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雞傳染性支氣管炎
Avian infectious bronchitis
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家禽傳染性支氣管炎( Avian Infectious Bronchitis, IB )

        傳染性支氣管炎 (IB) 是一種引起雞急性呼吸症狀的傳染性疾病,IB 病毒感染雞隻會造成慢性或急性的腎炎,有時亦會造成蛋雞產蛋的障礙。當呼吸道有其他病原存在時,則 IB 病毒對呼吸道的病害性會加劇。本病之臨床症狀顯著,但依據此無法診斷為 IB,必須病毒分離或利用血清學的方法証實有 IB 病毒,方能証實雞罹患 IB。由於活毒和死毒的疫苗的廣泛使用,使得利用病毒分離和血清學等方法來診斷 IB 益形複雜。IB 病毒之抗原變異株可能使傳統疫苗在免疫誘發上變成無效。實驗室對本病的診斷是利用雞胚胎或氣管培養來進行病毒分離試驗。其他如免疫螢光法、電子顯微鏡技術、血球凝集抑制試驗或酵素連接免疫吸附法等均可為補助診斷之方法。

病原鑑定:可採氣管、腎進行病毒分離,接種於 9~11 日齡 SPF 雞胚胎或氣管培養,大約經盲目三次連續繼代培養增殖後雞胚胎會出現發育中止或死亡現 象。氣管組織培養的優點是 IB 病毒初次接種對氣管纖毛有阻滯生長運動的功 能。本病毒可利用特異的抗血清進行試驗加以鑑定,利用免疫螢光染色法或電子顯微鏡技術亦可觀察到感染尿囊液的病毒抗原。IB 病毒抗原性鑑別是困難且有爭議性。在同一實驗室中利用不同血清學的方法可以顯示出抗原相關性或差 異性。利用單源抗體可以區別疫苗株和野外毒株的差異,並亦可鑑定血清型。

血清學試驗:利用監控雞群 IB 抗體,以確認疫苗的反應和助於疑似暴發病 例的診斷。血球凝集抑制試驗是一種快速、不昂貴和具實用性檢測抗原變異病 毒的方法。商業上 IB 診斷套組是一種非常敏感和適合檢測對免疫產生的疫苗反 應,而利用酵素連接免疫吸附法可檢抗體反應,但本法缺乏型別特異性。IB 陽性診斷之確認可利用病毒分離和特殊抗體來加以證實。

A、病原鑑定

採樣

(一)

一般疑似 IB 病例採樣,可以在產生急性呼吸道病例時,採取氣管拭子或禽體的氣管和肺組織,並添加入磷酸緩衝溶液(含 Penicillin 10,000 IU / ml, Streptomycin 10 mg / ml),迅即移置於冰凍中。若病雞出現腎炎或產蛋障礙時,儘可能採取腎臟或輸卵管等臟器,另外亦可採取大腸之盲腸扁桃或糞便等試材亦可獲得高的病毒分離率。

(二) 試驗材料可利用無菌並含抗生素的培養液研製成 20 % (w / v) 組織懸浮液, 再直接接種於雞胚胎或氣管組織細胞。

培養

(一)

雞胚胎和氣管組織培養細胞廣泛應用在病毒感染力價測定或病毒初次培養,初次分離病毒時不使用細胞培養,因為 IB 病毒分離株必須先經雞胚胎馴化後,方能在細胞培養中觀察到病毒產生的細胞病變效應。

(二) 所有應用於 IB 病毒增殖之雞胚胎或組織細胞必須來自未感染或未接種 IB 病毒疫苗之雞所生產的蛋或雛雞,且這些試驗的雞胚胎蛋最好亦取自於無特定病原種雞所生產的蛋。
(三) 取 0.1~0.2 毫升試材上清液接種於 9~11 日齡雞 SPF 胚胎尿囊腔,接種後每天觀察,並淘汰丟棄接種後 24 小時內死亡的雞胚胎。一般接種後約 1 週內會有反應,除非某些病毒株已在雞胚胎馴化過,否則初次接種於雞胚 胎是無反應的。
(四) 接種 5~7 日後收集雞胚胎尿囊液,並加入 1 / 5 或 1 / 10 量的含抗生素溶液, 並繼續接種下一個雞胚胎蛋,前述方法重覆數次可達分離病毒之目的。野外病毒株經二次或三次盲目繼代接種即可導致雞胚胎死亡或雞胚胎畸型。 將採集之具感染性的尿囊液置於零下 60 ℃ 或以下保存,或經冷凍乾燥處 理保存在 4 ℃。
(五) 氣管培養可以由 20 日齡 SPF 之雞胚胎製備,並可將試材直接接種於此培養的氣管中以達分離 IB 病毒之目的。利用組織切割機可以製備大量橫切片斷或氣管環,使每一個氣管環大約 0.5~1 mm 的厚度,並加入細胞維持培養液(Eagle's N-2-hydroxyethyl piperazine N'-2-ethanesulphonic acid, HEPES),在 37 ℃ 中培養,則在病毒感染後 24~48 小時氣管上皮細胞會產生纖毛不動的現象。

病毒鑑定方法

 

雞胚胎中進行病毒中和試驗和免疫擴散法可為病毒鑑定之方法等,另外螢光抗體試驗亦可檢測雞胚胎尿囊液中的 IB 病毒。電子顯微鏡技術之負染色法亦能証實存在於尿囊液或氣管培養液中之典型冠狀病毒的結構,尿囊液中 IB 亦可使用聚合酶鏈反應增幅病毒及 DNA 核酸探針之墨點雜交法証實 IB 病毒,直接免疫螢光染色法亦能快速檢測存在氣管上皮細胞的 IB 病毒顆粒。

血清型的鑑定

(一)

IB 病毒株抗原性和生物性的變異有許多文獻報告,但目前沒有確切的分類系統,因此在病毒株間抗原性的相關性和差異性是重要的,例如某一特定亞型疫苗具少許或無保護不同抗原性群之現象。

(二) 由於病毒之抗原變異株規則性出現的結果,使得本病之感染情況和疫苗使用上在不同地理上的位置亦不同。由於病毒長期存在野外使得疫苗對抗原性變異株表面有效性是重要的,IB 病毒分離株血清型之區別,可以利用雞胚胎中氣管和細胞培養進行病毒中和試驗,另外螢光病灶的中和試驗亦可應用於區別病毒株。血球凝集抑制試驗亦可應用於病毒血清型鑑定,並証實本法是提供早期檢測血清反應的方法。
(三) 病毒抗原變異的分子生物學研究亦已被証實,通常是轉譯 S (spike) 蛋白之核酸序列或是轉譯 S 蛋白之次蛋白 S1 核酸序列,尤其是能與中和抗體結合的抗原決定位亦被証實。利用病毒中和試驗而無法檢測出者,確認不同血清型在 S1 次單位之胺基酸序列有大的差異(約 20~50 %),其他的病毒可以明顯地利用中和試驗區別者,其胺基酸序列僅有 2~3 % 的差異。
(四) 由核酸序列分析得知 IB 病毒株間會產生明顯的重組作用,且利用核酸棎針或限制片斷多形性分析 (restriction fragment length pohymorphism, RFLP) 等區別 IB 病毒之血清型。利用後者的方法可以很明顯區別病毒株間 抗原性的差異,使得此法為快速評估可能野外分離株之血清型。
(五) 單源抗體應用於酵素連接免疫吸附法檢測病毒血清型中,可以証實 IB 病毒株之分群與型別。某些 IB 病毒群已顯示具有生物性和免疫原性的特性, 未來單源抗體診斷盒可資利用為鑑定血清型的實用方法。

B、血清學試驗

許多血清學的檢測試驗已廣泛使用,包括病毒中和試驗、免疫擴散法、 血球凝集抑制試驗和酵素連接免疫吸附法等。每一種試驗在實用性、特異性、敏感性和花費均有其利弊得失,就整個血清學試驗而言,病毒中和試驗操作上較費時且不實用,如瓊膠免疫擴散法缺特異性與敏感性。HI 和 ELISA 雖二法特異性上有差異,但二者在血清學檢驗上是較佳的。ELISA 診斷組在應用 於檢測血清上有操作手冊可參閱,而 HI 試驗於後再述之。

病毒中和試驗 (Virus neutralisation; VN)

(一) 在進行病毒中和試驗前所有的血清必須經 56 ℃ 加熱 30 分鐘,病毒再與檢測血清充份混合在室溫中感作 30 至 60 分鐘,並接種於雞胚胎或感 染組織培養細胞,但是仍以氣管環細胞或組織培養細胞系統等方法來 檢測抗體較佳。有二種估測中和抗體的方法,其一是血清濃度固定及 各稀釋濃度病毒液(α-method;α 法),另一是病毒感染力價固定及各 稀釋血清濃度(β-method;β 法)。
(二) 在 α 法檢測中,經雞胚胎馴化病毒十倍連續稀釋濃度與固定抗血清濃度(約 1 / 5)充份混合並接種 5 至 10 個雞胚胎蛋,同時進行病毒單獨感染 力價測定,終點測定 (End-points) 以 Karber 或 Reed & Muench 法來估測。 中和試驗指數 (Neutralisation index, NI) 表示抗血清與病毒感染力價 之 log10 間的差異值結果。NI 值在同源性的病毒 / 血清混合物可達 4.5~7.0。 此 NI 值若小於 1.5 時為非特異性反應,但是異源性病毒時,則產生的 NI 值亦必然小於 1.5。
(三) β-法亦更廣泛使用於利用雞胚胎來測定中和試驗,以達檢測抗體分析之目的。本法主要是抗血清 2 倍或 4 倍連續稀釋濃度和 0.05 ml 和 0.1 ml 的固定 100 EID50 (50 % egg-infective doses) 感染力價病毒液作用混合, 再將混合物經尿囊腔接種 5~10 個雞胚胎蛋,亦同時進行病毒感染力價 測定,以達証實病毒 / 血清混合物中的病毒感染力價維持在 101.5 至 102.5 EID50 之間,血清力價之終點測定以 Kaber 或 Reed & Muench 來估測之,但以 log2 稀釋濃度表示之。此種固定病毒濃度而血清不同濃度的 方法也曾在氣管臟器細胞培養進行中和試驗分析,並每一血清稀釋濃 度同時加入 5 個培養細胞。根據 Reed & Muench 法估測抗體力價的結 果中,病毒感染力價以 50 % median ciliostatic dose per unit volume (log10 CD50) 表示,血清中和力價再以 log2 稀釋濃度表示。此中 和試驗比其他試驗敏感,但此種計算分析在應用上會產生許多的困擾。

血球凝集抑制試驗 (Haemagglutination inhibition, HI)

(一) IB 病毒之 HI 已有標準操作步驟,本法之操作於後有詳述標準操作。許多 IB 病毒分離株經特殊處理後顯示可凝集雞的紅血球。
(二) 抗原的製備。
(1) 具病毒尿囊液經 30,000 g 離心 3 小時,倒棄上清液,並將沉澱物 (pellet) 以 100 倍之濃縮液 (0.01 M Triz HC1 buffer, PH 6.5) 再懸浮。
(2)

IB 病毒必須經酵素處理血球凝集素 (Haemagglutinin, HA) 才具有活性,此處理酵素即是磷酸脂酶 C 第一型 (phospholipase C type I enzyme)。 病毒懸浮液與等量磷酸脂酶 C 第一型酵素混合,使其終濃度為每毫升含有 1 單位 (unit) 的酵素。Clostridium perfringens 之培養菌液經過濾所得到之粗製的上清液具有 phospholipase 的功能。許多研究指出 這些磷酸脂脢大部份是神經胺基酶 (Neuraminidase),此種病毒 / 磷酸脂酶之混合物靜置於 37 ℃ 作用 2 小時。HA 和 HI 等試驗最好在 4 ℃ 情況下操作。

 

(一) 血球凝集試驗 (Haemagglutination test, HA)
(1) 分注 0.025 ml 磷酸緩衝溶液(phosphate buffered isotonic saline, PBS, pH 7.0~7.4)於 96 孔力價測定盤(v 字型底)。
(2) 加 0.025 ml 病毒液入測定盤之第二孔,為準確測定 HA 的含量,則病毒 液先稀釋一濃度如 1 / 3,1 / 4,1 / 5,或 1 / 6 等,再進行極限稀釋。
(3) 以 0.025 ml 的病毒量在測定盤上進行連續 2 倍稀釋至每一孔。
(4) 每一孔再加入 0.025 ml PBS 溶液。
(5) 最後每一孔加入 0.025 ml 1 % 雞紅血球懸浮液。
(6) 將測定盤置於震盪器輕微震盪,並靜置 40 分鐘,對照組之紅血球必須 沉降至 v 字型底部。
(7) 將測定盤傾斜以判定 HA,並觀察 RBC 是否有眼淚狀的流出物,若沒有 眼淚樣的流出物則可判讀到最高稀釋倍數的 HA,此表示為 1 個 HA 單位 (HA unit,HAU),且從最初的稀釋範圍而準確計算出含多少 HA 單位。
(二)

血球凝集抑制試驗 (Haemagglutination inhibition test, HI)

HI 試驗廣泛應用於診斷和檢測雞群對疫苗預防接種之效力。
(1) 取 0.025 毫升的 PBS 分注測定盤之每一孔(V-字型底)。
(2) 加 0.025 毫升血清入測定盤第一孔。並經 2 倍連續稀釋每一孔為 0.025毫升。
(3) 每一孔再加入 4HAU 的病毒抗原輕微震盪,並靜置 30 分鐘。
(4) 每孔再加入 0.025 毫升 1 % 雞紅血球懸浮液輕微振盪後靜置 40 分鐘,且對照組之正常 1 % 雞紅血球懸浮液應可沉降至 V 字型底部。
(5) HI 的力價是指血清最高稀釋濃度可以完全抑制 4HAU 的抗原。由傾斜觀察測定盤之凝集試驗會更精確。對照組的孔僅含有 0.025 毫升 1 % 的雞 紅血球懸浮液和 0.05 毫升的 PBS 同樣有眼淚樣的流狀物。陰性對照組其血清力價不可大於 4 倍,且陽性對照組血清必須檢測出預估之 HI 力 價。
(6) 若檢測血清抗體力價當 16 倍或以上值時則此血清為陽性反應,特別注意有時某些小部份 SPF 雞群會產生 16 倍的非特異性抗體力價。

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