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傳染性華氏囊病( INFECTIOUS BURSAL DISEASE )

       傳染性華氏囊病 (infectious bursal disease, IBD) 是由一種雙股 RNA 病毒所引起。被歸類於 Birnaviridae。雖然火雞、鴨、珠雞均可被感染,但只有雞感染會有臨床症狀,亦只有小雞會被感染。嚴重又急性的 IBD 通常伴隨著高死亡率,但是亞急性或無臨床症狀的 IBD 卻較常見。由於病毒感染免疫器官華氏囊 (bursa of Fabricius),故此病可造成二次感染的問題。IBD 病毒會造成華氏囊之淋巴組織減損,如果此情形發生在 2 週齡之內的小雞,體液抗體 (humoral antibody) 反應就會被嚴重的抑制。目前 IBD 病毒已有兩種血清型被確認,臨床致病並且已有疫苗的是 IBD 第一型。近來研究顯示有 IBD第一型血清變異株發生,此需特別疫苗來做最大的保護,在許多國家 IBD 病毒非常強之毒株已經出現並且導致發生嚴重的病亦超過 10 年。

IBD 亦稱甘保羅病 (Gumboro disease),通常本病可由特異的症狀與死後病變來診斷。實驗室確診或無臨床症狀感染的偵測,可由體液免疫反應或組織內病毒抗原檢測來証明,若沒有這些試驗,華氏囊組織病理切片亦有所幫助。

病毒証實:例行之診斷程序通常並不分離 IBD 病毒。當需要分離病毒時,某些困難是可預期得到的。如需無特定病原雞或雞胚胎或細胞用於病毒分離。分離的病毒可經由病毒中和試驗(virus neutralization, VN)証實。

膠內免疫擴散反應(agar gel immunodiffusion, AGID)試驗可用於華氏囊內病毒抗原之偵測。取一部份之華氏囊均質化後,當做抗原與已知陽性血清反應。此法在早期感染尚未產生抗體時特別有用。

血清試驗:AGID 或 VN 或酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 均可用於血清學診斷。本病在一群雞中通常散佈快速。因此只需要測定一小部份雞血清即可。若是發現陽性反應,就視為整群雞均被感染。

A、病原鑑定

臨床型 IBD 有非常典型的症狀與死後病變;要証實或檢測無臨床症狀的感染最好用血清學的方法,IBD 病毒分離較為困難,例行診斷通常並不做病毒分離。當有特殊情形必需分離病毒時,可依照下列方法進行。血清型第一型與第二型之區分則必需在特定的實驗室檢定(如:OIE 之 IBD 參考實驗室)。

 樣品準備

無菌摘取 5 個早期感染雞隻之華氏囊,將它切碎,加入少量含有 penicillin與streptomycin(各 1,000 mg / ml)之 pepton 培養液,將其均質化。將此均質液以 3,000 g 離心 10 分鐘,回收上清液,用做後續的檢驗。

 以細胞培養分離病毒

取 4 支長滿雞胚胎纖維芽細胞(無特定病原來源)之 25 cm2 組織培養瓶,各接種0.5 ml 樣品,在 37 ℃ 吸附 30 分鐘,再以伊耳氏平衡鹽液洗 2 次,然後加入維持液,每日觀察是否有細胞病變作用 (cytopathic effect, CPE),若有則會有圓形折射性細胞出現。若 6 天後仍沒有 CPE,將它冷凍解凍後之溶液接種新的細胞,此步驟可能需要重複至少 3 次。若是發現 CPE,則病毒應以 IBD 血清進行中和試驗 (virus neutralization, VN)。

 以雞胚胎分離病毒

取 5 個特異抗體陰性(specific antibody negative, SAN)之 6 至 8 日齡雞胚胎,接種 0.2ml 樣品入卵黃囊,同時取 5 個 SAN 之 9 至 11 日齡雞胚胎,接種 0.2 ml 樣品入絨毛漿尿膜上,每日照蛋,48 小時以內死亡者丟棄,其中 SAN 胚胎需來自 IBD 病毒血清陰性之雞群。胚胎在 48 小時以後死亡者必需檢查病變,IBD 可造成胚胎矮化、皮下水腫、充出血。肝臟通常腫大,並呈斑點狀出血。若死亡較晚者則肝臟呈綠色腫大,並有壞死。腎亦腫大且斑狀充血、脾亦腫大。

 以雞分離病毒

取 5 隻有感受性的雞與 5 隻經 IBD 免疫過的雞(3~7 週齡)以點眼方式各接種 0.05ml 樣品。接種後 72~80 小時,剖檢華氏囊,病毒感染的華氏囊呈黃色(有時出血)腫大,有明顯的細溝,華氏囊周邊水腫亦常見,華氏囊內有時可見乳酪化物質,華氏囊褶壁有出血點。若有感受的雞呈現此病變,同時免疫過的雞沒有病變則可診斷為 IBD。

B、血清試驗

 凝膠免疫擴散試驗

對於血清中 IBD 特異抗体的檢測或華氏囊中病毒抗原的檢測,膠內免疫擴散反應(agar gel immunodiffusion test, AGID)是有效的血清學試驗。

血清樣品必需感染早期立刻採取,並於 3 週後再採一次,因為本病毒散播快速,故只需採取少量雞隻即可,通常 20 個血清樣品即可。對於華氏囊內抗原之檢測,可取 10 隻急性感染期之華氏囊,切碎研磨後,置於 AGID 盤內孔洞中以陽性血清檢測。

 陽性對照抗原之準備

將 IBD 病毒感染雞之華氏囊做成 10 % 均質液,離心後之上清液用來點眼接種 3~5 週齡有感受性之小雞。接種後 3 天無菌摘取華氏囊,將出血的華氏囊丟棄,其它集合後稱重,加入等量之冷蒸餾水,再加一份等量之 Methylene chloride,在均質機打碎混合後,以 2,000 g 離心 30 分鐘,取上清液小分裝後 -40 ℃ 冷凍保存。

 陽性對照抗血清之準備

將 IBD 病毒感染之華氏囊做成 10 % 均質液,離心後之上清液用來點眼接種 4~5 週齡有感受性之小雞各 0.05 ml,接種後 28 天採血,將血清小分裝置於 -20 ℃ 保存。

 凝膠之準備

取 80 克之氯化鈉(NaCl)與 5 克之石碳酸(phenol)溶於 1 升之蒸餾水,加凝膠(Noble agar)12.5 克煮沸直至完全溶解,20 ml 小分裝至玻璃內,4 ℃ 保存備用。

 試驗步驟

 試驗前 24 小時至 7 天準備平板,將凝膠置於沸水浴溶解。

 將 9 cm 膠質平板(Petri dish)置於水平桌面,1 瓶凝膠 20 ml,倒入一膠質平板(有些實驗室將凝膠置於 25×75 mm 之載玻片上,控孔 3 mm 直徑,距離 6 mm 遠)。

 將平板蓋上,讓凝膠凝固,4 ℃ 保存備用,此可儲存 7 天(如果平板當天就要使用,可將平板打開倒置於 37 ℃ 溫箱乾燥 30 分鐘至 1 小時即可使用)。

 用柱狀切割器與模板切割出三排垂直的孔。

 將切出的凝膠,從孔中去除,必需注意不可將孔壁破壞。

 用吸管分裝待測血清 9 分滿到孔中,或分裝華氏囊乳劑待測抗原 9 分滿到孔中。

 分裝陽性與陰性對照入相關孔中。

 置平板於 22 ℃ 至 37 ℃ 之濕氣箱中感作 48 小時。

 將平板置於暗背景與斜光源之上觀察。

 免疫凝膠擴散試驗之定量

.AGID 試驗亦可用於測量抗體的量,以連續稀釋血清之最高稀釋濃度能產生沈降線者當做力價。此對於測量移行抗體或疫苗抗體非常有用,可決定最佳免疫之時間。

註解:

1. 然反應孔亦有六角型排列樣式可供使用,但仍以直線排列樣式較好。每一待測血清或華氏囊乳劑均應排列在陽性抗體與抗原之旁邊。

2. 每孔為 3 mm 深,6 mm 直徑,3 mm 距離。

3. 病毒中和試驗 (VN)

  VN 試驗需要用到細胞培養,本試驗比 AGID 較費工與費錢,但對偵測抗體則較敏感。敏感度對例行之診斷較不重要,但對疫苗反應之評估卻非常有用。首先,經過稀釋後每 0.05 ml 含有 100 TCID50(50 % 細胞養感染劑量)分別分裝入 96 孔組織培養盤。待測血清先以 56 ℃ 30 分鐘不活化後,以 96 孔盤中稀釋血清連續 2 倍稀釋。置於室溫 30 分鐘後,每孔加入 0.2 ml SPF 雞胚胎纖維芽細胞懸浮液將盤子密封,置於 37 ℃ 培養 4 至 5 天,每日顯微鏡觀察是否有 CPE,力價以 Spearman-karber(1)或 Reed & Muench(7) 方法計算。

 酵素結合免疫吸附試驗

酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)是用於測定 IBD 抗體,測定盤上吸附的抗原必需是純化或半純化的病毒,此需要特別的技術。試劑準備與應用的方法如 Marquardt 等在 1980 年已有報告。商業套組亦已有售。

 結果判別

AGID 雖然沒有 VN 那麼敏感,但亦有相當的敏感性,在未打疫苗且無移行抗體的雞測到陽性,表示被本病毒感染。若在打過疫苗或有移行抗體的雞測到陽性則表示有保護能力。ELISA 比 VN 與 AGID 均為快速,但試劑卻相當貴。VN 與 AGID 之力價一致性相當好,但 VN 較敏感而 AGID 力價較低。ELISA 與 VN 或 ELISA 與 AGID 之力價一致性則變異較大,此與 ELISA 試劑來源關係較大。亦有公式可將 ELISA 力價計算出疫苗免疫之最適當年齡。

參考文獻

American Association of Avian Pathology (1989). Chapter 43. In Laboratory Manual for the lsolation and ldentification of Avian Pathogens. 3rd edition. Kendall / Hunt Publishing, Dubuque, lowa, USA.

Cullen G.A. & Wyeth P.J. (1975). Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. \E04Vet. Rec., 97. 315.

Kouvenhoven B. & Van der Bos J. (1993). Control of very virulent infectious bursal disease (Gumboro disease) in the Netherlands with so called "hot" vaccines. Proceedings of the 42nd Westem Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 37-39.

Lukert P.D. & Saif Y.M. (1991). Infectious bursal disease. In diseases of Poultry, 9th edition. Calnek B.W., ed lowa State University Press, Ames, lowa, USA, 648-663.

Marquardt W.W., Johnson R.B., Odenwald W.F. & Schlotthoken B.A. (1980). An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus. Avian Dis. 24, 375-385.

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