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第三章 培養基之製作
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作者: 呂榮修;蔡向榮
詳細內容:
3.1. 培養基總論
3.1. 1. 培養基材料
    多種細菌,尤其在醫學上或獸醫學上所應用之細菌,均是異營性菌 (heterotroph),它們利用有機物之分解而獲得熱能做為體內碳素的主要來源。異營性菌中有僅要求最低限度營養,如僅以葡萄糖及數種礦物鹽就能發育者,或另需要加一種以上的胺基酸或嘌呤 (Purine)、嘧啶 (pyrimidine)及各種之維他命,亦有需求如 Haemin 等特殊物質者,依菌種或菌株不同其發育條件並不相同。
    培養基最簡單者,僅用肉抽出物 (Meat extract) 與蛋白凍配製,但可依各種目的,以此再加瓊脂為固形狀態或可加血液、血清及添加其他各種物質,以下對蛋白凍,抽出物類,寒天 ( 瓊脂 ) 及添加物予以說明之。
3.1. 1.1. 蛋白凍 (Pepton)
    蛋白凍乃係各種蛋白以酵素加水分解所成,含有多胜酶 (Polypeptide),二胜肽 (Dipeptide) 及胺基酸 (Amino acid),都是水溶性,再也不會因加熱而凝固,細菌雖不具有蛋白分解酵素 (Protease),但因含有能分解多胜酶之胜肽酶 (Peptidase),所以大部分之細菌能利用蛋白凍為氮素來源,因此蛋白凍通常是人工培養基之重要成分。
  (1) 蛋白凍之種類及其特徵
(a) 酪蛋白凍 (Casein pepton)
    乳酪蛋白 (Milk casein) 因其蛋白最富有營養價值及價格低廉,故最被廣用為蛋白凍之材料,Casein 含有豐富之各種胺基酸,尤其 Tryptophan 之含量甚高亦是最大之特徵,但另一面缺乏含有 Cystine、Methionine 等含硫 (S) 之胺基酸,因此如細菌生化學試驗裏面與 Tryptonphan 所關連之反應,例如 Indol 形成能之之試驗時,以本蛋白凍最為適合,但如做與硫化氫 (H2S),Cystine 所有關連之反應者則不合適,現在市面上所有之酪蛋白凍均為以胰蛋白(Trypsin) 或胰酶(Pancreatin) 消化者。
(b) 獸肉蛋白凍
    獸肉 Pepton 比 Casein Pepton 較缺乏 Tryptophan,但因含有豐富之含硫之胺基酸,因此對 H2S 產生試驗是最合適,且比 Casein Pepton 較適合廣泛之細菌之發育,尤其 Neisseria、Hemophilus、Staphylococcus、Salmonella、Shgella、Pasteurella、Diphtheria、Histoplasma 等之增殖比 Casein Pepton 較佳,此不僅因胺基酸豐富,而且細菌所要求之維他命及其他發育因子之含量亦較多之故。因肉製品成本較貴,故本 Pepton 比 Casein Pepton 較格較高。
獸肉之消化除用胰蛋白酶 (Trypsin) 外,也有用胰酶,胃蛋白酶 (pepsin) 及木瓜酶 (papain) 消化者。
(c) 心肌蛋白凍
    成分與獸肉 Pepton 並無多大差異,但因可能含有發育促進物質較豐富,故比獸肉 Pepton 更能促進細菌之迅速發育及增殖。本品以胰酶消化而成,價錢昂貴。
(d) 明膠凍 (Gelatin pepton)
    Gelatin Pepton 缺乏 Cystine 及 Tryptophan 等胺基酸,且全無含碳水化合物亦為特徵,因此本蛋白不適合於挑剔性 ( 苛求營養 ) 細菌之發育,但仍然足夠應付一般細菌之營養需求,且最適用於碳水化合物分解試驗,並且此類蛋白凍,有不會引起細菌過剩增殖之特點。
(e) 大蛋白凍
    此類蛋白凍最富有植物組織之碳水化合物及維他命,尤其 Thiamin(B1) 最多,能適合包括真菌在內任何細菌之發育,尤其對 Neisseria,Brucella,Clostridia 等營養要求甚嚴之細菌,也能助長其發育,且有中和含在蛋白凍及瓊脂內阻害發育之物質之作用,因此有些難以在一般培養基增殖之細菌,如鏈球菌,肺炎球菌,布氏桿菌頗能在此種蛋白凍添加之培養基中發育。其作用歸因於該蛋白凍中含有極豐富之碳水化物,也正因如此,本蛋白凍不能利用為碳水化合物分解試驗之用。本類蛋白凍雖謂蛋白凍,但實際上比他種蛋白凍營養價值較差,倒不如做為促進發育之用,而常用以代替抽出物物類或多與他種蛋白凍併用。
  (2) 蛋白凍 (Pepton) 成品
(a) Casein Pepton;Trypsin 或胰酶消化之蛋白凍
 
  Trypticase………………………… BBL
  Tryptone, Casiton………………… Difco
  Trypton L42, Trypton L43………… Oxoid
  亞鈴蛋白凍,極東,Micni……… 日本
    以上蛋白凍中,論其名聲或品質最顯赫者,首推為 BBL之Trypticase。此類蛋白凍能中和對菌之發育阻害物質,甚至減低細菌 ( 粗糙型 ) 之變異率,且適用於廣範圍之嗜氧性,厭氧性細菌或真菌類之發育。此種蛋白凍廣被應用為對 Indol 之產生,碳水化合物分解,硝酸鹽還元及其他生化學性狀檢查用培養基之基礎成份。
    Trypton L43 與 Trypton L42,原則上並無差異,但 L43 為 L42 除去鐵質而成,故對破傷風菌之毒素產生作用最佳。Trypton(Difco),亞鈴蛋白凍 ( 日本 ) 均不及 Trypticase,但仍可供為一般細菌培養用。
    Peptonized milk(Difco,BBL,Oxoid)
    脫脂乳經胰蛋白凍 (Trypsin) 或胰酶 (Pancreatin) 消化者,適用乳酸菌之發育,供為氮素源之至佳材料,常用於牛奶及乳製品之細菌檢查。
    Lactalysate(BBL)
    用胰酶消化 Lactalbumin 所成之蛋白凍,含有高度 Tryptophan,可供為 Indol 產生,乳酸菌之培養及促進色素產生之用。
    Milk-Protein Hydrolysate(BBL)
    用胰酶消化 Lactalbumin 而成,與 Casein Pepton 不同者,含有中等度之糖,並多含有 Cystine。
(b) 獸肉 Pepton ; 木瓜酵素 (Papain) 消化之 Pepton
    有 Proteose Pepton,Proteose Pepton No. 2, Proteose Pepton No. 3 (Dirco), Proteose Pepton L46 (Oxoid)。
    Proteose Pepton 供為 Diphtheria 菌之毒素產生之用。梭菌 (Clostridia),葡萄球菌等之外毒素產生,營養要求較嚴之細菌之培養所須要之 Heart infusion, Brain heart infusion 等特殊培養基均含有此 Pepton。
    Proteose Pepton No. 2 供為 Diphtheria 之毒素產生用,Pepton No. 3 乃 No. 2 再加工,供為營養要求較嚴之細菌用。
(c) 獸肉 Pepton ; Pepsin 消化之 Pepton
    Pepsin( 動物所分泌之胃蛋白酵素 ) 所消化與 Papain 所消化之 Proteose Pepton 同樣,有以下製品。
    BBL:Thiotone
    Difco:Thiopepton
    Oxoid:Pepton DL 49
    日水 ( 日本):Proteose Pepton
(d) 心肌胰酶消化 Pepton
    BBL:Myosate
(e) 肝Papain 消化 Pepton
    Oxoid:Liver Digest (Proteolysed liver) L27 因肝含有對營養要求甚高之細菌所適合之 Amino acid 及發育因子,故對原蟲、細菌、真菌及 PPLO 之發育增殖是最佳之 Pepton,依其特殊之目的可供為 Trichomonas 及 Candida 檢出之用。
(f) Gelatin-胰酶消化 Pepton
    BBL:Gelysate
(g) 大豆 Pepton
    BBL:Phytone
    Difco:Soytone
    Oxoid:Soya Pepton L44
    本 Pepton 中以 Phytone 最優,Soytone 較差,
    此 Pepton 可代替抽出物,常與其他之 Pepton 併用,如與 Trypticase 配合製成之 Trypticase Soy Agar 或 Broth(BBL) 比 Heart infusion Agar 或 Broth (Gibco),在世界各國更廣被使用。
(h) 混合 Pepton
    以 Casein Pepton 與獸肉 Pepton 混合者有
    BBL:Polypepton
    Difco:Bacto-Pepton
    Oxoid:Pepton L37
    日本:Polypepton ( 大五 )
    Polypepton (BBL) 係以 Tyrpticase 與 Thiotone 等量混合,對細菌之發育支持力在 Casein Pepton 與獸肉 Pepton 之間,對 Casein Pepton 不適之 VP-MR 試驗用培養基也能使用,日本之大五 Polypepton 為尚可信賴之製品。德國所出品之 Witte-Pepton 也是此類之 Pepton。有一種混合 Pepton 專為營養較嚴之細菌所配製者如:
    Difco : Tryptose, Neopepton
    Oxoid :Tryptose L47
(i) Casein-酸加水分解物有
    Difco : Casamino Acids,
    Techinical : Vitamin Free Casamino Acids,
    BBL : Acidicase
    Oxoid : Casein Hydrolysate (Acid) L41
    含有 Tryptophan 以外尚有些各種平衡胺基酸類存在
3.1. 1.2. 抽出物類
    培養基添加抽出物之目的並不單在於供為營養源,而主要在於添加發育促進物質和 Vitamin。在培養基所加之抽出物類有肉,動物組織抽出物,植物抽出物,酵母抽出物與 Pepton同樣各有多種特徵之製品。
  (1)肉汁 ( 肉羹 )
    分為肉浸出液及肉抽出物
(a) 肉浸出液 (Meat infusion)
    一般使用牛或馬肉浸出液,但依目的也可使用豬、小牛、雞肉。肉水均要自製,其方法較代表性者列述如下。
(i) 冷浸出法
    儘量除去脂肪、腱、筋膜後之肉塊以絞肉機細挫後 500g 之肉加 1,000ml 之水,常常搖動混合置冰箱 24 小時,然後用紗布過濾,附著在紗布所殘留之肉塊用手壓搾其水份,如此所得之液體必要時再用布過濾一次,最後用濾紙過濾後,補足水至全量為 1,000ml。
(ii) 加溫浸出法
    前項細挫之肉 500g 加水 1,000ml,充分搖動後,放在冰室一夜,然後放置 50-60℃ 之水浴槽,時常搖動如此放置數小時,然後在水浴中加熱至 100℃,至 100℃ 煮沸開始至五分鐘後停止然後取出過濾,其要領已如上述。
(iii) 酸性加溫浸出法
    在絞肉器處理之肉 500g 加水 1,000ml 混合物,再加濃鹽酸之 10 倍稀釋液20ml,加以混合,放在冰室一夜之後,加熱至煮開為止,然後過濾,壓榨肉片把水分榨出來後加 10N 之 NaOH 溶液修正 pH 為 8.0-8.2,再加熱至沸騰 2-3 分鐘,最初用布,以後用濾紙過濾,補足水至 1,000,修正 pH 為中性。
    以上所製備之肉浸出液均以 121℃ 15 分滅菌保存。
    上述之方法所製成之肉浸出液難分優劣,但以酸性加溫浸出法所製成者,調製培養基時較不容易沉澱,且能防止細菌之過剩發育。
(b) 肉抽出物 (Meat extract)
    肉抽出物原則上是以肉浸出液濃縮者,與上述之肉浸出液在品質上有所差異,目前外國製品有:
  Difco : Beef extract
  BBL : Beef extract
  Liebig : Fleischextrackt
  Oxoid : Lemco meat extract
  日本:亞鈴,Micni,極東
    以上製品中與肉浸出液同樣可以使用者只有 Liebig 及 Oxoid 而已,兩者均以牛肉與冷浸出法在低溫濃縮者,實際上其 1% 溶液與自製之肉浸出液品質並無差異。
    其他肉抽出物均以加熱濃縮者,肉浸出液長時間加熱時將會失其維他命之有益物質,且各種成份會變質,因而抑制細菌之發育,使用時 Liebig 肉抽出物 1,000ml 加 10g,Difco 及 BBL 之 1,000 加 3~5g,超此量時反而不佳,此量比起肉浸出液 1,000ml 裡面少含維他命及發育因子,且比肉浸出液之 Glycogen 之含量少,因此菌之增殖不及肉浸出液之好,但因 Glycogen 之含量少,故不易引起菌之變異為粗糙型亦為優點,因此菌株保存時肉抽出物比肉浸出液較適合,如需要與肉浸出液同樣之菌增殖者,可增加葡萄糖及磷酸鹽 (0.2% 左右 ) 於抽出物內。
  (2)心肌浸出液 (Heart infusion)
    心肌尤其用牛心肌之浸出液,比肉浸出液更加含有豐富之菌發育物質,並且能除去 Pepton 或 Agar 中有害發育之物質,因此依此種製成之培養基比肉浸出液所製成之培養基,可供廣範圍之細菌增殖,所謂 Heart infusion 者,以心肌浸出液比肉浸出液所含之 Glycogen 較少,因此並不引起菌之過剩發育且能防止變異為粗糙型,故能保持茵之毒力及毒性。
(a) 心肌浸出液之製法
    除去脂肪、腱、血管之心肌以絞肉機細挫,每 500g 加水 1,000ml,時常加以搖動,放在冰室 24 小時,然後在 50℃ 水浴中加溫數小時,以後提昇溫度至沸點,先用布後再用濾紙過濾。
(b) 肝浸出液
    肝浸出液對各種細菌之發育促進效果頗為顯著,尤其對 Brucella,赤痢菌及 Ameba 之培養極佳,且多應用於厭氣性細菌之培養。在肝中所含之多量 Glycogen,維他命,胺基酸 ( 特別是含硫之胺基酸 ) 為發育促進作用之原因。
    肝浸出液有 Oxoid 之製品,又 Difco 及 Oxoid 有肝之乾燥粉末,其中又以 Oxoid 之品質較佳。
    其他臟器浸出液有 Hermann 之牛睪丸抽出物可供為 Salmonella 之分離用,又 Lindemann 之胎盤抽出物可供一般細菌培養之用。
(c) 酵母抽出物 (Yeast extract)
    酵母有各種之維他命、礦物質、胺基酸等含量極豐富,其粉末廣被用為營養劑,又其浸出液被利用為培養基相當有效功效。
    酵母抽出物有 Difco、Oxoid、BBL、NBC、日本之大五才  等製品。酵母抽出物之粉末製品者加 0.5%。
(d) 麥芽抽出物 (Malt extract)
    其主要成份係糖及麥芽糖及少量之蛋白,為真菌用培養基所常用。其乾燥粉末有 Difco、BBL 及 Oxoid 等製品。
(e) 馬鈴薯抽出物 (Potato extract)
    碳水化合物含量豐富,並能緩和 Pepton 及瓊脂中之發育阻害物質,其他尚有特殊蛋白及維他命,為 Bordet-Gengou 培養基之材料及供真菌之培養之用。有 BBL 之成品。
(f) Tomato juice
    對乳酸有顯著發育促進作用。
3.1. 1.3. 瓊脂 ( 寒天 )Agar
    Agar 係在日本及印度之海草所抽出之膠狀之物質,有各種之碳水化合物所混合者,對細菌之營養並無關連,一般有粉末、薄片、粒狀、棒狀等種類成品,其品質依粘度、透明度 ( 乳白色透明、乳白色愈少者質愈良 ) 瓊脂之製品,Jelly強度,凝水量 ( 愈少者佳品 ),純度而有不同。
    比較名牌者:
(1) Bacto agar (Difco)
  除去瓊脂中之浸出性物,色素,及鹽類之精製物,固形培養基使用 1~2%,對運動性檢查,厭氧性培養之半流動培養基使用 0.05~0.5%。
(2) Special agar Noble (Difco)
  依 Noble之方法除去不純物之瓊脂,用於大腸菌群之菌數計算用培養基。
(3) Agar purified (Difco)
  依特殊之方法 ( 脫脂及水洗 ) 所精製之瓊脂,供為對菌營養需求研究用或組織培養用重層瓊脂 (Overlay agar)。
(4) New Zealand agar (Oxoid)
  與 Bacto agar 相同。
(5) Oxoid agar No.3 (Oxoid)
  Jelly 強度特強,比 New Zealand agar 更精製,以 0.8~1.0% 使用,為固形培養基,透明度良好。
(6) Ionagar No.2 (Oxoid)
  為 Ion 交換樹脂除去不純物,品質特佳與 Difco 之 Agar Purified 不相上下,但比起其它 Jelly 強度要高,一般用 0.8~1.0%,係最上等之製品。
3.1. 1.4. 添加物
    一般對菌發育所添加者有血清、腹水、血液。對某種細菌抑制發育而使培養基有所選擇性者,如加 Brillant green、Crystal violet、Gentian violet、Tellurate、Sodium azide,膽汁酸鹽等均是。
    加血液、血清、腹水於培養基,其作用有下列數種:
a) 除去培養基有害成分作用。
b) 促進發育。
c) 營養效果。
d) 菌之鑑別效果。
(1) 血液
  牛、馬、家兔、山羊、綿羊之無菌脫纖維素血液。
  脫纖維素血液之製法:
  取直徑 0.5cm 大之小玻璃珠 20~30 個置於燒瓶內或適當之容器,經滅菌後,無菌採血後,立刻振盪五分鐘,使其纖維素變成凝塊分離為止,如置冰室可用一週。
(2) 血清
  如要大量之血清以馬血清為最方便,以滅菌圓筒無菌採取血液,俟其凝固後,放入厚製圓形金屬製 ( 如鉛 ) 之錘壓在上面。如山羊、兔可以頸靜脈採血或心穿刺採血注入滅菌大試管使其斜面凝固,凝固後放置 37℃ 恆溫箱內 30 分鐘至 1 小時,用滅菌玻璃棒將血塊剝離試管壁,然後放置冰室一夜,次日分離血清。
3.1. 2. 培養基之 pH 測定與修正
    一般菌之發育要求在 pH7.0 左右為最適,因此大部份之培養基之 pH 亦在 pH7.0 左右,但依培養目的,培養基之不同而有各種 pH 之培養基。
    pH 之測定有靠 pH 測定器法及使用指示藥的比色測定法。在配製培養基時,以比色測定法為多,此係肉眼之主觀判定,難免比 pH 測定器所表示之數值之正確性差異較大,但實際上精密之 pH 測定器在使用時亦難免有若干程度之差異 (0.1 左右 ),在經驗上 pH 測定器比比色於培養基上之 pH 低 0.2,更重要者在書本上或文獻上所記載之培養基之 pH 均以比色法所決定,因此培養基之 pH 主要係以比色法來測定。
1. pH 試驗紙法
  以濾紙浸透指示藥後乾燥之製品,在試驗紙上滴下培養基,其色調與試驗紙上各 pH 值所表示之標示變色表對比,所一致之顏色而取決其 pH 值,日本有東洋濾紙會社出品。在日常作業上大部份用這方法,但因試驗紙之不同批號及陳舊等而有差異,因此如要嚴格修正 pH 時要用比色標準液之比色法。
2. 比色標準液之方法
  各差 pH0.2 之一定量緩衝液放在同一口徑之試驗管,並添加一定量之指示藥,製成一序列變色之各階段標準液,一般稱為標準液保存列管,Clark & Lubs 為較常用之標準液。標準液列管可以自製也可以買成品。
  其方法如下:
準備: 各種標準液列 (pH0.2 階段 )、各種標示藥、比色器、試驗管 ( 與標準液列相同大小 )。
做法:
(a) 選適合要製備培養基之目的之標準液列。
(b) 取與標準液約同量培養基液放入試驗管 1 支,其中 1 支加與標準液相同之指示藥 1-2 滴,同樣另設 1 支僅加精製水為對照。
(c) 比色如圖 1. 培養基稀釋液與標準液。
  加指示藥之培養基稀釋液及精製水各前後放置向窗戶透視。
(d) 被檢液之顏色與標準液相符時,在標記上標準液之數值乃被檢液之 pH 數值。




1. 培養基稀釋液
2. 標準液
3. 精製水
4. 培養基稀釋液加指示藥

 

     圖 1. 依標準液之比色法
  注意:標準液列應避免日光,在冷暗室保存。
3.2. 培養基各論
3.2. 1. 乾燥培養基之使用法
    目前除了特殊因素之外,大多數之細菌檢查用培養基以乾燥粉末培養基 ( 成品 ) 為主,因此不必準備肉汁自製培養基。
    茲介紹各主要培養基製造廠如下。
  Baltimore Biolgical Labolatory Inc (BBL):美國
  Difco Laboratories Inc. (Difco):美國
  Gibco Laboratories (Gibco):美國
  Oxoid Division of Oxo Ltd (Oxoid):英國
  日本榮養化學株式會社 ( 榮研 ):日本
  日水製藥株式會社 ( 日水 ):日本
    溶解使用法:
    要使用乾燥培養基之前,先看使用手冊或目錄依菌或用途之不同選用培養基,使用前應充分瞭解該培養基之使用法,組成特徵及概略之理論,啟封後之培養基容易潮濕,因此必須密封或收入玻璃乾燥器 ( 內放矽膠乾燥劑 ) 內保存,秤量時亦應操作敏捷及時封蓋以免吸濕,必要量之培養基最少在使用前一日以內製備,並儘量使用新配製培養基為佳。
    調配時,以乾燥培養基量之 1.5 至 2 倍容量之燒瓶內先加入精製水 ( 蒸餾水或通過 Ion 交換劑所精製之水 ) 所要量,然後不要使成塊狀加入培養基,以錫鉑輕輕蓋上,在火焰上放置石棉金屬網,其上面放燒瓶,注意不要燒焦,將之攪拌至完全溶解為止。乾燥培養基如果完全溶解時開始起泡,附著在玻璃壁之瓊脂粒子也將會消失,在開始發泡時立即取下燒瓶,以免溢出管口致灼傷手。
    當然在溫浴中也可以溶解,或溶解與高溫滅菌同時進行均勻,但需延長約 5 分鐘之時間。
3.2. 2. 培養一般細菌為目的之培養基
  1. 動物肉質為基礎材料者:
(1) 肉汁肉羹
肉汁 ( 由肉 500 克所浸出液 ) 1,000 ml
Pepton (Bacto. Polypepton BBL, Polypepton 大五 ) 10 g
NaCL 5 g
  PH7.0-76
(2) 肉汁瓊脂
肉汁肉羹 1,000 ml
瓊  脂 ( 粉末 ) 15 g
  PH7.0-76
(3) Nutrient Broth No. 2 (Oxoid)
 
目的: 除了一般細菌培養之外,對嗜氧菌之無菌試驗用培養基及葡萄球菌之血漿凝固試驗為最佳之培養基。
(4) Nutrient Agar No. 2 (Oxoid)
 
目的: 對菌少有發育阻止作用,與 Heart infusion agar 同樣對挑剔性菌之增殖亦頗適用,也能做 Blood agar 之基礎培養基。
(5) Heart infusion media
  Heart infusion broth………Difco、Gibco、BBL、Oxoid、榮研、日水
  Heart infusion agar ………Difco、Gibco、BBL、Oxoid、榮研、日水
 
(a) 心肌浸出液比肉汁對中和瓊脂中對細菌之發育阻止作用較強,且有某種維他命作用,因此能對幾種細菌有促進發育之效果。
(b) 心肌浸出液比肉汁,其中 Glycogen 及其他碳水化合物之含量較少。一般 Gram 陰性菌如培養基中碳水化合物之含量過多,會促進細菌之粗糙化,因此 Heart infusion media 比肉汁培養基,能保持較長之平滑型。目前基於上述理由均代替肉汁培養基而使用,本培養基如血液,更能促進苛求營養細菌之發育。
(6) 肉抽出物培養基
肉抽出物 5 g
pepton 15 g
NaCl 3 g
精製水 1000 ml
pH7.4
  乾燥培養基
a) Nutrient Broth (Difco, BBL, Gibco)
b) Nutrient Agar (Difco, BBL, Gibco)
c) Nutrient Agar 1.5% (Difco, BBL, Gibco)
d) 乾燥肉羹 (日本 )
e) 普通瓊脂 ( 榮研 )
f) Nutrient Broth (Oxoid)
  加肉抽出物及酵母抽出物與 Difco, BBL, Gibco 不同。
g) Nutrient Agar (Oxoid)
(7) 胎盤抽出物培養基
胎盤抽出物 1,000 ml
pepton 10 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
pH7.2-7.5
(8) Digest broth 及 Digest agar
  乾燥培養基有 Difco 之變化
a) Bacto-Trypic Digest Broth……Difco
b) Bacto-Trypic Digest Agar……Difco
特徵:增殖支持力頗佳,凌駕 Heart infusion media 之上。
  2.利用植物性 Pepton 及抽出物之培養基:
    乾燥培養基
    Trypticase Soy Agar …………………BBL
    Trypticase Soy Broth …………………BBL
3.2. 3. 特殊培養基之製造法與乾燥合成培養基
3.2. 3.1. 腸內細菌分離用培養基
  (1) 孔雀綠瓊脂 (Malachite Green Agar)
 
  鑑別法: Salmonella 呈黑色菌落
  其他腸內細菌不發育或被阻止發育
  Proteus 不遊走
  Typhus, Paratyphus, Salmonella Pullorum 發育不佳。
  目 的: 引起食物中毒之 Salmonella 分離用。
  乾燥培養基: 榮研
  (2) NAC 寒天培地 (Nalidixic Acid Cetrimide)
 
  目的: 綠膿菌之分離用
  特徵: 本培養基加 Nalidixic acid 及 Cetrimide 能抑制綠膿菌以外之細菌。
  乾燥培養基: 榮研
  (3) DHL Agar
 
  特徵: 培地-->淡赤色,病原腸內細菌菌落呈無色而中心部呈淡黑色,大腸菌菌落-->赤色,大腸菌與病原腸內細菌顏色之差異較明暸,雞白痢菌也能發育。
  乾燥培養基: 榮研、日水。
  (4) DCLS Agar
 
  特徵: 培地-->淡赤色、病原腸內細菌-->無色,大腸菌菌落-->赤色,強烈抑制大腸菌之發育,如發育也呈赤色而易鑑別。
  乾燥培養基: 榮研
  (5) LD Agar (Lysine Deoxycholate Agar)
 
  目的: 腸內病原菌 Salmonella 及 Shigella 之分離用。
  特徵: 培養基-->褐橙色,病原腸內細菌菌落-->無色,大腸菌呈赤色。
  赤色菌落: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella Citrobacter, proteus, serratia.
  透明菌落: Shigella, Providencia, Salmonella※
  透明菌落(中心部黑色):Sallmonella , Arizona, Asakusa
  *H2S 非產生之Sallmonella paratyphi A; S. cholerae suis等。
  乾燥培養基: 榮研
  (6) SS Agar
 
  目的: Shigella 及 Salmonella 之分離用,
  特徵: 培地-->黃赤色,病原腸內細菌之菌落-->無色,大腸菌菌落-->赤色,可抑制大腸菌病原腸內細菌發育某種大腸菌發育形成無色菌落。
  乾燥培養基: BBL. Difco、榮研、極東、日水、Oxoid。
  (7) SS -SB Agar
 
  特徵: 培地-->赤紫色,病原腸內細菌菌落-->無色,大腸菌菌落-->赤紫色,對大腸菌之抑制此 DHL 較強,在 SS 被抑制之病原腸內細菌也發育較佳。
  乾燥培養基: 榮研
  (8) Selenite Broth
 
  目的: Salmonella 及 Shigella 菌之增菌用
  特徵: 對食品中,飼料中,糞便,臟器或其他檢體中 Salmonella 之最佳增殖培養基,但培養不能超過 18 小時,因暫被抑制之大腸菌也會逐漸開始增殖。
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、日水、Oxoid。
  (9) MacConkey Agar
 
  特徵: 乳糖發酵腸內菌形成紅色菌落,不發酵糖之腸內細菌則否,如 Salmonella, Proteus, Alcaligene faecalis 所形成為無色菌落。
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、日水、Oxoid。
3.2. 3.2. 水、食品中細菌(大腸菌群)之檢查用培養基
  (1) Descoxycholate Agar (DSA)
 
  目的: 除對 Salmonella 及大腸菌分離用外,對乳製品,醱酵乳、乳酸菌飲料中之大腸菌及變形菌之檢查或計算菌數,以及水及污水道中大腸菌檢查之用。
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、極東、日水、Oxoid。
  特徵: 毋需滅菌,操作簡單,尤其對生乳,能破壞生乳獨有之細菌發育抑制物質,故大腸菌群之檢出率頗高,檢查材料要混合稀釋培養時,平皿之底面以本培地或 agar 溶液做薄層,然後混合稀釋培養即防止檢出菌之集合發育如擴散菌落。
  (2) BTB Agar (Drigalski 改善培養基 )
 
  目的: 病原細菌之分離培養,大腸菌群之檢查。
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、日水。
  特徵: 病原腸內細菌群呈青色半透明菌落,大腸菌群呈黃色大菌落,培養基也黃變。
  (3) EMB (Eosin methylene Blue) Medium
 
  目的: 飲水,食物,及臨床病材之大腸菌群檢查及大腸菌與 Aerobactor aerogenes 之鑑別用。
  乾燥培養基: Difco、榮研、日水、極東。
  特徵: 抑制 Gram 陽性球菌之發育
大腸菌與 Klebsiella 稍能以菌落之形狀判別,即大腸菌著色力強,菌落呈金屬性光澤,Klebsiella 呈灰黑色。
  (4) EC培養基
 
  目的: 對水、牛乳、魚類、糞便所引起污染度之檢查。
  乾燥培養基: 日水、榮研。
  特徵: 抑制腸球菌,37℃ 培養能產生氣體 (gas) 即大腸菌群陽性,又 45℃ 培養能產生氣體即能證明 E. coli 之存在。
  (5) 乳糖肉湯
 
  目的: 食品及水中大腸菌群之檢查及生菌數計算之用。
  乾燥培養基: 榮研、日水。
  特徵: 大腸菌群發育時能分解乳糖形成酸,故 Medium 變黃色,有無氣體 (gas) 產生,可在 37℃ 24-28 小時培養,看醱酵管之變化。
  (6) BGLB(Brilliant green lactose bile medium)
 
  目的: 水及食品 ( 尤其是牛乳 ) 中之大腸菌群檢查及確定試驗用。
  乾燥培養基: 榮研、日水。
  特徵: 抑制 Gram 陽性菌,僅大腸菌群 (Coli-Aerogenes group) 能選擇性之優異增殖,大腸菌群就是指 E. coli., Citrobacter freundii, Klebsiella(Aerogenes and Cloaka), Erwinia, Carotovola 等菌種在內。
3.2. 3.3. 嗜血桿菌 (Hemophilus) 之培養基
  (1) Hemophilus paragallinarum 分離用
    (a) 醱母抽出液加雞血清瓊脂
  雞肉水 200 ml
  Casamino acid 5 g
  Polypepton S 5 g
  NaCl 5 g
  Agar 15 g
  精製水 800 ml
  pH7.4(1N NaOH 修正 )    
  滅菌 120℃ 15分    
  使用時再溶解冷卻至 50-55℃,以無菌技術添加生酵母抽出物 5%及雞血清 10%。
    (b) 雞血液瓊脂 (Pelaplane 之變法 )
  雞肉水 1,000 ml
  Polypepton S 5 g
  NaCl 5 g
  Agar 15 g
  雞血液 10%  pH 7.4    
    (c) 蛋黃Medium (Cunninghan Stuart 之變法 )
  雞肉水 1,000 ml
  Polypepton S 5 g
  NaCl 5 g
  Glucose 5 g
  Phenol red 0.02 g
  Agar 15 g
 
PH 7.1
   
  55℃ 時加新鮮無菌蛋黃 10 粒 ( 約 180ml),分裝 5ml 做斜面。    
    (d) DPNH 加葡萄糖 Tryptose agar (Page 之變法 )
  雞肉水 1,000 ml
  Polypepton 5 g
  NaCl 5 g
  Agar 15 g
  精製水 500 ml
 
PH 7.2
   
  滅菌後加 0.1% Glucose,濾過滅菌之 DPN 2.5-5.5 g/ml。    
  (2) Hemophilus 增菌培養基
    (a) 生酵母抽出物加血清肉湯
  雞肉水 200 ml
  Casamino acid 5 g
  NaCl 5 g
  精製水 800 ml
       
 
PH 7.4 滅菌 120℃ 15分
   
  滅菌冷卻後加雞血清及生酵母抽出液各 1~3%。
    (b) 加藤之半合成培養基
  Polypepton S 5 g
  Casamino acid 1 g
  Sodium glutamate 5 g
  NaCl 5 g
  KH2PO4 5 g
  精製水 1,000 ml
 
滅菌 120℃ 15分
   
  冷卻後加 Glucose 0.1%、生酵母抽出液 1%,雞血清 0.5%  
    (c) page 之變法培養基
  雞肉水 1,000 ml
  Trypton 5 g
  NaCl 15 g
 
PH 7.2 滅菌 120℃ 15分
   
  滅菌後加 Glucose 0.1%,雞血清 0.1%,DPN 2.2-5 μg/ml .    
  DPN(Diphosphopyridine nucleotide)    
3.2. 3.4. Bordetella 之培養基
  (1) Cohen-Whoeler's Broth
 
  目的: 疫苖製造,純粹培養用
Casamino acid (Technicak, Difco) 10 g
Yeast extract 10 g
Magnesium chloride 0.4 g
NaCl 2.5 g
可溶性澱粉 1.5 g
1% Calcium chloride 水溶液 1.0 ml
0.5% 硫酸第一鐵水溶液 2.0 ml
0.05% 硫酸銅水溶液 1.0 ml
K2HPO4 0.5 gl
1% Cystine 水溶液 2.5 ml
精製水 1,000 ml
pH 7.2,120℃ 20 分滅菌
  (2) 5% 血液加 Eugon agar
  (3) Brodet-Gengou agar
 
  目的: 分離,繼代用
馬鈴薯浸出液 250 ml
Protose-pepton No.3 10 g
Agar 18 g
Glycerin 10 ml
精製水 750 ml
pH 7.0,115℃ 10 分滅菌
  馬鈴薯浸出液之製備
馬鈴薯 250 g
Nacl 9 g
精製水 500 ml
  除去馬鈴薯之表皮,切薄後加 NaCl 及水 100℃ 加熱至變成小片,用布過濾,精水至全量為 500ml,修正 pH 7.0,馬鈴薯愈新鮮愈佳,出芽者不能使用。
    以上基礎培養基再加馬、人、綿羊、兔等血液。
  (4) Mac Conkey agar 加 1% dextrose
 
  目的: 由豬鼻腔分離 B.bronchisepfica 之選擇性培養基,在 48 小時內形成中央硬度之小而灰褐色產生菌落。
3.2. 3.5. 巴氏桿菌 (Pasteurella) 之培養基
  (1) BYP agar (村田、波岡 1960)
 
 
Yeast extract 5 g
Proteose Pepton No. 3 (Difco) 10 g
Glucose 3 g
Sucrose 3 g
NaCl 4 g
亞硫酸鈉 0.1 g
L-Cystein 0.5 g
KH2PO4 4 g
Agar 15 g
精製水 1,000 ml
Fildes 之消化血液 50 ml
pH 7.2
   
Fildes 之消化管液省略也發育甚佳。    
  目的: 萊膜形成,抗原分析,菌之大量增殖之用。
  (2) Trypticase soy agar                  1,000 ml
 
 
Fildes 之 pepsin 消化物                   50 ml
  目的: 螢光集落之觀察及菌之分離之用
  (3) 液體培養基
    Trypticase soy broth
    Brain heart Infusion broth
3.2. 3.6. 葡萄球菌之培養基
  (1) 葡萄球菌培養 No. 110(Chapman 1946)
 
  目的: 萄萄球菌之選擇及分離,色素產生能力,Mannitol 分解,Gelatin 液化能力之判定。
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、日水、Oxoid。
  特徵: 色素產生鮮明,能同時試驗 Gelatin ( 明膠 ) 液化能力及 Mannitol 分解之判定,色素產生在 30℃ 比 37℃ 較為適當,其他反應需要培養 48 小時然後滴下 0.4% 之 Bromthymol blue 於各菌落,如 Mannitol 分解時呈全黃色,Gelatin 液化試驗可以滴下硫酸銨之飽和水溶液於菌落,陽性者不混濁呈透明。
  (2) Mannitol Salt Agar( 甘露糖鹽瓊脂 )
 
  目的: 病原性葡萄球菌之選擇分離
  乾燥培養基: BBL、Difco、榮研、日水、Oxoid。
  特徵: 抑制其他細菌,病原性葡萄球菌菌落周圍有黃色暈圈 (halo)。
  (3) Phenyl Ethyl-Alcohol Agar (PEA agar)
 
  目的: Gram 陽性球菌之選擇培養基。
  乾燥培養基: BBL、Difco、日水。
  特徵: 抑制 Gram 陰性菌之發育,因此能選擇 Gram 陽性菌之發育,應用甚廣。
3.2. 3.7. 鏈球菌及腸球菌之培養基
  (1) Pike's Medium
 
  目的: 溶血性鏈球菌之選擇性增殖培養基。
  乾燥培養基: Difco
  加脫纖維血液 ( 馬、牛、兔、綿羊 )
  特徵: 抑制咽喉頭常在菌之發育,能優勢分離溶血性鏈球菌。
  (2) Blood Agar
    基礎培養基
  1. Heart infusion agar
2. Casein soy 混合 pepton agar
3. Tryptose blood agar base (Difco)
4. Tryptose phosphate agar (Difco)
5. Blood Agar Base (Difco、BBL、Oxoid)
  以選擇其一加人、兔、綿羊脫纖維血液。
  (3) Mitis Salivarius Agar
 
  目的: 檢出α及γ型鏈球菌,尤其是 Streptococcus 及 S. salivarius。
  乾燥培養基: Difco,BBL
  特徵: 腸球菌-直徑 2~3cm 稍為隆起,光澤暗青色。
  S. salivarius -直徑 1~5cm 之樹枝樣菌落。
  S. mitis -24 小時後直徑 0.2cm 青色菌落。
  大腸菌-發育時呈褐色。
  豬丹毒菌-能供分離用,呈直徑 5~10mm 之無色粘液狀 (mucoid) 菌落。
  (4) Todd-Hewitt Broth
 
  目的: 1. 鏈球菌之增殖用,2. 溶血性鏈球菌之沉降反應用抗原製造用,3. 溶血毒素產生用,4. 加 5% 血液可供為菌株保存用。
  乾燥培養基: Difco
  特徵: 製造沉降反應用之酸性加熱抗原時最常使用,其他細菌之增殖亦常用。
  組成:
Beef heart infusion 500 g
Neopepton 20 g
NaCl 2 g
NaHCO3 2 g
Na2HPO4 0.4 g
葡萄糖 2 g
pH 7.8
3.2. 3.8. Corynebacterium 用之培養基
 
(1) 形態檢查用
  有 Loeffler 之血清培養基
    把 3 份的牛、豬或馬血清加入1份的 Glucose infusion broth (1% Glucose ) 分裝於試管,放置斜面,以後連續 3 日置於 75~85℃ 2 小時蒸氣滅菌,或置於 Horizontal actoclave 滅菌器內 ( 置斜面 ) 封閉,勿讓空氣流出,15 磅壓力滅菌 15 分鐘,培養基會凝固,然後空氣慢慢洩出,仍保留 15 磅壓力。
(2) 增菌之分離用
(a) Tensdale Tellurite Medium
 
  特徵: Diphteria 菌呈圓滑,灰黑色隆起光澤,Gravis 型及 Mitis 型在 24 小時,在菌落圍繞有暗濃褐色之輪。
  其他 Corynebacterium 呈灰色或褐色輪。
  乾燥培養基有 基礎培養基 Difco (Bacto-Tinsdale base )
  添加液 Difco (Bacto-Tinsdale Enrichment)
(b) 葡萄糖 Tellurite-血清瓊脂培養基。
 
  乾燥培養基有 基礎培養基 Difco (Bacto-Dextrose Proteose NO.3 agar)
        BBL (Trypticase tellurite agar base )
Diphtheria 呈灰色,中心部稍呈暗色隆起。
(c) HB Dipthteria agar ( 榮研 )
  說明:Diphtheria 菌之分離用。
(d) 鑑別用 ( 碳水化合物分解試驗用培養基 )
  DSS agar ( 日水 )
  Dextrose-Sucorse- Starch Agar
 
  特徵: 白糖分解全部呈青變。
  白糖不分解,僅分解葡萄糖時,高層青變。
  兩者不分解均不變色。
  特徵: A.培養基無變化:Diphtheria 以外之 Corynebacterium 。
  B.高層部青變,斜面無變化 C. ulcerans, C. renale。
  C.培養基全變青色:C. xerosis ,C. murium, 葡萄球菌。
3.2. 3.9. 豬丹毒及 Listeria 用之培養基
 
(1) 選擇培養基:
  Neomycine 、Kanamycine、Blood agar medium (Fuzi 1963)。
組成: 基礎培養基 Tryptose agar medium
        Casein soy 混合 Pepton agar medium
        YCC agar 等。
  加熱溶解 121℃ 15 分鐘高壓滅菌。
  Neomycine ,100mg/ml 水溶液 ( 凍結保存 )。
  Kanamycine ,100mg/ml 水溶液 ( 凍結保存 )。
  基礎培養基溶解後保持約 50℃,以 100ml 加 Neomycin 溶液 0.1ml ( 培養基 1ml 100μg),Kanamycin 溶液 0.4ml (400μg/ml),及血液 5ml。
特徵: Neomycine,能阻止 Gram 陰性菌,Kanamycin 阻止豬丹毒及 Listeria 菌以外之 Gram 陽性菌,由扁桃、膽汁、腸內容能分離兩菌。
(2) 增菌培養基
  Phenol 加 Broth (dale 1940)
組成:
普通 Broth 1,000 ml
5% Phenol 水溶液 50 ml
pH 7.2~7.4
特徵: 丹毒菌比其他細菌對 Phenol 扺抗性稍強,扁桃材料,土壤材料利用此培養基增菌後接種於小白鼠分離本菌。
(3) 其他培養基
a. YCC agar
  YCC broth
b. Tryptose agar
c. Casein soy pepton agar 及 broth
d. Blood abar ( 為 a.b.c 擇其一為基礎培地然後加 Blood)
  Listeria 之分離可加 postassium tellurite 1:5000 以控制雜菌,丹毒菌可加 sodium azide 1:1000 以抑制雜菌。
(4) Azide Agar
 
基礎培養法:
Trypticase soy agar ,Brain heart infusion agar 或Engon agar 等 1,000 ml
Crystal violet 0.01 g
Sodium azide 0.5 g
馬或牛血清 50 ml
目   的: 豬丹毒菌之分離用。
3.2. 3.10. 乳酸菌檢查及乳酸菌培養基
 
(1) Tomato Juice Agar
 
Tomato juice (Solid from 400ml) 20 g
Pepton 10 g
Peptonized milk 10 g
Agar 11-15 g
精製水 1,000 ml
pH 6.1
  乾燥培養基:Difco、BBL、Oxoid、榮研、極東。
  目的:乳酸桿菌、乳酸球菌之培養,菌數測定。
(2) Briggs Tomato Juice Agar
  Tomato juice agar 所改良者含有 Tween 80
  乳酸桿菌之培養基,也能支持乳酸球菌之發育。
  乾燥培養基:日水。
(3) Rogosa Agar (Rogosa 1951)
  目的:乳酸桿菌之分離測定。
  乾燥培養基:BBL、Difco、Oxiod。
(4) Lactic Agar (Elliker 1956)
  目的:乳酸菌檢出測定用培養基。
     乳酸桿菌、乳酸球菌均能發育。
  乾燥培養基:極東。
(5) Tomato Juice-Yeast Extract Calcium Carbonate Medium
 
Tomato juice 300 ml
Yeast oxtract 5 g
Dextrose 0.5 g
KH2PO4 0.5 g
K2HPO4 0.5 g
Bromocresol purple (16% Alcohol) 2 ml
Agar 15 g
精製水 1,000 ml
pH 7.0
 
目的: 乳酸菌鑑別培養基,球菌桿菌均能黃變色且形成 CaCO3 溶解環之菌落。 乳酸菌以外者無變化,或形成紫色之菌落。
(6) B. C. P. plate count agar
  目的:酸酵乳、乳菌飲料中之乳酸菌檢出測定用培養基。
  乾燥培養基:榮研、極東、日水。
3.2. 3.11. Clostridium 用培養基
 
(1) 增菌及液體培養用
 
a. Reinforced Clostridial Medium
  目的:食品中之 Clostricium 之菌數計算及培養用,臨床材料之細菌檢查用。
  乾燥培養基:Oxoid
 
特徵: 不必使用厭氣性培養也能促進 Clostridium 之發育,且發育甚佳,對食品中微量之 Clostridium 也能檢出為最佳之培養基,對正常消化器內細菌叢之檢查 Clostridium 以外厭氣性菌之分離均佳。
  缺點:沒有選擇性。
 
b. 小牛肉浸出液 Broth (Veal Infusion Broth)
  目的:厭氧菌 Medium 之基礎培養基。
  乾燥培養基:Difco、BBL。
  特徵:對 Clostridium 或以外之營養要求嚴格之細菌如鏈球菌之培養用。
 
c. Cooked Meat Medium
  目的:增菌、厭氧性菌之培養,菌株保存。
 
乾燥培養基: BBL、Oxoid、榮研、Difco、日水,其中 BBL及 Oxoid 之成品較穩定。
 
特徵: 菌株保存,厭氣菌能保存十年,Gram 陰性之腸內細菌 (Shigella ,Salmonella,Proteus, E. coli ) 約5年,Staphylococcus,Corynebacterium 能保存 6 個月以上,保存時密栓放置室溫。
 
d. TGC Medium (Thioglycollate Medium)
  目的:無菌試驗用
 
乾燥培養基: BBL、日水、榮研、Difco,大五
 
特徵: 好氧性、厭氧性菌均能發育,需氧性在上層,厭氧菌在下層,通性菌全部混濁,又微好氧性在表層稍下部發育。本培養基供無菌試驗時分注量與試驗管規格均有規定。分注量 15ml 時要用 2×15cm,40ml 時用 2.5×20cm 之試管,又本培養基滅菌後即時冷卻至 25℃,保存在 20~30℃ 暗處,不可保存冰箱。
(2) 分離用固形培養基
 
a. Zeissler 之 Blood agar
  組成:基礎培養基
 
   普通瓊脂 1,000 ml (改用肝浸出液瓊脂或肝犢牛浸出液瓊脂較佳)
   葡萄糖 20 g
   pH7.5,分裝 80ml 後於 121℃ 15 分滅菌
   加 20ml 之人,馬、牛之脫纖維素血液。
 
b. Anaerobic Agar ( 厭氣性 agar)
  目的:厭氧性之培養
  乾燥培養基:BBL、Difco
 
特徵: 要使用特殊之培養皿蓋 ( 由 BBL 製造 Brewer Anaerobic Petri Dish Cover)
  直接可以厭氧性培養
 
c. RCM Agar
  乾燥培養基:Oxoid
 
特徵: 食品中之 Clostridium 之菌數計算
  消化管內
  Smith (1961) 以 RCM agar 加血液對人及動物糞便內之 Lactobacillus 之菌數計算,其他以血液及 Neomycine 添加後也能供為 Bacteroides, Streptococcus,酵母等之菌數計算。
 
d. Sulfite, Polymyxin-Sulfadiazine Agar (SPS agar)
  目的:食品中之 Cl. Perfrigens (Welchii ) 菌分離用
  乾燥培養基:BBL
 
特徵: 有選擇性,Welchii 菌形成黑色菌落
  食品細挫後,階段稀釋之一定量加於已溶解保持 45~50℃ 之本 Medium 混合倒入 Petridish 內培養。
e. TSN Agar (Trypticase Sulfite Neomycine Agar)
  目的:改良 SPS agar ,也使用於 Welchii 菌之分離
  乾燥培養基:BBL
  特徵:有強之選擇作用,腸內細菌不發育,在 46℃ 培養更佳。
3.2. 3.12. Bacillus用之培養基
  Bacillus cereus 之分離
  SG Medium
  目的:B. cereus 之分離及同定
  乾燥培養基:日水
 
特徵: B. cereus 之菌落比普通 Agar 大,B. megaterium 呈高度濕潤及隆起。
  B. cereus var. mycoides 者 Rhizoid 較明顯,在本培養基能同時觀察
  B. cereus 之澱粉水解性及 gelatin 液化。
3.2. 3.13. Brucella ( 布氏桿菌 ) 培養基
 
(1) Brucella Agar (Albimi)
  目的:Brucella 之分離,同定,研究為最常用。
  乾燥培養基:Albimi Laboratory Inc.
 
特徵: 必要時加馬或牛非化血清 1-5%,或加抗生素供為選擇用培養基亦可,對 Vibrio fetus 之分離亦佳。
  選擇培養基抗生質之添加量 (1,000ml 時 )
 
Bacitracin 25,000 單位
Polymixin B 600 單位
Actidione 100 mg
(2) Oxoid Brucella Medium
  目的:用法與上述 Albimi Brucella Agar 同
  乾燥培養基:Oxoid
(3) Trypticase Soy Agar (Broth )
(4) Eugon Agar
(5) Serum Dextrose Agar
 
Pepton 20 g
Glucose 10 g
NaCl 5 g
Agar 15 g
牛、馬非化血清 50~100 ml
pH 7.2
  目的:Brucella 常用之培養基
(6) Braun's 2-1 Agar (Braun & Kelsh 1954)
  目的:Brucella 分離及菌落相之觀察之用
  乾燥培養基:BBL
 
特徵: 未凝固前加 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride 0.5% 時菌落著色,容易識別,又對 S 型及 R 型菌落之識別非常容易。
(7) Brucella Differentiation Kit (BBL)
  特徵:含有basic fuchsin thionin 供鑑定用
3.2. 3.14. 真菌用之培養基
 
(1) Sabouraud Medium
  目的:真菌培養
  乾燥培養基:Difco、BBL、Oxoid 、榮研、日水
 
特徵: 由臨床材料分離真菌,因其低 pH 及高濃度之糖能阻止一般細菌之發育而選擇性的使真菌增殖。
(2) Mycophil Agar (Mycological Agar )
  目的:Sabouraud agar 之變法製成,對真菌選擇性分離,菌數計算及保存用。
  乾燥培養基:Difco、BBL
 
特徵: 適合真菌之發育,對汽水、啤酒糖內之真菌數計算之用,此時應調整 pH 為 4 而混合稀釋培養之。
(3) Potato Dextrose Agar
  目的:黴菌、酵母菌之增殖、分離、菌數測定用。
  乾燥培養基:Difco、BBL、Oxoid 、榮研、日水
  特徵:能觀察形態及同定。
(4) Pango-Levine Agar
  目的:Candida 之選擇培養基
  乾燥培養基:Difco
 
特徵: Candida albicans :乳酪色-粉紅色
  Candida guilliermondi:深赤色
  Candida parakrusei:鮮桃紅色
  Candida pseudotropicalis:桃紅色
  Candida stellatoide:鮮紅色
  Candida tropicalis:深紅色
  Candida saturnus:粉紅色 ( 擴散 )
  Saccharomyces cerevisiae:粉紅色或紅色
  Torulopsis glabrata :粉紅色
  Zygosaccharomyces priorianus:深紅色
(5) Czapex-Dox Agar
 
目的: Aspergillus 能發育 Mycelia, Candida 之形態鑑別,土壤真菌之分離,真菌之保存用。
  乾燥培養基:Difco、BBL 、榮研、日水
(6) Chlamydospore Agar
 
目的: 酵母(Chlamydospore 屬 Candida),尤其 C. albicans 之分離及同定。 乾燥培養基 : BBL 、榮研
  乾燥培養基: BBL 、榮研
3.2. 4. 生理學及生化學檢查用培養基製造法及試驗
3.2. 4.1. 碳水化合物分解試驗用培養
  一、供試碳水化物之糖類如下
 
a. 五碳糖類= L-arabinose, D-xylose, Rhamnose 或 Isodulcitol
b. 六碳糖類= Dextrose 或 D-glucose, Laevulose, D-fructose, D-mannose,galactose ,L-sorbose.
c. 複 糖 類 = Saccharose 或 Lactose , Maltose, Trehalose , Cellobiose
d. 三 糖 類 = Raffinose 或 Melitose
e. 多 糖 類 = Starch 或 Amylum,Dextrin, Glycogen,Inulin
f. 高 級 醇 = Glycerol,Erythritol,Adonitol,Mannitol, D-Sorbitol
g. 配 糖 體 = Arbutin,Salicin ,Esculin
h. 非碳水化物= Inositol
使用時 0.5~1.0% 於培養基
  二、碳水化合物分解試驗用培養基
 
(1) Barsikow 之培養基 ( 變法 )
 
組成:
Pepton 10 g
NaCl 5 g
精製水 1,000 ml
指示藥
pH 6.9 - 7.4
    Pepton使用Polypepton( 日本大五 ),亞鈴 Pepton 及 Bacto-pepton, Proteose Pepton No.3, Trypticase 最常用
a. Phenol Red Broth Base BBL  
b. Phenol Red Pepton Water Oxoid  
c. Androde Pepton Water Oxoid  
d. Purple Broth Base BBL  
(2) Pepton Medium
 
肉抽出物 1-3 g
Pepton 10 g
NaCl 5 g
精製水 1,000 ml
指示藥
pH 6.8 - 7.4
  乾燥培養基有
a. Phenol Red Broth Base Difco  
b. Phenol Red Base Difco  
c. BTB Broth Base Difco  
d. Phenol Red Broth Base With Meat Extract BBL  
  以上 Medium可以加 agar做固形式或半流動狀如 Phenol Red Base (BBL) Purple Agar Base (Difco),糖分解用半流動培養基 ( 榮研 )。
(3) CTA Medium (Cystine Tryptose Agar Medium)
  本培養基對一般之細菌或挑剔性菌之碳水化合物分試驗最合適,又對厭氣菌之碳水化合物分解試驗也能利用。
  乾燥培養基:BBL、日水。
(4) Hugh-Leifson Medium
  乾燥培養基:Difco、BBL、日水、榮研。
(5) Marine-Oxidation-Fermentation Medium
(6) Hiss 之血清水
 
Pepton 4 g
Sodium phosphate dibacic (Na2HPO4 12H20) 0.8 g
精製水 800 ml
pH 7.6 - 7.8
  100℃ 15 分鐘加熱
 
牛血清 200 ml
Bromocresol purple 0.2% 溶液 10 ml
  115℃ 15 分鐘加熱
3.2. 4.2. Indol 產生試驗
  在 SIM Medium 培養 12~24 小時之細菌
 
(1) 加 Ehrich 試藥 0.5ml 或 1ml 或另用 (2) 之方法。
(2) 氯仿 0.5ml 及至 1.0ml 重層後,加 Kovacs 試驗 2-3 滴,輕輕搖動,在數分鐘內試藥層呈赤色為陽性。
  (2)比 (1) 之方法較敏感
  Ehrlich-Bohme 之試藥
 
P-dimethylamino benzaldehyde 1 g
Ethyl alcohol 95 ml
    以上在水浴槽中加溫溶解
 
濃鹽酸 ( 比重 1.19) 20 ml
    Kovacus 試藥
 
P-dimethylaminobenzaldehyde 5 g
Amyl alcohol ( 或 Isoamyl alcohol) 75 ml
    以上在水浴槽中加溫溶解
 
濃鹽酸 25 ml
    兩液如放在暗色玻璃瓶中在冰室可長期保存
(3) VP 試驗
  在 VP 半流動培養基培養 18 小時之表面
 
(1) 試藥 1 加 0.15ml,2 加 0.5ml 及 3 加 1 滴輕輕混合。
(2) 在 37℃ 放置 2 小時
(3) 陽性時呈現鮮明之赤色。
  試藥 1
  或 alpha-Naphthol 5g 以 Ethyl alcohol 100ml 溶解後在冰室保存,溶液呈淡茶色時可以使用,如變濃茶色要廢棄。
 

試藥 2

 
苛性鉀 40 g
精製水 100 ml
 

試藥3

 
Creatin 0.3 g
0.1N-HCl 100 ml
3.2. 4.4. 明膠 (Gelatin) 液化試驗
  明膠培養基
 
抽出物 3 g
蛋白 5 g
明膠 120 g
精製水 1,000 ml
  放在 60℃ 水浴槽中,使明膠溶解,完全溶解後再加熱使其沸騰,修正 pH,分裝,在 121℃ 滅菌,做高層。
  如使用 Difco 或 BBL 等之培養基用明膠時,冬季使用 120g,夏季使用 200g。
  乾燥培養基:Difco、BBL、Oxoid。
  接種及培養法:菌穿刺培養後,在 20~22℃ 常溫之下培養,判定成績。
  如果在 22℃ 培養時,能觀察液化的狀態,在穿刺線發育之情形。
  如在 37℃ 培養時,小心取出放在冰箱 1 小時或放在冰水中,約1小時後觀察成績,如液化陽性者以此處理不會凝固,如不液化即培養基會再凝固。
 
各種明膠液化狀態
 
3.2. 4.5. 牛奶凝固試驗
    很多細菌如培養在牛奶中,能使牛奶凝固,牛奶凝固之原因有 (1) 由細菌 ( 如大腸菌 ) 分解乳糖,而產生酸,結果析出 Casein,另 (2) 細菌本身產生乳酵素所引起,如綠膿菌之牛奶凝固。
 
(1) 培養基
 
a. Litmus milk
  有乾燥培養基:Difco、BBL、 Oxoid
b. Ulrich's milk media
(2) 判定
 
a. Litmus milk
  青色:產生酸。
  無色:指示藥之還元。
b. Ulrich's milk media
  黃綠色或橙色:產生酸。
  紫青色或紅紫色:產生鹼。
  青綠色:酸化。
  白色:還元。
3.2. 4.6. Lysin 脫羧試驗 (Decarboxylase test )
 
(1) 試驗方法
 
a. Lysin 脫羧試驗用培養基約 5ml 接種新鮮培養菌 1 白金耳,最好加流動石蠟 1ml 重層後在 37℃ 培養。
b. 12-18 小時後培養基變為深紫色為陽性,黃白色為陰性。
c. 細菌培養數小時後,培養基會變黃色,但不能依此判定成績。
d. 不加流動石蠟之脫羧試驗不適用於 Klebsiella Enterobacter Hafnia Serratia 群。
(2) 乾燥培養基:
  基礎培養基……Difco Bacto-Decarboxylase Medium Base
  加 L-lysine dihydrochloride 者有
  Difco, BBL………Lysine Decarboxylase Broth
  榮研,日水………Lysine 脫碳酸用試驗用培養
3.2. 4.7. KCN 試驗
 
(1) 如瓊脂培養菌時以白金線取微量,Broth 培養時以極小圈之白金耳取 1 白金耳接種於 KCN Medium。
(2) 以橡皮塞塞緊在 37℃ 培養。
(3) 以 24 小時後取出與不接種細菌之對照比較如混濁者為陽性。
  注意:
a. 要接種瓊脂培養菌時,以白金線輕觸培養基即可,多量接種時,可能由原來之陰性變陽性。
b. 判定時不振動培養基,因在管底沉澱之少量細菌浮游易致誤判。
3.2. 4.8. 硝酸鹽還原之試驗
 
(1) 培養基種類
 
a. 硝酸鹽 Broth…………………………Difco  
b. 硝酸鹽 Agar……………………Difco, BBL  
c. Indol 硝酸鹽 Medium…………………BBL  
d. IN Pepton 培養基…………………… 榮研  
(2) 試驗方法:
    以上各培養基接種新鮮培養菌在 37℃ 培養,最好同時接種 5~6 支,培養基分 1 日、3 日、7 日、10 日…….對各培養期間試驗。
    使用硝酸鹽瓊脂時,除在斜面部觀察亞硝酸鹽之形成,在高層部觀察窒素瓦斯之形成,為防止硝酸鹽還原酵素 (nitratase) 被不活化,以橡皮栓塞緊。
  亞硝酸鹽之證明:
  試藥 1.α-Sulphanil acid ( 氨基苯磺酸 )…………0.8g
      5N 醋酸水或 20 倍硫酸水………………100ml
  試藥 2. α-Naphthylamine ……………………… 0.5g
      5N 醋酸水或 125 倍硫酸水…………… 100ml
  兩液藥在褐色瓶保存於冰室,試藥 2 如過度變色不能使用。
    要試驗時兩液等量混合,其 1ml 滴下於 5ml 之培養液,即亞硝酸存在時,培養基呈桃色或赤色。
3.2. 4.9. 尿素分解試驗
  尿素由尿素分解為 Ammonia 及 CO2 ,即 NH2CO. NH2+ H2O --> 2NH3+CO2
(1) 乾燥培養基:
 
日水……………………………… 尿素培養基
Difco…………………………… Urea Broth, Urea ,Agar Base
BBL……………………………… Urease Test Medium
Oxoid…………………………… Urea Broth Base
榮研……………………………… 尿素培養基
(2) 試驗方法:
  接種及培養法
    取 Agar media 之上新鮮培養菌,濃厚浮游於尿素培養基,通常以直徑 2mm 之白金耳接種於約 1ml 之培養基內使其均勻後,改置 37℃ 水浴中各於 10、60 分鐘及 2 小時觀察成績。
  成績之判定:
    Ammonia 之產生,依培養基之鹼性化,即以 Phenol red 之變化而知,陽性者紅色。
3.2. 4.10. Phenylpyruvic acid (PPA ) 試驗
   本試驗要檢查細菌有無 Phenyl alanine diaminase 之活性,即證明最後分解產物 Phenylpyruvic acid 有無最後分解產物 Phenylpyruvic acid。
   本試驗係腸內細菌及 Gram 陰性桿菌之生化學性狀檢查之一種。
 
(1) Phenylalanin agar 之方法……
 
a. 乾燥培養基:Difco
b. 接種及培養法:
  取瓊脂斜面之新鮮培養菌 2~3 白金耳,塗抹於斜面,在 37℃ 培養 4 小時,必要時培養 18~24 小時。
c. 判定成績:
  在斜面部加 10% (W/V) 鹽化第二鐵水溶液 4~5 滴。陽性時,在凝結水與斜面部有綠色之反應。
(2) Phenylalanine , Sodium malonate 之方法
 
a. 培養基……………………有乾燥培養基:Difco、日水
b. 試驗方法:
  接種極微量之檢查菌於 37℃ 48 小時培養。
c. 判定:
 
(a) Malonate 利用
  觀察培養基之顏色,青色為陽性,綠色為陰性。
(b) PPA 試驗
  滴下 0.1N 鹽酸約 3~5 滴,培養基變作黃色 ( 酸性),再加 10% 鹽化第二鐵水溶液 3~5 滴。
  深綠色-陽性
  黃~淡黃色-陰性。
3.2. 4.11. 觸試驗(Catalase test)
  Catalase 即自 H2O2 取氧取變水之酵素
 
試驗方法: 10 倍稀釋之 H2O2 1ml,注加於在瓊脂斜面培養 24 小時之被檢細菌之上,試驗管傾斜,如陽性時培養基之表面發生氣泡。此種試驗不能在 Blood agar plate 上施行,因紅血球含 Catalase。
3.2. 4.12. Fermentation broth for Listeria (Listeria 醱酵試驗肉湯 )
 
Proteose Pepton No.3 10 g
Beef extract 1 g
NaCl 5 g
Bromcresol purple 0.1 g
蒸餾水 1,000 ml
  加熱溶解後,高壓滅菌 121℃ 20 分鐘,分別加入Glucose ,salicin ,rhamnose ,dulcitol 及 raffinose 各 0.5%。
  供為 Listeria 之生化性狀研究。
3.2. 4.13. Listeria 運動性試驗半固體瓊脂
 
Bacto-tryptose 10 g
NaCl 5 g
Agar 5 g
Glucose 1 g
蒸餾水 1,000 ml
  121℃ 20 分鐘滅菌
  穿刺培養觀察其運動性。
3.2. 4.14. 三糖鐵瓊脂 (Triple sugar iron agar-TSI agar)
 
Polypepton 20 g
NaCl 5 g
乳糖 10 g
蔗糖 1 g
葡萄糖 10 g
Fe(NH4)2 0.2 g
Na2S2O3.5H2O 0.2 g
Phenol red ( 酚紅 ) 0.024 g
     
agar 12 g
蒸餾水 1,000 ml
pH 7.3    
 
目的: 腸內細菌之最基礎鑑別培養基,檢查有無分解葡萄糖、乳糖及蔗糖,氣體產生及硫化氫產生。
  乾燥培養基:榮研、日水、極東、BBL、Difco。
3.2. 4.15. 葡萄糖的氧化與醱酵 (OF 試驗 )
    使用 OF 培養基 (Hugh-Leifson 培養基 ),有些研究者在使用前為要除去裏面溶解的空氣,先把培養基加熱,然後冷卻。
    用兩支試管培養基以白金穿刺,其中1支加一層已融解的軟石蠟 ( 流動石蠟亦可 ) 約一公分高,培養 14 日每日檢查。
 
成 績 開放試管 加軟石蠟試管
氧 化
醱 酵
不分解 青或綠
 
對照: 氧化-Acinetobacter anifratus
  醱酵-E. coli
  不分解-Alcaligenes faecalis
3.2. 4.16. Esculin 的水解試驗
    Esculin broth (Esculin 1g,枸櫞酸鐵 0.5g,Pepton水1,000ml,115℃ 滅菌 10 分鐘 )。菌接種後每日觀察連續 7 日,有黑變者表示有 Esculin 的水解。
 
對照: 陽性-Streptococcus faecalis
  陰性-S. agalatiae
3.2. 4.17. Arginin的水解試驗
  Arginin broth (Niven 1942)
  Trypton 5g, K2HPO2 2g, Arginin-鹽酸鹽 3g,酵母抽出物 5g,葡萄糖 0.5g,精製水 1,000ml 修正 pH 7.0,煮沸過濾,在 115℃ 20 分鐘滅菌,已分裝 5ml 的 arginin broth 內接種菌體後培養 24 小時,然後加 Nessler. 的試藥 0.25ml,有 Arginin 水解者呈褐色。
 
對照: 陽性-Streptococcus faecalis
  陰性-S. hominis
3.2. 4.18. 膽汁溶解性
 
方法: 18 小時培養的試驗菌接種於血清肉羹,消化肉羹或肉汁肉羹,其 5ml 加 10% 膽汁酸鹽鈉溶液 0.5ml,在 37℃ 孵育,肺炎球菌加膽汁酸鹽後 15 分鐘以內即溶。
註: 本反應不能低於 pH 6.8 之酸性,因此含有葡萄糖的培養基不適於本試驗。
對照: 陽性-Streptococcus pneumoniae
  陰性-S. faecalis
3.2. 4.19. 檸檬酸鹽的利用
  以滅菌生理鹽水或滅菌水,輕輕把細菌懸浮,然後以白金線沾液接種菌,在 37℃ ( 腸內細菌 )或合適溫度 ( 其他細菌 )培養。
  方法 1:Koser 的檸檬酸鹽培養基
 
NaCl 5 g
Mg2SO2.7H2O 0.2 g
精製水 1,000 ml
檸檬酸 2 g
NH4H2PO4 1 g
K2HPO4 1 g
     
pH 6.8 過濾  
      115℃ 20 分鐘滅菌
  細菌接種後每日觀察至 7 日,陽性者再移植於 Koser 的培養基後確定。
  方法 2:Simmons 的檸檬酸鹽培養基
    在 Simmons 的檸檬酸鹽培養基斜面上劃線培養觀察 7 日有無發育及顏色的變色,陽性者再移植 Koser 的培養基。
  呈青色又發育=利用檸檬酸。
  原來的綠色=不利用檸檬酸。
 
對照: 陽性:Klebsiella aerogenes
  陰性:E. Coli
 
方法 3: Christensen 的檸檬酸鹽培養基上在高層部穿刺培養,在斜面部劃線培養,檢查 7 日,觀察顏色。
  紅色:利用檸檬酸鹽。
  黃色:不利用檸檬酸。
 
對照: 陽性:K. aerogenes
  陰性:Shigella sonnei
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