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家禽黴漿菌病
Mycoplasmosis (M. gallisepticum)
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禽類黴漿菌症( Avian mycoplasmosis )

        黴漿菌 (Mycoplasma gallisepticum) 感染禽類,尤其在雞和火雞特別嚴重,會引起急性和慢性的疾病。在感染的情況下,尤其年輕的雞隻會產生急性的呼吸性疾病,在種雞和蛋雞會發生一種慢性型的疾病,並且引起產蛋率的下降。這種感染可以經由感染的蛋垂直傳播而散佈。這個疾病會受到病毒如新城雞瘟和傳染性支氣管炎的二次性感染,或細菌如的感染而增加其嚴重性。MG 能夠經由一種無細胞的培養基成功的分離,但是當這種分離不成功時,可以作雞胚胎或小雞的接種。血清學的試驗也很廣泛使用於診斷,但應該要注意類別診斷,因為其他的黴漿菌也會引起禽類的疾病,如 M. synoviae,M. meleagridis 和M. iowae 等。

1. 病原分離和同定

(一) 病原分離

(1) 培養基

MG 用液體培養基組成份

基礎培養基Pleuropneumonia-like organism broth base without crystal violet\R(Difco) 14.7 gm distilled or deionised water 700 ml 經 121 ℃,15 分鐘高壓蒸氣滅菌,冷卻後追加添加物,調整 pH 至 7.8。

 培養基添加物

pig serum (56 ℃,30 分鐘) 150 ml
25 % (w / v) fresh yeast extract 100 ml
10 % (w / v) glucose solution 10 ml
5 % (w / v) thallous acetate 10 ml
200000 IU / ml penicillin G 5 ml
0.1 % (w / v) phenol red solution 20 ml
經過 0.2 um 濾膜無菌過濾後,添加於基礎培養基內。豬血清和 penicillin
G 可以用馬血清和 Ampicillin 代換。

 無菌測試

製成之培養基取小量置於 37 ℃ 48 小時,檢查有否細菌污染。

 性能測試

混合後的液體培養基,以小量各別接種 M. gallisepticum,M. synoviae,M. meleagridis 和 M. iowae 置於 37 ℃ 培養 7 天後,各菌都必須能夠得到充分發育。

MG 用固體培養基組成份

基礎固體培養基
基礎培養基添加 10 gm 純的瓊膠 (agar)。
基礎固體培養基添加物
培養基添加物除了 phenol red solution 以外的其他成份。
基礎固體培養基添加物先置於 56 ℃ 的溫水浴槽中,待基礎固體培
養基經高壓滅菌後,冷卻至 56 ℃ 再將兩者混合,並分裝於直徑 50
mm 寬的無菌培養皿 7~9 ml,直至冷卻凝固。

無菌測試

取一片製好之固體培養基置於 37 ℃ 48 小時,檢查有否細菌污染。

性能測試

凝固後的固體培養基,以測試使用的 Mycoplasma 菌株分別作接種,培養於含有 5 % CO2 的測試培養箱,必須各菌株都有菌落的發育。

 

(2)

培養材料

檢體要取自活的雞,新鮮的屍體或新鮮的經冰凍的雞屍體,死亡在蛋殼內的雞胚胎或小雞或孵化破殼失敗的幼禽。

活體採材,須用棉棒自鼻後孔分裂處,口咽部,食道,氣管,共泄腔和陰莖等處採取。死亡的病例,須自鼻腔,眼窩下竇,氣管或氣囊採材。滲出液由眼窩下竇及關節腔內吸取。

 

(3)

檢體等處理

實質組織須加液體培養基研磨成懸浮液。

 

(4)

培養基接種量

液體培養基 1.8 ml 接種 0.2 ml 檢體,並連續稀釋至 10-3。各個稀釋濃度各取 0.2 ml,各別接種於固體培養基。

 

(5)

培養及觀察

接種後的液體培養基,置於 37 ℃ 培養觀察至少須經過 20 天以上。每天檢查 pH 值的變化。有明顯 pH 值變化時,應立即用固體培養基進行次培養。甚至培養至 7~10 日時,pH 值仍未改變時亦須進行次培養。接種後的固體培養基,在含有 5 % CO2,37 ℃ 的培養箱培養,經數日後觀查有無菌落的發育。

同時,接種對照已知 mycoplasma 各菌株的培養基,觀察同前。

 

(6) 判定

試驗結果,在檢體接種的固體培養基上有 mycoplasma 菌落發育,以及在接種 Mycoplasma gallisepticum 的固體培養基上有菌落發育,就判定有 mycoplasma 之發育。

(二) 菌落同定

(1)

間接螢光抗體試驗 (Indirect fluorescent antibody test, IFA)

將有菌落發育的平板固體培養基,包括已知的和未知的各切一小片約 1.0×0.5 cm 大小,各置於同一玻片,菌落朝上面。另外再切一片未知的置於另一玻片上。

玻片上的各小切片,各別滴上一滴 Mycoplasma gallisepticum 抗血清,同時
在另一玻片上之未知的單獨小切片則滴上一滴正常的血清,然後在室溫下放置 30 分鐘。

血清作用後的各小切片,分別置入含有 PBS pH 7.2 的標識試管中,移至旋轉混合器上洗 10 分鐘,並重覆再洗一次,最後將各小切片取出放回原來玻片的位置上,並將小切片旁的水份吸乾。

各小切片再各滴上一滴螢光色素連結的血清,之後重覆步驟 (2),(3)。

最後將各小切片放回原來玻片上的位置,利用有螢光投射的顯微鏡檢查。

判定:未知的菌落如同已知的 Mycoplasma gallisepticum 菌落有螢光產生,則判為陽性。

 

(2) 生長抑制試驗 (Growth inhibition test, GIT)

在固體平板培養基上分開滴上三、四滴培養後的各菌液 (25 ml / 滴,104~105 CFU / ml),旋轉平板使菌液散開後,將平板倒蓋置於 37 ℃,20 分鐘。

平板培養基表面乾後,在滴上菌液之各滴的中心點,以含有特異性高之免疫血清的濾紙片(直徑約 6 mm)小心放在表面上。

最後將平板移置於 37 ℃ 培養數天後觀查結果。

判定:在濾紙片周圍若形成一明顯抑制圈者判為陽性。

DNA 檢測:
以商業化的 MG DNA 診斷試劑,利用 PCR 直接在病材抽出物中增幅產物,如果有存在,試劑中的非放射性標識的探針就能診測到。

2. 血清學試驗

(一) 快速血清凝集試驗 (Rapid serumagglutination, RSA)

(1)

將經分離收集的血清,經 56 ℃,30 分鐘處理後,以定量(約 0.02 ml)滴在白色瓷瓦平板上,隨後滴上等量的著色抗原,旋轉瓷瓦平板使其充分混合後 2~3 分鐘判讀。同時進行陽性和陰性血清對照。

 

(2) 判定:雞血清在 2 分鐘內發生凝集團塊判為陽性。

火雞血清在 3 分鐘內發生凝集團塊判為陽性。

(二) 血球凝集抑制試驗 (Haemagglutination inhibition, HI)

多孔之 V 字型孔塑膠平板,由每列之第 1 孔至第 8 孔加入 50ul之 PBS。

取預先經過 5 倍稀釋後的受檢血清 50 ul 加於第 2 孔混合後,再由第 2 孔取 50 ul 至第 3 孔,然後依此操作直至第 8 孔,取 50ull 丟棄。由此可得第 1 孔為血清對照孔,受檢血清經2倍稀釋後成為 10 倍至 640 倍。

陽性血清和陰性血清亦須依上述步驟,並放入於試驗作為對照。
之後,每孔加入界定後之血球凝集抗原(8 個單位)各 50 ul 小心混合,然
後置於室溫一會兒。
另外需要作抗原對照試驗,須要一列 6 個孔,同時另設 2 個孔為血球對照。
在此列的第 2 孔起至第 8 孔先加入 50 ul 之 PBS。之後,第 1 孔和第 2 孔再加入 8 個單位的血球凝集抗原各 50ul,第 2 孔混合後取 50ul 至第 3 孔,然後依此步驟至第 6 孔,取 50ul丟棄,第 7 孔和第 8 孔為血球對照。由此可得抗原對照第 1 孔至第 6 孔各為 4,2,1,1 / 2,1 / 4,1 / 8 單位。

以上各孔最後加入血球凝集用之 0.5 % 紅血球懸浮液 50 ul,充分混合後置於室溫 1 小時後判定。

判定:以紅血球下沉至孔底的速率與紅血球對照孔相同時,所形成的完全抑制凝集之孔為最大稀釋倍數之血清力價。


(三) 酵素結合免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

依照各種商業化之 ELISA 診斷套組說明進行 MG 抗體測定。

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