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豬傳染性胃腸炎
Transmissible gastroenteritis
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豬傳染性胃腸炎

摘要

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)之TGE病毒所引起的豬胃腸道之疾病。自從1984年起即由它的呼吸道不同的變異株(豬呼吸道冠狀病毒或稱為PRCV)開始傳播世界每一個地區。這個變異株可能是由TGE病毒基因缺損 (deletion)而產生的變異株。PRCV並不是主要致病的病原,但它的診斷非常困難,特別是用血清學的方法。

實驗室裡的診斷方法是根據分離出病毒、病毒性抗原或疑似罹患本病之樣本裡的核酸或是藉對病毒有特異性的體液抗體(virus-specific humoral antibodies)而得以證實。

病原的鑑別:病毒可以經由組織培養的分離病毒、電子顯微鏡、各種免疫學診斷試驗和最近更具特異性的病毒DNA之檢測來加以確認。最常被使用的快速診斷方法是免疫學的診斷,特別是用於檢查糞便的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)以及腸道的冷凍切片(cryostat sections)的螢光抗體試驗(FAT)。逆向被動血球凝集(reversed passive haemagglutination)試驗也曾被使用過。另外一種腸道疾病稱為豬地方流行性下痢(porcine epidemic diarrhea)是由血清學上不同的冠狀病毒所引起,它們在電子顯微鏡底下看起來和TGE病毒相類似。所以,診斷上用免疫電子顯微鏡可以解決這個問題。

血清學試驗:最廣泛被使用的方法是病毒中和(VN)試驗和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。祗有用酵素結合免疫吸附試驗才能分辨TGE病毒和PRCV病毒之間的不同,因為這兩種病毒如果使用病毒中和試驗時會有交叉中和(cross-neutralisation)的現象。被動血球凝集試驗和血球凝集抑制試驗也被發展用來做TGE病毒的診斷。

需要的疫苗和診斷用生物製劑:全球目前還沒有商業化的生物製劑可供使用。但許多國家已在進行研發疫苗的工作,美國已有許可的單價和複合疫苗上市。

A.診斷技術

豬傳染性胃腸炎(TGE)病毒是在小腸的腸道細胞內繁殖並造成它的破壞,而造成腸道絨毛的萎縮和導致腸炎。初生的仔豬死亡率最高。除了腸道之外,病毒還可以在呼吸道和乳房組織中繁殖,但病毒最容易由腸道或糞便中分離出來。比較之下,豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)最常由上呼吸道、肺部的扁桃腺分離出來,如果病毒在腸道繁殖時,或許也可從腸道分離出病毒。豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)可能是由TGE病毒缺損某些基因(deletion)而產生的變異株。由於豬傳染性胃腸炎(TGE)是傳染性非常強的疾病,它會以很快的速度爆發大流行,所以非常迅速的診斷來確認這疾病是非常重要的。但這疾病也會變成低程度的感染狀態,變成離乳後仔豬下痢的地方性疾病。

1.

病原菌的鑑別

病毒可以由組織培養、電子顯微鏡、各種不同的免疫學診斷方法和最近更具特異性的病毒DNA之檢測來加以確認。另外,在缺乏診斷設備來做特殊的試驗時,也可以用一個變通的辨法,將懷疑被感染的動物之腸道內容物讓有感受性的仔豬口服。但是仍需要藉實驗室的診斷方法來確認接種動物的感受性,以及是否確實是受到豬傳染性胃腸炎(TGE)的感染。最常被使用的診斷方法是血清學的試驗,特別是用於檢查糞便的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)以及在腸道冷凍切片(cryostat sections)的螢光抗體試驗(FAT)。逆向被動血球凝集(reversed passive haemagglutination)試驗也曾被使用過。另外一種腸道疾病,稱為豬地方流行性下痢(porcine epidemic diarrhea)是由血清學上不同的冠狀病毒所引起,它們在電子顯微鏡底下看起來和TGE病毒相類似。所以,診斷上用免疫電子顯微鏡鏡檢可以解決這個問題。

(a)

由組織培養分離病毒

除了接種於活的仔豬之外,這是最明確的診斷方法。但如果用它來作為例行性的診斷時則不但慢而且非常費事。

分離病毒之樣本通常取自糞便或是動物屍體,特別是要從腸道來取得。將感染的腸道兩端縛住使內容物保存在腸道裡這是取得樣本最好的方法。由於病毒在熱底下不安定,所以樣本一定要新鮮而且要在低溫之下。

取得的樣本用含青黴素(1,000單位)、二氫鏈黴素(dihydrostrepto-mycin)(1000μg)和制黴菌素(mycostatin)(20單位)的磷酸緩衝溶液(PBS)使其均質化並配成pH7.2的10%懸浮液。這懸浮液在避免陽光的照射下在室溫度靜置30分鐘。然後用超音波將懸浮液震盪以及低速離心。取其上清液加入等量用熱不活化的牛血清使其減少細胞病變作用,然後再接種到有感受性的培養細胞,例如3 ~ 4天初代培養或二代培養的豬腎單層細胞(pig kidney monolayers)。其它低次數繼代的豬培養細胞(例如甲狀腺或睪丸)以及一些細胞株也可以作為病毒的初次分離之用。在37℃之下培養一小時之後,用培養液將這層細胞覆蓋,培養液可以用含重碳酸氫鈉、青黴素(100單位)、二氫鏈黴素(dihydrostreptomycin)(100μg)、制黴菌素(mycostatin)(20單位)和1%小牛血清的Earle's酵母乳蛋白(EYL)的平衡鹽溶液。培養液若加入胰蛋白酵素可以增加初次培養的病毒分離率。未接種之對照組的培養是同時進行的,所有的培養是在37℃之下進行。

在3 ~ 7天之後可以看到病毒的細胞病變作用(CPE),它的特徵是細胞圓形化、增大、形成融合細胞(syncytia)並浮在培養液裡,但斑點(plaque)的形成有時會比較可靠而且容易確認。較合適的斑點形成的覆膜是1.6%的noble瓊脂溶於含1% NaCO3、抗生素(如上所述)、0.7%中性紅(neutral red)和1% DEAE(100μg)的 2 x MEM。野外毒(wild-type)的TGE病毒無法在組織培養中穩定地生長,所以在能看到這些明顯可視的改變之前,可能要經過數次的繼代。具有細胞病變能力的病毒必須要用免疫染色法(immunostaining)或是試管內的中和試驗藉著TGE病毒特異性的抗血清來確認是否為TGE病毒。如果有合適的單源抗體(MAbs)時,可以用免疫染色法來區分它是TGE病毒或許是PRCV病毒。區分TGE病毒或許是PRCV病毒也可以用TGE病毒-特異性cDNA探測法。

(b)

病毒抗原的螢光抗體試驗

腸道冷凍切片(cryostat sections)的螢光抗體試驗(FAT)是非常快速、敏感和具有特異性的鑑別TGE病毒的方法。這試驗必須要用剛出現本病的臨床症狀(也就是在感染24 ~ 28小時之後)的4週齡以下的新鮮死豬。在死亡30分鐘之內由小腸後段四個不同的區域採集約2公分長度的樣本,並將之切成 5 ~ 10 mm 的長度用液態氮保存起來。正確的操作方法能讓之後冷凍切片機切出好的橫切面。切下來的部位再切成6μm厚,置於蓋玻片上讓其自然乾燥再用丙酮固定。固定的陽性和陰性對照部位貯存在 -20℃以備染色。用pH8.7的Tris緩衝液洗過之後,用異硫氰酸鹽螢光素(FITC)-軛合TGE病毒抗體的稀釋液來染色,然後置於有溼度控制的37℃恒溫箱內30分鐘。任何未結合的染色液,用Tris緩衝液將之洗掉。最後再用稀釋10-5的伊凡氏藍(Evans blue)在Tris緩衝液下做對比染色,以及加上甘油。

染色的部位要儘快在螢光顯微鏡下觀察。染色的品質可以和對照組做比較。正確的判讀需賴絨毛結構的保留程度以及上皮細胞之細胞質內的螢光(intracytoplasmic fluorescence)檢查。

過氧化氫酵素 - 抗過氧化氫酵素法(peroxidase-antiperoxidase method)是最近發展出來用於檢查冷凍、福馬林固定或石蠟包埋組織的TGE病毒和PRCV病毒之新技術。

(c)

糞便中病毒抗原的酵素結合免疫吸附試驗

可以用雙抗體三明治系統(double antibody sandwich system),例如阱捕單源抗體(Mabs)和多源的酵素結合偵測抗體(polyclonal enzyme-linked detector antibody)。抗-TGE病毒單源抗體是可以捕捉病毒核酸蛋白上的抗原決定部位(epitope)者,它由腹水(ascitic fluid)純化而得。以 96- 孔的微滴定盤在pH9.6的重碳酸鹽緩衝溶液於4℃下隔夜感作來進行。糞便樣本是用pH6.0的Mcllvaine's緩衝溶液來製備,然後再用含0.05% Tween 20、1%明膠、1% Nonidet和適當的乾燥奶粉調配成pH7.2的PBS來稀釋。微滴定盤在加入製備好的糞便樣本之前,用緩衝溶液(含0.05% Tween 20 的PBS)洗兩次。然後在37℃下感作2小時。在另一次洗淨之後將過氧化氫酵素-結合豬多源TGE病毒抗血清加入含0.05% Tween 20、1%明膠和5%正常豬血清的PBS內,然後置在37℃下2小時。將滴定盤洗六次之後加入酵素受質,它是用四甲基聯苯胺(tetramethyl benzidine) (0.1 mg/ml) 溶於0.1摩爾的醋酸鹽緩衝液內並使其含 0.00225% 的過氧化氫(hydrogen peroxide)。讓其作用5分鐘之後,加入2.0M的硫酸使其作用停止。每一個滴定盤裡都要加入對照的陰性抗原和對照的弱陽性抗原。

2.

血清學試驗

當抗體的力價昇高時,用血清學的方法可以檢測出來。如果樣本是來自血清學診斷為陰性的族群,而發現有單一個血清樣本為陽性的話也具有診斷上的價值。防止可能發生的潛伏性病毒感染,所以儘量祗接受血清學診斷為陰性的豬隻。血清學診斷一般也可以用來作為進口豬隻時的檢驗方法。

感染TGE或是PRCV之後的第6 ~ 7天可以由血清中偵測出抗體的產生,而這些抗體會至少在體內維持數個月之久。雖然TGE和PRCV抗體可以和其中任何一種病毒產生完全的中和反應,但是在其它非中和性抗體部份則有不同程度的特異性存在,因為PRCV缺少存在TGE病毒上的某些抗原決定部位。所以在做酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)時,單源抗體可以針對這些部位產生完全屬於TGE病毒之特異性反應。雖然它們不會和PRCV抗血清產生假陽性的結果,但由於和中和試驗比較它的敏感度仍較低,所以有可能產生假陰性的結果。而且由於TGE病毒會產生很多的變異株,所以沒有任何單一的TGE病毒特異性單源抗體會認出所有的病毒株。這敏感度不夠的問題,可以用檢測一群為單位來解決。

(a)

豬傳染性胃腸炎病毒/豬呼吸道冠狀病毒的試驗

這些試驗是根據TGE病毒/PRCV群特異性單源抗體用病毒中和(VN)試驗、間接酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)和競爭酵素結合免疫吸附(ELISA)試驗的方法來檢測TGE病毒和PRCV病毒。以血球凝集為基礎的試驗可能也可以歸於此類。

病毒中和試驗可以在各種不同的細胞型態和不同的病毒株中進行。最常使用的是包括豬睪丸以及初代或連續培養的豬腎細胞等之細胞株。這些試驗已經是行之有年,並且一般都被用來作為和其它新的試驗方法比較之標準。Witte的改良方法是用平底組織培養梯度微滴定盤、來自犬直腸腫瘤的A72細胞的細胞株和經過下列細胞馴化的野外病毒株:100 TCID50的病毒和經過熱不活化的測試血清一起培養,並在用加入抗生素、10%小牛血清和1%L-麩胺醯胺的Leibovitz15培養基培養的A72細胞培養之後,用中和試驗的結果並沒有發現細胞病變作用(CPE)的存在。在所有小孔中反應的總體積必須是150μl。

˙ 病毒中和試驗:試驗步驟

(1)

血清在56℃的水浴中置30分鐘將病毒不活化。

(2)

從未稀釋血清開始以在細胞培養液裡將測試血清做二倍稀釋(這中和反應在加入等量的病毒溶液之後會再被稀釋成1/2)。在96-孔平底細胞培養微滴定盤裡製備稀釋液,每個稀釋濃度用三個小孔,每個小孔用25μl。必須包含陽性和陰或對照血清。沒有標準血清可供應用時,則必須在適當的範圍滴定內部使用的陽性標準血清,以備參考。

(3) 每小孔加入25μl的TGE病毒溶液,它在培養液的稀釋濃度應每小孔調整為100 TCID50。在三個不同血清稀釋濃度的小孔中,將病毒加入其中的兩個小孔。第三孔則作為單獨血清的對照,並每孔必須加入25μl的培養液以代替病毒。
(4) 剩餘的病毒以四個10倍的反向稀釋步驟,每一孔用25μl並且每一個稀釋濃度至少有四個孔。每一個反向稀釋的小孔加入25μl的培養液,來彌補未加入測試血清所短少的量。
(5) 置於搖擺器上搖動滴定盤,然後在含CO2之37℃下感作1小時。
(6) 每一小孔加入100μl含2 x 105細胞的A72細胞懸浮液。
(7) 將滴定盤置於含CO2之37℃下培養3 ~ 7天。
(8) 在顯微鏡下觀察它的細胞病變作用(CPE)。檢查反向稀釋的病毒(它應可得到100 TCID50的值,可以接受的範圍是 50 ~ 200 TCID50)和對照血清。標準陽性血清不管由那邊開始,它的預測平均值必須在0.3 log10的範圍內。必須參考適當的血清來判讀每一個不同稀釋濃度的測試血清 - 祗有對照血清能夠區分病毒引起的細胞病變作用(CPE),還是血清引起的細胞毒性或是污染的原因。
(9) 當測試血清的稀釋濃度在孔中可以中和50%時,所得的結果用Spearman-Karber方法來判定。
(10) 陰性血清應該在最低稀釋濃度下也不會產生中和反應(亦即,未稀釋血清,相等於在中和階段稀釋1/2的濃度)。

(b)

豬傳染性胃腸炎病毒 - 特異性試驗

這些是用祗能辨別TGE病毒而不能辨別PRCV 的單源抗體(Mab)來進行的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。用能被單源抗體所辨別的TGE病毒感染豬的血清作為測試血清,它所含的特異性抗體能夠和被覆TGE病毒抗原的酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)盤產生競爭結合的現象。試驗盤上所使用的抗原是來自接種或是未接種TGE病毒的組織培養腎細胞株的細胞溶解物。另外,也可以用接種或是未接種TGE病毒而用80%丙酮固定的豬睪丸細胞來作為抗原的來源。用pH9.6的重碳酸緩衝溶液來使陽性和陰性抗原被覆在微滴定盤上的不同行的小孔內。稀釋測試血清,包括陽性和陰性對照血清,並加入到適當的小孔內。培養隔夜之後,再加入稀釋的單源抗體到所有的小孔內。被結合的單源抗體可以用過氧化氫酵素-軛合的抗小白鼠抗體(peroxidase-conjugated anti-mouse antibody)檢測出來,它可以在適當的受質下產生顏色的變化。這顏色的變化,可用分光比色計(spectrophotometer)來測定,並且每一個測試的樣本它的淨值是陽性和陰性抗原之間吸光度的差,它是以陰性對照血清的百分比來表示。這試驗的陽性 - 陰性分界值(negative-positive cut-off value)必須由先前試驗的已知陰性和陽性族群之結果來決定。

B. 疫苗和診斷用生物製劑之需要條件

在許多國家已有針對TGE的疫苗。

在美國核准上市的TGE病毒疫苗之有關實驗室及野外試驗的結果已經做了通盤的檢討,它包括在野外之效力可能受到的限制和有關最適合之TGE病毒疫苗設計觀念等。在美國已有八家製造廠商被核准生產TGE疫苗:這些疫苗包括六種改良的活毒和二種不活化疫苗。改良活毒疫苗可以用於懷孕母豬的口服(使產生被動免疫)或也可用來作為哺乳或離乳仔豬的口服疫苗(使產生主動免疫)。不活化TGE疫苗可以經由懷孕母豬的肌肉注射或是經由哺乳或離乳仔豬的腹腔內注射。一般來說,在實驗室裡及野外的試驗證實這些疫苗可以提供哺乳仔豬足夠的被動免疫保護。雖然這些疫苗無法完全防止地方流行性TGE的爆發,但根據資料顯示,疫苗仍可以藉由在血清和乳中產生的記憶性抗體反應來達到某種程度的保護作用。

TGE疫苗所碰到的困難是無法在乳液中產生足夠高濃度和母豬自然感染TGE病毒時相似的分泌性免疫球蛋白A(SIgA)。而且這些疫苗也無法充份地保護母豬避免TGE的感染,因此當這些母豬感染時,仍會造成食慾不振、不分泌乳汁和無法產生保護仔豬的抗體。我們因此推斷這改良的活毒疫苗可能在腸道繁殖時失去某些產生保護性免疫的物質或是投與血清學陰性的新生仔豬時可能已經改變了它的毒力。死毒疫苗投與母豬時,不會產生分泌性免疫球蛋白A(SIgA)抗體,細胞免疫(cell-mediated)反應很弱而且免疫維持時間也很短。曾經用PRCV病毒株來製造TGE疫苗,但它們的免疫效果非常差或祗有部份的交叉免疫保護效果。但是,在歐洲的豬群廣泛流行PRCV的感染卻能使TGE的流行相對地大為降低。發展TGE 疫苗的新DNA重組策略,包括使用S蛋白次單位(S protein subunit)疫苗(視粘膜輸送系統的發展和佐劑而定)、使用活的重組病毒或使用可以產生有效免疫力之TGE病毒基因的細菌性載體(bacterial vectors)等。

對於製造疫苗來說有許多必須遵守的基本要求(例如在核准的工廠生產、標籤的規範、可追蹤能力等)都和一般生物製劑產品的要求類似。TGE相關的管理法規(稱為標準要求或SRs)包括疫苗必須做的各種測試和使用的物質要求等。詳細的TGE標準要求內容,可以參考美國聯邦管理法規(Code of Federal Regulations, CFR)第九章第一卷的第113部份(以下簡稱9CRF, 113)。另外,也可以參考歐洲葯典。但不幸的是,目前為止對TGE病毒疫苗仍沒有統一的標準規範。

1.

種毒的管理

(a)

種毒的特性

種毒必須純度試驗和病毒的鑑別試驗。純度包括沒有細菌和黴菌(9CFR, 113.27)、黴漿菌(9CFR, 113.28)(35)和外源性病毒(9CFR, 113.55)(35)等的污染。病毒的鑑別試驗是用病毒中和(VN)試驗或螢光抗體試驗(FAT)。有關涉及遺傳工程的疫苗或是自然選擇的疫苗必須附上抗原 - 基因缺損 (antigen-coding gene deletion)/不活化的方法,以提供對這病毒(基因型 和/或 表現型)的參考。

(b)

培養方法

培養必須在乾淨的(被核准的)細胞內進行,並且限制細胞的繼代次數(通常都是五次以下)。細胞株的來源並不限定要從疫苗使用之動物得來。

(c)

合格的疫苗

合格的疫苗可分為兩種形式。假若病毒做最高次數的繼代時種毒一定要考慮是否仍有免疫產生能力,並且必須要符和產品的申明。具有保護能力的最低抗原濃度(改良的活毒力價或是不活化抗原顆粒)必須作為以後生產疫苗的基準。活毒疫苗必須研究造成力價變異的因子,和以時間所做的死亡曲線記錄。這些試驗用疫苗製造商必須測試它的純度、安全性和免疫效力。另外,必須具備有防止有毒力的病毒株自然感染下所造成的疾病。有毒力的攻擊病毒之定義是可以造成有感受性之對照組95%以上均產生疾病。預先製備三批疫苗,並經過製造商的測試後,再送到核准機關做力價、滅菌和安全試驗。

2.

製造方法

製造方法涉及各廠商的專利,所以在此沒有資料提供。

3.

過程中的控制

大部份都屬於專利。有些過程中的控制直接和生產有關(例如發酵桶內O2的含量),其它的部份則包括力價的測試等。對所有的疫苗而言,最後生產批次或容器之力價測試越簡單則越可能被用來作為監控/混合試驗:例如,用次批病毒所測出的病毒力價可能可以用來預測最後一批的力價。由動物來源的疫苗必須避免其他病原的污染。

4.

批次控制

每一批最後的混合必須符合所要求的規格和分裝後所要求的規格(例如,可能放在一起發酵或是可能和其它三批分開後,再混合)。許多國家都有針對大量生產之過程的控制方法,它們都必須經過嚴密的管理和仔細的檢查。在美國這些檢查的重點都放在最後的成品上。生產過程中的控制技術必須詳列於生產執行細則裡,並且必須有意義、可追蹤性。如果發現有不符合的產品,生產廠商必須將之捨棄。

如果這一批生產是要輸出國外分裝或是再混合時,則必須將之視為最終產品做全部的檢查。

(a)

滅菌

所有的產品必須測試其滅菌的效果。為了做好監控,製造商應該在每一批的生產上先做滅菌程度的測試。試驗的方法和第B.1.a相類似。

 

(b)

安全性

安全性的試驗必須在核准上市之前即做好,並且在分裝至最後容器時,再做一次(請看第B.5.a和B.5.b節)。

(c)

力價

通常在分裝至最後容器時,祗用較簡單的測試方法(例如酵素結合免疫吸附試驗)來測定其力價。

(d)

免疫有效時間

免疫可以維持的有效時間通常都是在取得執照之前,即完成一系列的測試,而不是在每批生產時做。新的產品必須再重新接種之後,在特定的時間內做效力試驗(攻擊試驗)以符合標籤上所示。

(e)

穩定性

穩定性的資料必須在取得執照之前已建立完備。通常都用加速老化的方法(37℃),而不用如標籤上所示,貯存於4℃之下並且用相同的時間來檢測疫苗的壽命,將所得的數據再和以後的確實壽命資料比較之後再做調整。製造商不需做穩定性的測試,但製造商必須陳述在整個保存期限(shelf life)疫苗內所含的抗原量。由將30天後即將過期的疫苗中選出,測試它們的力價是否和製造商所陳述的相同。穩定性也會受溼度的影響,乾燥的產品如果受潮的話,會使其壽命變短,所以必須在最終產品或是在過程中做測試。

(f)

保存劑

產品裡所含抗生素的量有最大濃度的限制。疫苗內所含的成份在動物屠宰之後,必須不能有任何殘留。保存劑的使用是屬於專利的一部份。

(g)

注意事項(可能的危險)

任何疫苗接種時,可能發生的危險必須明白地列於標籤上。這些可能的危險包括活毒疫苗在懷孕時使用,可能產生流產的危險以及可能造成全身性過敏的危險等,另外或許是有關導致注射部位的酸痛或是水腫或是在有些情形會造成發燒以及精神不振等。目前,TGE疫苗沒有較特殊應在標籤上註明的事項。

5. 成品的測試

(a)

安全性

通常是用小白鼠 和/或 天竺鼠或是豬來做安全試驗(9CFR, 113.33和44)。最後產品同時也做它的滅菌試驗。

(b)

力價

沒有一種試驗可以用來做為測試力價的唯一方法。不過測試的主要目的是觀察是否能夠產生足夠的免疫保護能力(效力試驗)。活的TGE病毒疫苗的力價是用試管內的滴定試驗或是用細胞培養來做病毒的感染試驗。疫苗所含的力價必須能在實驗室下對最小量的病毒攻擊,以及能在野外對自然感染有足夠的保護能力。死毒疫苗的力價測試是接種不同劑量的疫苗之後,再以病毒來做攻擊試驗。此產品的疫苗在接種實驗動物之後,所產生的中和抗體力價必須要產生足夠的免疫抗體。

死毒疫苗中特定的病毒抗原所產生的中和性抗體可以用對TGE病毒S蛋白質的特異性單源抗體(Mab)在酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)的方法來測定其保護能力。

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