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豬萎縮性鼻炎
Atrophic rhinitis of pigs
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豬萎縮性鼻炎

摘要

萎縮性鼻炎是豬的傳染性疾病。它的特徵是化膿性鼻分泌物並伴隨著鼻部的變短和扭曲,鼻甲骨的萎縮和生產力減低等。

本疾病在嚴重的進行期經常會有明顯的生產力下降的情形,它主要是單獨感染敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)的產毒菌株或是和支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)混合感染以及和一些鼻腔內的病原菌叢的混合感染。單獨感染支氣管敗血性博德氏桿菌祗造成較不嚴重、輕微、中等程度的非進行性鼻甲骨萎縮,一般沒有明顯的鼻腔病變產生。

事實上正常的豬群都會感染支氣管敗血性博德氏桿菌和非產毒性的敗血性巴氏桿菌,它可由屍體解剖時多少都會發現某種程度的鼻甲骨萎縮得到證明。但感染到產毒性的敗血性巴氏桿菌時經常都會導致臨床上明顯的鼻甲骨嚴重萎縮。這疾病可能會以地方流行性病的方式爆發或是呈散發性的零星發生,這端視豬群的免疫狀況而定。鼻甲骨的萎縮可能祗能在屠宰後才發現或是在活著動物例如用X-光照相才被檢查出來。

病原菌的鑑別:豬萎縮性鼻炎的診斷需要靠臨床和死後的屍體解剖檢查並同時配合感染豬的敗血性巴氏桿菌和支氣管敗血性博德氏桿菌等病原菌的分離和其特性的鑑別。因為鼻腔內其它的感染細菌多且複雜,因此分離巴氏德桿菌的工作變得頗為繁瑣。這個困難可以在保存鼻拭物於4 ~ 8℃以及用選擇性培養基,通常是用含抗生素的血液瓊脂培養基的方法來克服。巴氏桿菌可以用生物化學試驗來鑑別。分離出來的病原菌之產毒性可以用它對培養細胞的細胞毒性試驗來判別。商用的酵素結合免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay﹐ELISA)現在已經廣泛被用來做為鑑別所分離出的病原菌是產毒性或非產毒性,它並且不需事先對個別菌落做分離和鑑別即可用初培養玻璃盤(primary culture plates)內培養出的細菌做產毒性的檢測。這個試驗已漸被做為控制進行性疾病的基石。

分離物的抗原特性可分為莢膜抗原(capsular)和體細胞(somatic)抗原。莢膜抗原型A和D經常在豬體內被分離出來,而產毒性的菌株則屬於D型或A型。莢膜抗原可以用間接血球凝集試驗(Indirect Heamagglutination Test, IHA)或免疫螢光試驗(immunofluorescence test)等血清學方法來鑑別。化學鑑別方法則為丫啶黃(acriflavine)的絮凝作用(flocculation)或對粘朊酵素(hyaluronidase)的感受性。體細胞抗原則以沉降反應或凝集反應試驗來鑑別。

博德氏桿菌用選擇性培養基來分離,它可以形成特徵性的菌落並且可用玻片凝集試驗(slide agglutination test)來鑑別它的抗原性。

血清學試驗:檢測動物體內的巴氏桿菌和博德氏桿菌抗體對診斷疾病和瞭解是否為帶原狀況上並沒有幫助,因為巴氏桿菌非產毒菌株和產毒菌株會有交叉抗原反應,而且博德氏桿菌幾乎很容易就可以由豬體內分離出來。一種建立於檢測對巴氏桿菌毒性的抗體之血清學試驗已經可以做為商業上的用途,但是因為有些感染豬並不會產生對毒性的抗體或是很遲才產生抗體以及因為注射巴氏桿菌類毒素疫苗使得抗體普遍存在動物體內等理由而使得這試驗的效果受到了相當的限制。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:在商業用途上已有許多疫苗可以使用,它們含有支氣管敗血性博德氏桿菌和敗血性巴氏桿菌產毒性和/或非產毒性的混合菌株或是由敗血性巴氏桿菌或由重組的大腸桿菌(recombinant Escherichia coli)純化而得到的類毒素。

A.診斷技術

萎縮性鼻炎是豬的傳染性疾病。它的特徵是鼻部的變短和扭曲,鼻甲骨的萎縮和生產力減低等。這疾病可分成兩種型式:

 
(a)

單獨感染敗血性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)的產毒菌株或是和支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)混合感染以及和一些鼻腔內的病原菌叢的混合感染而造成的嚴重進行性疾病。

(b)

單獨感染支氣管敗血性博德氏桿菌以及和一些鼻腔內的病原菌叢的混合感染,它祗造成輕微、中等程度的非進行性鼻甲骨萎縮,一般沒有明顯的鼻腔病變產生(10,26)。在英國屠宰後的豬發現有鼻腔病變,這和進行的疾病疫情吻合,但是屢次嚐試想分離出產毒性的巴氏桿菌病原菌(17)或是用酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)來檢測出病原菌的存在都告失敗。經常暴露在博德氏桿菌之下可能會造成鼻甲骨的嚴重損害(20),但祗有空氣中的氨(ammonia)也會造成中度的鼻甲骨損害。

高密度的飼養環境、飼養環境過於狹小和不良的管理、房舍和環境都會增加感染的嚴重程度。空氣中的氨增加的情形經常發生在離乳和肥育的豬舍,也可以經由實驗的方式造成輕度的鼻甲骨損害。嚴重的進行性萎縮性鼻炎經常會造成生產力的降低,因此很可能已感染了產毒性的巴氏桿菌。但這些病原菌的感染和造成動物體重減輕之間的關係還無法用很明確的方法衡量出來。正當此疾病廣泛流行的時候,我們可以觀察出管理和環境因素對造成此疾病的嚴重程度來說比病原菌本身還重要。產毒性的敗血性巴氏桿菌multocida、septica、avium和canis以及一些進緣相關的細菌也曾經分離自養豬者(13)、兔子(25)、山羊(2)和牛(19),它們對本病造成的危害所扮演之角色至今仍不明白。

事實上支氣管敗血性博德氏桿菌和非產毒性敗血性巴氏桿菌已是經常性地存在豬的體內,所以可以想像看似正常的豬群也會存在某種程度鼻甲骨萎縮的情形。但是,如果感染產毒性的敗血性巴氏桿菌則在豬群中可以看出它有明顯的臨床症狀或是曾經發生過嚴重的萎縮性鼻炎。它可能會成為整個豬群嚴重的問題或是祗有散發性地在少數屠宰後豬隻才被發現,這些感染豬群在防疫上非常重要,因為它會傳染給未曾感染過產毒性敗血性巴氏桿菌的豬群而造成此病再度嚴重爆發在這新的豬群裡。

診斷豬萎縮性鼻炎得靠臨床、病理和微生物學的調查。微生物學上的調查尤為重要,因為這些豬群可能是產毒敗血性巴氏桿菌的帶原者,它很可能會將這病原菌散發給其它豬群。不論豬群是否有臨床症狀產生祗要是產毒敗血性巴氏桿菌被分離出來時則被視為是進行性萎縮性鼻炎豬群,這已經為大家所公認的判定方法(23)。因此許多國家的疫情控制都把重點放在檢測出被感染的帶原豬群,即使沒有發生任何症狀亦會被視為危險的帶原豬群。

臨床症狀包括打噴嚏、鼻分泌物、鼻部的變短和扭曲並伴隨有鼻甲骨的萎縮、減低飼料效率,在嚴重的病例時甚至攝食困難。鼻甲骨的萎縮可能祗有在屠宰後在鼻部第二臼齒橫切面檢查時才能發現,但有人也曾經在活豬身上做X-光或用內視鏡檢查(11,30)。有許多根據這鼻甲骨的病變來計算感染程度的方法,這些方法對疾病發展狀況的監控也發揮了很大的作用。

診斷是藉著萎縮鼻甲骨的組織病理學檢查以及敗血性巴氏桿菌和支氣管敗血性博德氏桿菌的分離和特徵性。組織病理變化包括腹部鼻甲的骨片被纖維質所取代,有時有不同程度的發炎現象以及代償性的變化(12)。藉著培養出產毒性的巴氏桿菌或檢測出它的毒性都能確診為進行性的萎縮性鼻炎(7,16)可以診斷為無臨床症狀的感染豬。

1.

病原菌的鑑別

八~十週患有萎縮性鼻炎臨床症狀或呈帶菌狀態的豬採取它的鼻或扁桃體拭物做為檢查樣本。如果這些樣本不能馬上做處理的話,必須放在炭輸送用培養基(1)或等張生理鹽水溶液裡。

培養是使用選擇性培養基。Bordet-Gengou瓊脂培養基能使支氣管敗血性博德氏桿菌產生獨立的菌落,它含有芙喃制菌劑(furaltadone)、青黴素和鏈黴素(29)。MacConkey瓊脂如果加入葡萄醣(14)可用來培養支氣管敗血性博德氏桿菌。5%馬血瓊脂加入新黴素、枯草桿菌素和放射菌峒可用來作為培養敗血性巴氏桿菌之用(28,30)。分離敗血性巴氏桿菌的技術已有了很大的進步,它們在輸送時可以將拭物保存在8℃以下直到培養在實驗室的選擇培養基裡(5),這之間可保存達24小時之久。

分離敗血性巴氏桿菌可藉觀察它們菌落的生長形態來加以鑑別。格蘭氏染色可看出它呈格蘭氏陰性雙極多形的桿狀,它們不能在MacConkey瓊脂培養基生長,但氧化酵素反應陽性並會產生引朵(indole)。分離物會產生型D莢膜,它在1/1,000的液態丫啶黃裡可形成很厚的凝絮狀現象。當敗血性巴氏桿菌和型A莢膜一起培養時會抑制粘朊酵素的產生,莢膜會被粘朊酵素所消化(27)。支氣管敗血性博德氏桿菌的鑑定可根據它在Bordet-Gengou培養基裡的菌落形態學上的特性以及用高度免疫兔血清(25)在玻片上做凝集試驗來加以判別。

牛胚肺(embryonic bovine lung, EBL)細胞(27)或非洲綠猴腎(African green monkey kidney, VERO)細胞(24)肉羹培養液的上清液層之毒性試驗可以鑑別出產毒或不產毒的敗血性巴氏桿菌菌株。細菌放置在腦心浸出液肉汁培養基裡在37℃下培養24小時。它們經過離心之後採取上清液層用濾過法做無菌處理,並在牛胚肺單層培養基(monolayer cultures)裡用微滴定盤(microtitre trays)滴定。它們在培養2 ~ 3天之後細胞用結晶紫(crystal violet)染色再做顯微鏡檢查細胞的病理變化。由於細胞培養的設備不容易取得,所以這試驗無法廣泛被使用。

一種快速細胞培養試驗可以將類似敗血性巴氏桿菌的菌落在初分離及繼代培養在瓊脂層(agar overlay)的牛胚肺細胞裡選取出來。在18小時培養之後產毒性的菌株可以產生足夠的毒性擴散出瓊脂並使細胞互相分離開來(7)。這個試驗方法的好處是除非它們具有產毒性否則不需先做菌株的鑑別,並且在樣本裡的許多不同菌株祗要經過菌落形態學上的鑑別即可加以篩選出來。

一種來自單株抗體的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)可以測出由初分離培養基裡取得的細菌之毒性(16)。這試驗方法的產品約在四年前就已經商業化了,它被廣泛用來作為帶原者的鑑別和防止疾病的傳播。這試驗方法已經標準化、具有很高的可重覆性、比細胞培養的方法更具敏感性並且不需要特殊的設備即可進行。這針對可能並非產毒性菌株的菌落裡檢測出其中特定的一個產毒性菌株之試驗方法在敏感度上已經有很大的進步。要用這快速細胞培養方法從樣本裡得到陽性的結果必須測試初次分離培養的每一個菌落,這種廣泛性的檢查在執行上並不實際。這試驗無法克服假陽性結果的問題,但如果以前沒有發生此疾病的歷史或有可疑的症狀發生時在陽性結果的狀況下則必須對產毒性的分離菌株做通盤的調查,並且重覆做酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)直到證實豬群確實已感染產毒性敗血性巴氏桿菌為止。

基因的探測法是根據敗血性巴氏桿菌毒物的基因片段(fragments)來做檢查(18)。這診斷方法是檢測去氧核醣核酸的片段(21),它在無法做細菌培養的情況下針對採集的樣本做產毒敗血性巴氏桿菌的檢測提供了很大的幫助。

2.

血清學試驗

直到目前為止仍然沒有一種血清學試驗方法可以很可靠及滿意地檢測出具有發展或散佈這疾病的產毒敗血性巴氏桿菌。檢測巴氏桿菌的抗體並沒有意義,因為非產毒性的菌株會和產毒菌株產生許多免疫交叉反應抗原(cross-reacting antigens)。一種檢測巴氏桿菌抗體毒性的血清學試驗(15)已被使用。但是許多感染產毒敗血性巴氏桿菌的動物並不會產生對毒素的抗體,並且廣泛地使用含類毒素(toxoid-containing)的疫苗等原因已使得它的價值祗局限在那些沒有做過預防注射的豬群之診斷上或祗是做為檢測疫苗注射後所得到的免疫效果檢查上之用途。

在血清學上可以用凝集試驗來檢測支氣管敗血性博德氏桿菌的感染(26),但因為幾乎所有豬群都受到感染,因此經常都能檢測出對抗這病原菌抗體的存在。

B. 需要的疫苗和診斷用生物製劑

有許多商業用疫苗可供使用,它們含有支氣管敗血性博德氏桿菌菌苗和敗血性巴氏桿菌產毒及不產毒菌株或敗血性巴氏桿菌類毒素等。巴氏桿菌類毒素的疫苗約在四年前已經上市,它們在實驗室裡(6,15)已經證實對此特異性毒素可以產生保護的作用,它會產生和這疾病相同的所有主要症狀。用類毒素刺激抗體的產生會降低產毒敗血性巴氏桿菌的感染因而達到預防此疾病發生的目的(6,22)。這可由自然感染的疫情中得到了證實,特別是在進行性疾病產生的臨床和組織病理學上的症狀上來看更為明顯。潛伏性敗血性巴氏桿菌的流行率也會大幅度地減少,但是在曾經感染萎縮性鼻炎的豬群中儘管用此疫苗之後已經將疫情控制住,卻仍然可以從廣泛的拭物採樣中檢測出此病原菌。

到目前為止仍沒有準確而且標準化的有效商用疫苗生產方法可供應用,但已知每劑量應含以福馬林殺死之支氣管敗血性博德氏桿菌的1010細胞和10μg的敗血性巴氏桿菌類毒素。同時,儘管純化的類毒素所產生的免疫力並不會因混合支氣管敗血性博德氏桿菌菌苗而受到影響,但是純化的類毒素(以甲醛使之不活化)會比未純化的類毒素更具有免疫產生效果(3,6)。最近發展出的一種疫苗(4)祗含有由大腸桿菌重組體(recombinant Escherichia coli)而產生的純化類毒素, 我們預期它對祗有產毒敗血性巴氏桿菌為主要的病原菌所引起之萎縮性鼻炎會有很好的效果。這重組體內之毒性是經過刪除一部份和產生免疫保護無關的基因加以不活化。一般商業用途之疫苗都含有油性佐劑(oil adjuvant)或氫氧化鋁膠(aluminium hydroxide gel)。

作為疫苗生產用途的支氣管敗血性博德氏桿菌必須為有毒之一相菌(phase 1)培養菌,而且敗血性巴氏桿菌必須是具有產毒性。所建立的博德氏桿菌之種菌和產毒性之巴氏桿菌的繼代和貯存必須用傳統的方法。生產疫苗的培養必須有明確的繼代次數,而且博德氏桿菌必須用甲醛使之不活化。因為巴氏桿菌的毒性會進入細胞(intracellular location)並且在穩定期(stationary phase)時因細胞溶解而被釋放出來,這培養基的上清液必須在約培養48小時指數成長期(exponential phase of growth)結束之後收集起來。力價的測試在整個過程中必須有詳細的記錄以便使它在甲醛的處理之後仍有和純化毒素一樣的免疫產生能力(未純化毒素的免疫產生能力比純化的毒素還低)。

死菌和類毒素疫苗的一般操作標準方法可以從歐盟委員會(Commission of the European Communities)取得所需要的資料(8,9)。

1.

種毒的管理

(a)

種毒的特性

必須以批-種菌系統(seed-lot system)的方法使用在菌株來製備全細胞菌苗,以及用來製備純化抗原的菌株。

全菌菌苗所使用的巴氏桿菌和博德氏桿菌菌株的來源和處理過程必須加以詳細描述,並且這原種菌所有的特性必須記錄在原種菌批次計畫書(master seed batch protocol)之內。

作為製備疫苗的工作種菌(working seeds)必須源自於種菌並核對其所有相關的特性是否和原種菌批次計劃書內之描述相符合。

(b)

培養方法

所有細菌菌株必須培養在適合生長的培養基裡,並且要能顯示出其相關的抗原效果。

(c)

合格的疫苗

(1)

純化:

不管是原種菌和工作種菌都必須做純培養(pure cultures),並且沒有細菌、黴菌、黴漿菌和病毒的污染。

(2)

安全性

雖然有效地使細菌培養不活化已經有標準化的方法,但這兩種細菌品種仍然會產生皮膚壞死的毒性(dermonecrotic toxins)。如果使用類毒素做為疫苗的成份時必需確定已經去除掉這些毒素(detoxification)。同時必須執行這不活化疫苗的標準化安全試驗(8)。

(3)

效果

這試驗用疫苗必須以懷孕母豬群來測試其效果。它們的子代必須可以經得起博德氏桿菌和產毒性巴氏桿菌毒力的攻擊。其保護必須能夠達到防止進行性萎縮性鼻炎的臨床症狀發生之程度,也就是鼻甲骨的萎縮得到了改善。疫苗注射對實驗感染所產生的臨床症狀之改善情形可參考Done的計算方法(11)。

2.

製造方法

所有用在培養博德氏桿菌和巴氏桿菌的培養基都必須能夠提供充份的生長條件並且能夠用為菌種的繼代以及能足夠展現抗原性以產生相關的保護抗體。支氣管敗血性博德氏桿菌必須為一相菌(phase 1)之培養菌,而敗血性巴氏桿菌的培養必需確定它產生足夠程度的毒素。

不管是博德氏桿菌菌體以及巴氏桿菌菌體或是毒素都經過不活化、去毒以及輔以佐劑(adjuvant)的過程。一般使用的佐劑是鋁鹽(aluminum salts)或是油性乳膠( oil emulsions)。

3.

製程控制

在製造過程中必須執行下列的控制:(a) 種菌培養基的純化和鑑定,(b) 製造培養之純化和鑑定,(c) 更進一步處理前培養菌的不活化處理,和(d) 抗原的定量:含全菌的菌苗用細胞計數或是指定抗原的抗原性測定,例如敗血性巴氏桿菌毒素用定量酵素-免疫反應試驗(quantitative enzyme-immunoassay)來測定。

4.

批次控制

(a)

無菌

必須根據歐洲葯典(European Pharmacopoeia)和美國聯邦管制條例(US Code of Federal Regulations)所提供的標準方法來檢測每批疫苗是否含有雜菌。

 

(b)

安全性

每一批生產出來的疫苗必須在豬的身上進行測試,用兩倍劑量在推薦部位接種疫苗,然後在兩週之後再用一劑量疫苗接種第二次。接種後不能有局部或全身性的不良反應發生。

(c)

力價

每一批的疫苗都必須做疫苗力價的測定。它可以如第B.1.c.3節所述用血清學的試驗方法來測定它能達到保護的效果。測試力價的試驗並不需要在豬的身上進行 - 可以用小白鼠或是兔子。這實驗動物的體內必須能夠產生足夠而且相關的抗體。

(d)

免疫有效時間

一般疫苗都是在懷孕末期使用,如此可使仔豬在吸吮初乳時得到足夠的抗體。在這種情況之下,母豬有效的免疫時間並無關聯。

當疫苗用在其它的情況時,免疫的有效時間應該最少能維持六個月以上,如此一年可以做兩次加強免疫注射以便能在母豬體內維持足夠的抗體量。

(e)

穩定性

每一批的疫苗必須做加速擱置壽命的試驗( accelerated shelf-life test),它可以反應出實際的疫苗擱置壽命(real-time shelf-life)。

(f)

防腐劑

當使用保存劑時必須測量每一批疫苗內所含的濃度,它的濃度不得超過最大容許濃度。

5. 成品的測試

(a)

安全性

每一批的疫苗必須按照第B.4.b節所述測試它的安全性。

(b)

力價

每一批的疫苗必須按照第B.4.c節所述測試它的力價。

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