角色,鳥類也會造成本病毒的傳播。

馬日本腦炎的確診需賴從動物體內分離出病毒,但在某些環境狀況下病毒的穩定性很差,或因為感染動物體內所產生抗體的緣故,病毒的分離率通常都很低。所以用臨床、血清學和病理學方面的檢查也是非常有效的診斷方法。另外也可以用酵素免疫試驗(enzyme immunoassay )方法來檢測在腦脊髓液的特異性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G (IgG)抗體(1)。腦部組織的層狀體(corpus striatum)、皮質(cortex)或丘腦(thalamus)可供病毒分離之用。血液和脊髓樣本也可以作為分離病毒之用。所有的樣本在採集後必需立刻置於低溫下,如果需要一段時間才做病毒的分離時則應冷凍保存在 -80℃。這些檢體必需放置在生物安全的環境下以避免感染到人類。

1.

病毒的鑑別

將腦和脊髓檢體以含牛血清(2%)或牛血清白蛋白(0.75%)、鏈黴素(100μg/毫升)和青黴素(100單位/毫升)pH7.4的生理鹽水緩衝溶液做成10%乳劑(牛血清裡不能含有日本腦炎的抗體)。將用1,500xg離心15分鐘,然後取上清液供接種之用:以0.02毫升腦內接種2 ~ 4日齡的小白鼠。接種後繼續臨床觀察14天。可能沒有明顯的臨床症狀發生,但腹部乳白色斑塊可能會因食慾不振而消失。皮膚的顏色會由粉紅色變成黑紅色,在死前會有全身性痙攣的現象。採集死亡或瀕臨死亡之小白鼠的腦組織,並貯存於 -80℃ 以備繼代之用。

第二代感染小白鼠之腦組織用蔗醣/丙酮萃取其抗原,並以此抗原作為鑑別病毒之用。根據所述的方法(2)將一日齡雞或鵝的紅血球從pH6.0到pH7.0在pH0.2的間隔之下做出不同pH的濃度來測試抗原凝集紅血球的能力。概略而言,以不同pH值之稀釋液做1/24之紅血球懸浮液。在 U- 型底的 96- 孔試驗盤裡將萃取的抗原做系列稀釋使其含有相同25μl的懸浮液,然後加入 25μ l的紅血球稀釋液。將試驗盤培養在 37℃ 之下一小時後判讀它的血球凝集反應。假如此一抗原對紅血球有凝集作用的話,協同日本腦炎抗血清,供 HI 試驗之用。

可用雞胚胎、倉鼠腎細胞或蚊細胞株C6/36(來自白斑蚊[Aedes albopictus]的細胞株)的初代培養(primary culture)細胞可供病毒分離之用。將懷疑被感染動物所採集的腦和血液以及接種後從小白鼠腦部所做成的懸浮液接種到細胞培養中。對黃病毒屬(Flavivirus)和日本腦炎病毒有特異性的單源抗體(monoclonal antibodies)可以在間接螢光抗體(FA)試驗時用來作為病毒之鑑別(5)。

2.

血清學試驗

血清學試驗可供動物族群內感染的流行情形、病毒的地理分佈和接種馬匹抗體的產生情形等之瞭解。本試驗如果應用於個體之檢查時,需瞭解這匹馬在這疾病流行地區可能已曾經不顯性感染了本病毒或是曾經做過本病毒的防疫注射。必須取自急性期和恢復期的成對血清做比較,且有明顯的抗體增加之情形才可作為有效的參考資料。另外也必須考慮所用之血清學試驗的特異性。

有些地區如果要確實地診斷出日本腦炎必須針對相關的病毒做不同的試驗。以澳洲和巴布亞新幾內亞島為例,Murray Valley腦炎病毒的抗原性就和日本腦炎病毒的抗原性非常類似。

(a)

病毒中和試驗

用雞胚胎的初代培養細胞、非洲綠猴腎(VERO)細胞或仔倉鼠腎(BHK)細胞實施病毒斑減少試驗(peaque reduction test)是一個非常敏感而且可靠的方法。

用日本腦炎病毒(Nakayama病毒株或是JaGAr-01病毒株)腦內接種1日齡的小白鼠。收集瀕臨死亡或已死亡的小白鼠腦內容物,並用pH7.2含10%小牛血清之磷酸緩衝溶液(PBS)製配10%懸浮液。以 5,000 x g 在 4℃ 下離心 20 分鐘。將上清液分裝後貯存於 -80℃。

˙ 試驗步驟

(1)

在水浴槽中以56℃,30分鐘將血清非動化之。

(2)

用24-孔(直徑17毫米)的平底微滴定盤(或是試管)中的細胞培養基裡將血清做從1/10到1/160的系列稀釋。

(3)

以細胞培養液將病毒原液稀釋成 100 病毒斑形成單位 (PFU)/0.2。

(4) 在稀釋血清中和等量的稀釋病毒使二者混合之。每一盤裡必須包括病毒對照、陰性血清對照和陽性血清對照。
(5) 在37℃下作用90分鐘。
(6) 在 24- 孔的細胞培養盤內的 BHK-21 的單層細胞(monolayer)內加入200μl 的病毒/血清混合液。
(7) 在含CO2以及37℃的情況下吸著90分鐘。
(8) 移除接種液並加入1毫升的覆蓋培養基(1.5%的羧甲基纖維素,1%含小牛血清的Eagle's培養基)。
(9) 在含CO2以及37℃的情況下培養四天。
(10) 在去除培養液之後加入含2.5%重鉻酸鉀(potassium dichromate)、5%冰酸酸(glacial acetic acid)和5%福馬林的溶液,並在室溫下使其固定30分鐘(操作固定液時,必須帶手套)。
(11) 在室溫下用0.1%的結晶紫(crystal violet)溶液染色30分鐘。
(12) 去除染色液,並以自來水清洗細胞。
(13) 讓細胞自然風乾,然後計算病毒斑(plaques)。
(14) 計算和無血清的對照組比較能減少斑點數目至50%以上的血清稀釋濃度。
(b)

血球凝集抑制試驗

血球凝集抑制(HI)試驗被廣泛用來作為日本腦炎的診斷,但它會受其它的黃病毒屬(Flavivirus)之交叉反應(cross-reactivity)的影響。在這試驗中,血清必需先經過丙酮(acetone)或白陶土(kaolin)之處理,再用同型的(homotypic)紅血球除去非特異性的凝集素(haemagglutinins)。紅血球是採取自鵝或一日齡小雞,並使之調整在最適合的pH值(6.6 ~ 7.0)。試驗必需以處理過的血清和8單位的標準抗原來進行,有些國家已有商品化產品可資應用。

(c)

補體結合試驗

補體結合試驗(CF)有時也被應用在血清學的診斷上。試驗抗原是由接種之小白鼠的腦組織並經過丙酮/乙醚的萃取而來。

˙ 抗原的製備

(1)

採取接種後死亡的小白鼠腦部組織,並稱重量。

(2) 加入20倍體積保存在 -20℃ 的冷丙酮,並使之均質化。
(3) 將懸浮液用5,000 x g 在4℃下離心5分鐘,去除上清液。
(4) 如上述步驟(2)相同,加入和沉澱塊同體積的冷丙酮,然後使之混合均勻。
(5) 在 -20℃下用丙酮萃取20分鐘,並和上述步驟(3)一樣再離心一次。
(6) 重覆步驟(4)和(5)。
(7) 重覆步驟(4)和(5),但這一次用冷丙酮/乙醚(相同體積之混合物)。
(8) 用冷乙醚重覆操作步驟(4)和(5)兩次。
(9) 用吸管去除上清液,再將它置於離心管內。
(10) 真空乾燥1 ~ 2小時。
(11) 將塊狀物重新用冷的生理鹽水使之溶解(2毫升/每公克腦組織),並在4℃下放置隔夜。
(12) 在5,000 x g 下離心一小時。取其上清液作為抗原。

˙ 試驗步驟

(1) 測試血清在1/4稀釋的明膠-佛羅那緩衝液(gelatin-veronal buffer)裡加熱非動化之。
(2) 在96-孔的微試驗盤(25μl)裡將血清做二倍的系列稀釋。
(3) 加入25μl的4單位抗原,並用震動的方法使之混合。
(4) 加入50μl的2單位補體(新鮮的天竺鼠血清庫)。
(5) 用震動的方式混合,在4℃下作同18小時。
(6) 取出微試驗盤,在室溫下靜置15分鐘。
(7) 每一孔加入25μl激化過的羊紅血球。
(8) 每一孔加入25μl激化過的羊紅血球。
(9) 沒有產生溶血之被測血清的最高稀釋倍數即為其補體結合試驗之力價。力價在四倍稀釋以上則被判定為陽性。

B. 需要的疫苗和診斷用生物製劑

馬所使用的日本腦炎疫苗是由感染的小白鼠之腦組織或細胞培養病毒經過不活化後所製造。

1.

種毒的管理

(a)

種毒的特性

在日本製造日本腦炎疫苗的種毒為Nakayama病毒株。這個病毒株在腦內接種時必須會使小白鼠致死,並且必須能在初培養的豬腎細胞(porcine kidney)內增殖。這病毒株能使鵝、一日齡小雞或小鴿之紅血球產生凝集。這病毒株必須能夠被日本腦炎病毒的標準抗血清所中和(neutralised)。

(b)

培養方法

原毒和種毒株必須能夠在小白鼠的腦內或細胞培養內增殖。原毒不能繼代超過三次以上,而種毒株繼代不能超過二次以上。

(c)

合格的疫苗

由這種毒株所生產的疫苗可以預防馬之日本腦炎和防止懷孕母馬造成死產(stillbirths)。

原毒和種病毒最好保存在 -70℃ 之下,或是在冷凍乾燥後保存在5℃之下。

2.

製造方法

病毒係於3 ~ 4週齡小白鼠之腦內或單層細胞培養增殖者。未接種的對照培養基之細胞不可因為其它任何的病毒而出現任何細胞病變作用(CPE)。種毒株由腦內接種於小白鼠,並收集有顯示嚴重日本腦炎臨床症狀的小白鼠。用PBS將收集的腦組織均質化,並在1,500 x g 下離心30分鐘,取其上清液製備病毒的懸浮液。

接種於細胞培養內的種毒株在生長最高量時分批收集其培養液。將培養液過濾或用1,500 x g 離心30分鐘,取其上清液製備病毒的懸浮液。

加入福馬林(0.5%)於病毒的懸浮液內使病毒不活化,這懸浮液則視為未經任何稀釋的病毒懸浮液。可以加入佐劑(adjuvant)來增加其免疫抗體產生能力。

3.

製程中的控制

用培養的技術來檢查病毒懸浮液是否有受到細菌的污染,以及用小白鼠腦內接種的方式或是用細胞培養的方式檢查病毒的感染能力。未稀釋的病毒懸浮液必須用培養和染色後,用顯微鏡再一次檢查是否受到污染,並且用小白鼠腦內接種的方式檢查病毒是否已經完全被福馬林不活化。

4.

分批控制

(a)

滅菌

可以參考第1.4章的滅菌測試和防止微生物污染的方法。

 

(b)

安全性

用0.02毫升的疫苗成品腦內接種10隻3日齡的小白鼠,並觀察14天以確保(沒有造成任何小白鼠的死亡)病毒已經完全不活化。

(c)

力價

疫苗成品必需通過小白鼠的保護試驗(mouse protection tests)來檢查其免疫原性(immunogenicity)。以10份的PBS稀釋1份的疫苗,共30隻2 ~ 3週齡的小白鼠腹腔內注射0.1毫升稀釋疫苗二次間隔3 天,未接種的對照組同樣有30隻小白鼠。在第一次接種8天之後用定量活毒腹腔接種,然後觀察14天。免疫注射組必須至少有40%以上的存活率,而對照組的死亡率必須超過90%以上。攻擊用的病毒含量每0.2毫升不能超過103 LD50(50%致死劑量)。

(d)

穩定性

疫苗成品貯存於4℃下其效力必須能維持12個月以上。

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