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第七章 細菌藥劑敏感性試驗
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作者: 陳清
詳細內容:
.1. 緒言
    抗生物質,亦稱化學療法劑(Chemotherapy agent)使用此等藥物作為感染症之治療,稱之為化學療法(Chemotherapy)或抗生物質療法(Antibiotic therapy)。化學療法劑除抗生物質外 ,其他如磺胺藥類(Sulfa drug)及硝基喃誘導體(Nitrofuran derivative)等非微生物由來之合成抗菌劑(Synthetic Chemotherape utic aqent)亦包括在內。抗生物質之作用機序 ,以阻礙細胞壁之合成為主,其他影響或阻礙細胞質膜,蛋白質、核酸,以及維生素等之合成,亦有所瞭解。抗生物質依其分類可分為:
a. 青黴素類(Penicillins)
b. 頭芽胞菌素類(Cephalosporins)
c. 胺基配糖體類抗生物質(Aminoglycosidic antibiotics)
d. 氯黴素(Chloramphenicol)
e. 四環素類(Tetracyclines)
f. 巨環內酯類(Macrolides)
g. 胜類抗生物質(Peptide antibiotics)
h. 林可黴素類(Lincomycins)
i. 多巨環內酯類(Polyene macrolides)
j. 其他(Others)等。
    分離所得之細菌,對於抗菌物質之敏感性試驗,可俊用瓊脂平板稀釋法(Agar plate dilution method),即最小發育阻止濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)加以測定,或肉羹培
養基稀釋法(Broth dilution method)亦可使用圓盤濾紙瓊脂擴散法(Filter-paper disc,agar
diffusion method)加以測定。 
7.2. 培養基之成份與培養方法
    化學療法劑除磺胺類藥外,對於微生物之感受性試驗所使用之培養基,一般以 Bacto-Sensit
tivity test medium為宜,其組成成分如下:
7.2. 1.培養基之組成成分:
 
Pork Heart infusion from 375.0 gm
Bacto-Yeast Extract 3.5 gm
Proteose Peptone No.3 Difco 5.0 gm
Bacto-Soytone 6.5 gm
Bacto-Dextrose 5.0 gm
Sodium Chloride 5.0 gm
Bacto-Agar 15.0 gm
    除此之外,Bacto-heart infusion agar 及 Bacto-Tryptose blood agar base 亦可使用。至於其他 Bacto-tryptic soy agar(Difco),Trypticase soy agar(BBL)無論是抗生素、磺胺劑及一般化學療法劑亦均可使用。
7.2. 2.培養方法:
 
a. 稀釋法:將不等量之抗菌劑以漸增的方法,加入於液體或固體培養基內 , 被檢之細菌在一
定菌數濃度下接種於此培養基 , 以觀察抗菌劑在何種濃度下方能完全阻止其生長或將其消
滅。
b. 擴散法:以一個濾紙盤 ,多孔杯或無底的小量杯 , 其內含有已知量的藥物,將其放入於已
接種培養之被檢固體培養基內 , 一定時間培養後(通常 18-20 小時)測定細菌發育被抑制環之大小,來檢定其對被檢細菌之抗菌能力。 然而此種方法除藥物與細菌之間的反應外 ,尚有一些物理及化學上主觀的因素, 如培養基的性質,擴散力及藥品分子之大小, 及其穩定性,因此使狀況標準化就能以定量的檢定藥效或微生物的感受性。
7.2. 3.影響抗菌作用力之因素:
 
a. PH值:有些藥在酸性較活動如 Nitrofurantoin,有些則在鹼性狀況下較為活動如鏈黴素磺胺劑
等。
b. 培養基的組成:鹽類能抑制鏈黴素,組織抽出物中的 PABA 與磺胺劑發生拮抗,血清蛋白以
不同比率與青黴素結合。
c. 藥品的穩定性:在培養器溫度下, 四環素很快的失效,而青黴素則較慢,至於鏈黴素、氯
黴素及 Polymycin B 則較穩定。
d. 被檢菌濃度之高低:通常接種量愈大則感受性愈低 , 大量細菌群族較小量細菌不易被完全
抑制,而大量細菌其產生抗藥突變種的嚴重性較大。
e. 培養時間的長短:許多情形下細菌不被消滅,只是短時間內被接種的藥品所抑制 , 培養時
間長,則產生突變之機會多,當藥品被破壞後,微生物群中最不敏感的個體就開始繁殖。
f. 微生物的代謝能力:通常活動及快速生長者藥品感受性大,而堅持者(Persisters)是新陳代
謝不活潑的微生物 , 在於藥品接觸後能生存較久, 但其後代則對同樣藥品有完全之感受性
。L 形式細菌也許是「堅持者」中特殊化的形式,以抑制細胞壁生長的藥品治療時, 沒有細
胞壁形成的細菌會在某些具有適當滲透性質的組織中生長,這種厚質體(Protoplast)當在服用藥物時,還是在組織中存在,最後再改變為細菌形式而疾病再發。
7.3. 瓊脂平板稀釋法 (Agar Plate Dilution Method)
    最小發育阻止濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)測定。
7.3. 1.感受性測定用培養基  
    下列之培養基均可使用,惟使用時應註明出品廠牌以資查考。
(1)Heart infusion agar
(2)感受性 Disc 用培養基。
7.3. 2.抗生物質之濃度階段
    以 100mcg/ml 之二倍稀釋法
100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1mcg/ml。然而使用 100mcg/ml 以上
之濃度時,則以 200、400、80、1,600mcg/ml。至於力價以 Unit 使用之抗生物質, 亦可改用 mcg/ml表示。
7.3. 3.增菌用培養基
    Trypticase soy broth(BBL),Tryptic soy broth(Difco), Tryptone soy broth(0xoid)Heart
infusion broth(Difco)及 Tryptone soy broth(Eiken)均可使用。
7.3. 4.菌之接種法
    通常於增菌培養基 18-24 小時培養後,此培養液一白金耳懸浮於滅菌生理食鹽水 2ml ,供
為接種菌液(約 106/ml),以滅菌棉棒蘸取此稀釋菌液在各不同濃度藥劑平板培養基上劃線塗
抹培養。
7.3. 5.培養時間及濃度
    在 37℃ 下培養 18-24 小時。
7.3. 6.判定
    以完全阻止細菌發育之最低濃度,為感受性之最小發育阻止濃度。如有一個菌落發育或極
為稀薄之菌苔時,仍應視同「發育」判定。
7.4. 肉羹培養基稀釋法((Broth dilution method)
    某些菌株之藥劑感受性值之正確測定,以本法較瓊脂平板稀釋法為適合,但是本法由於接
種菌量之多少其感受性值會有很大的偏差, 為了在 106-108 可能含有一個程度之耐性變異菌,
能夠除去之情況下,接種菌量以少量作試驗為本法之前提。
7.4. 1.肉羹培養基之選擇:
    一般以 Heart infusion 培養基,磺胺類藥,Trimethoprim 感受性試驗時,使用 Muller-Hinton 液體培養基,但 Streptococcus 等發育緩慢之菌株,則使用 Tryptic soy broth 等培養基。
7.4. 2.化學療法劑肉羹培養基之製作:
    通常以含化學療法劑二倍稀釋濃度之肉羹為檢查材料,首先先製作最高含藥量濃度之肉羹
,然後以 2 倍稀釋法使用 10 支小試管次第稀釋。使用量為各 1ml,第 11 支為未如化學療法劑之肉羹 1ml,作為對照 。 稀釋用吸管每一稀釋階段更換為原則。每一菌株至少要有二系列之稀釋液做為實驗用。
7.4. 3.菌液之調製及接種法:
     被檢細菌之菌落,以白金耳釣取移植於增菌用肉羹培養基,培養一夜,接種菌之濃度以上
述各不同濃度之肉羹培養基內有 105一106/ml 之程度為宜 , 因此經 一夜培養之菌液則以肉羹或
0.85% 生理食鹽水 1:100 稀釋之菌液各 0.05ml 加入前述各不同稀釋濃度之含藥肉羹,由於菌種之不同,雖無稀釋直接加入 0.05ml 之情形亦有, 但由於突然變異而引起耐性株之影響會增強出現頻率,必須加以注意。
7.4. 4.培養條件:
    37℃16-20 小時,靜置培養。
7.4. 5.結果之判定:
  與對照肉羹培養基比較,明顯之發育被阻止之最小藥劑濃度,判定其 MIC 值,極為輕度之混濁或可見到菌塊時可判定為 " 阻止 "。
  附註:
 
a. 抗生物質標準液之製作及稀釋法
    標明力價之各抗生物質之粉末 ,如入適當量之滅菌蒸餾水 , 原則上使每 ml 溶液中含有 1,000mcg 之力價為標準液 。當 1,000mcg/ml 溶液作成之後,以滅菌吸管 2 倍稀釋法作成500、250、125、65.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0、1.0……mcg/ml 之溶液 。 稀釋時應每次更換滅菌吸管,以求準確。或配成 100mcg/ml,再依二倍稀釋法亦可。
b. 感受性測定用平板培養基之製法
    培養基溶解滅菌後置於溫水槽中俟其溫度降至 40-50℃ 時,將前述抗菌物貿溶液 1 與培養基 9 之比例,放置於滅菌培養皿內,充分混合均勻作成平板,使其每 ml 中含有一定欲測濃度之抗菌物質供用。
c. 被檢菌株及對照菌株
    被檢菌株儘可能於分離堆後繼代 2-3 代以內者供用。測定時做對照,通常以葡萄球菌
或大腸菌為對照菌株。
7.5. 圓盤濾紙瓊脂擴散法(Filter-Paper Disc Agar Diffusion Method)
    濾紙圓盤瓊脂擴散感受性測定法,在實驗室廣被採用為微生物對於抗菌物質感受性測定之
例行工作。
7.5. 1.感受性測定用培養基
    Mueller-Hinton agar,Trypticase soy agar(BBL),Tryptic soy agar(Difco),Heart infusion
agar(Difco)等均可使用。
7.5. 2.平板培養基之製備
    將滅菌溶解之培養基,以 100mm 之培養皿加入約 12-15ml使成平板,亦可使用加入 5% 之脫纖馬或綿羊血液培養基均可使用。
7.5. 3.培養液之準備
    以白金耳釣取細菌置入於 4ml 之 Trypticase soy broth(BBL)或 Tryptose phosphate broth,並在定溫箱內孵育 18-24 小時後供用。
7.5. 4.被檢菌液之培養
    培養基在使用之前,先倒置於 37℃,定溫箱一小時,使其表面乾燥,然後以前述培養液一
滴滴於平板培養基之中央,並以彎曲玻璃棒將菌液均勻塗佈於平板培養基之表面,使其在室溫
下乾燥 3-5 分鐘。
7.5. 5.圓盤濾紙(Filter paper disc)之應用
    含有抗菌劑之圓盤濾紙,以滅菌鑷子夾取移入於已培養之平板培養基上,並用滅菌夾子輕
輕壓,使圓盤濾紙與培養基之表面接著,使其抗菌劑得以擴散,發揮其效能。
7.5. 6.培養時間與溫度
    倒置平板培養基,在需氧、厭氧或含有 10%CO2 在 37℃ 定溫箱內,培養 18-24 小時。
7.5. 7.判定
    培養 18-24 小時後之平板培養基,量取包括圓盤濾紙在內,肉眼上觀察細菌發育被完全抑
制環之大小 (mm),以判定其感受性之高低。
   
  附註:各種抗菌試驗用圓盤濾紙片所含之濃度,請參考出品廠之標示說明。
7.6. 抗菌物質之檢出 (Detection of the anti bacterial substance)
    本試驗乃係由被檢材料樣本,如牛乳、血清、尿液及其他體液等, 應用細菌對於藥劑具有
感受性之原理,來測定被檢材料中是否含有抗菌性物質。如抗生素,磺胺類藥,或其他化學藥
品之存在。
  至於測出所含抗菌性物質,究屬何種藥物,則需依專門特殊檢定法加以分析,茲謹以鑑定牛乳中是否含有抗生素為例,加以說明如下:
7.6. 1.測定用培養基之組成:
  培養基甲:
蛋白 (Peptone) 6.0 gm
消化乳酪素 (Pancreatic digest of casein) 4.0 gm
酵母抽出物 (Yeast extract) 3.0 gm
牛肉汁 (Beet extract) 1.5 gm
無水葡萄糖 (Anhydrous dextrose) 1.0 gm
瓊脂 (Agar) 15.0 gm
    上列物料加入蒸餾水作成 1,000ml 煮沸使全溶,每 100ml 裝入於 300ml 之三角瓶中, 在 121℃ 滅菌 15 分鐘,其最後 pH 應為 6.5-6.6,必要時以 1N 之 NaOH 或 HCI 調節之,培養基製成後貯存備用。
  培養基乙:
  其組成除上述配方外, 每 1.000ml 另加入 0.3gm 之 MnSO4.H2O 。 每 300ml 裝入一洛氏瓶(Roux bottle)中備用。亦可使用現成之 Bacto-Antibiotic medium NO.1。
7.6. 2.供試微生物:
    Bacillus subtilis(ATCC 6633),接種保存在培養基中, 每一個月更新培養繼代一次或冷凍乾燥保存。
7.6. 3.檢驗過程:
  a.供試微生物懸浮之製備:
    以新繼代培養之細菌在 37℃ 下培養 18-24 小時,然後以 2-3ml 之滅菌生理食鹽水裝菌苔洗下,移植於培養基乙之洛氏瓶培養基之表面,在 37℃ 下培養 5 日 。 然後再以滅菌之生理食鹽水 5Oml 將洛氏瓶中之菌苔洗下,裝入滅菌遠心沈澱管中遠心分離之 。 傾去上清液 , 重行加入約 70℃ 之滅菌生理食鹽水 , 盛入有玻璃蓋之玻璃瓶中 , 於 70℃ 下加熱 30 分鐘,使胞子接受熱震 (Heat-shock),後貯存於冰箱中備用。
  b.供試培養皿培養材料之製備:
    加熱溶製就之瓊脂培養基甲 5 份,冷卻至 55℃ 至 60℃ 每 100ml 培養基中各加 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0ml之供試微生物懸浮液(已如前述),充分搖勻,各傾入經滅菌之培養皿中,置水平面上使其凝固,貯存培養皿於冰箱中,最遲應於5日內使用之。 使用時自冰箱內取出, 於 15 分鐘內用畢。
  c.檢驗手續:
    供檢驗之生乳樣品充分搖盪使乳脂分佈均勻 , 再以滅菌之鑷子夾取吸取片( 可用 Sterilized
blanks 1/4",Difco)一片浸沒其中, 取出除去多餘之乳汁 , 置於前述製備之供試培養皿培養基
表面上,用鑷尖輕觸之,使與培養基面完全密接 。 惟應注意勿用力過大致乳汁擠出,每培養皿
中放置 5 片,片與片間由中心量起相距至少 2cm,以防制菌環重疊 , 每夾取一片後鑷尖應燒灼滅菌一次,操作完成後置於 37℃ 下培養 4-5 小時。
7.6. 4.判定
    經培養完成之培養皿取出,在光亮處以各種角度觀察之 , 若吸取片之四週有制菌圈之出現
,即表示乳樣中含有抗生素,反之則無。
  附錄:枯草桿菌芽胞菌片使用說明
    本菌種為枯草桿菌(ATCC 6633)培養所得菌液 , 經加熱處理後之芽胞菌,以特殊明膠(
Gelatine)等佐劑調製,乾燥製成之薄片菌種。
  效用:供生乳中抗生物質殘留檢驗用。
  使用方法:
    1.含菌種培養基之製備:
使用第 1 號抗生素培養基 (Bacto Antibiotic medium 1) 經加熱溶解及高壓滅菌 (121℃ 15 分鐘 ) 後
,保持於 56℃土0.5℃ 溫水浴槽中,每 100ml 培養基加入,乾燥菌片 3 片,充分搖動使菌片完全溶解均勻分散於培養基中,然後以滅菌吸管吸取分裝於已滅菌塑膠培養皿 ( 底皿 85士1㎜), 每個培養皿分裝 9ml,置於水平位置使之凝固,再以塑膠袋密封置於 4℃ 冰箱中,於 10 日內用畢為宜。
    2.自冰箱中取出之芽胞菌培養皿,應先放在 37℃ 定溫箱,放置時應倒放 ( 底皿在上 ),並使底皿與蓋皿之間有空隙,以便水分蒸發。30 分鐘後取出,迅速貼上已吸取被檢生乳之濾紙片 , 並應於 10 分鐘內完成,再置於 37℃ 定溫箱中培養。
    3.在當天牛乳抗生物質檢驗之一批培養皿中, 選出 1 個培養皿,放入 0.05IU/ml 及 0.1IU/ml 之青黴素濾紙各 1 片做為陰性與陽性之對照。
    判定:1.判定時間:以培養後四小時為原則,但在 3.5 小時,4.0 小時及 4.5 小時等三個時段,請加以觀察,再作最後判定。
  2.制菌圈:
  (1)1mm( 含 ) 以上者判為陽性。
    (2)1mm( 不含 ) 以下者判為疑陽性。
    (3)完全無制菌者判為陰性。
    (4)疑陽性或對照不明顯者請重做。
  保存法:
   1.芽胞菌片瓶及青黴素濾紙片瓶打開取用後,須再栓緊並封臘。
   2.保存於 4℃ 冰箱或零下 20℃ 冰櫃,請勿放在零下 70℃ 冷凍櫃,以免玻璃瓶破裂,保存期限,請依標籤指示使用。
  包裝:
   1.枯草桿菌芽胞菌片:每瓶 25 片。
   2.青黴素濾紙片:0.05IU/ml 及 0.1IU/ml 每瓶均各裝 30 片。
台灣省家畜衛生試驗所有該項產品
供應作檢驗之用。
  參考文獻
    (1)中國國家標準 (1972):C、N、S3454-H 299。
    (2)陳仁德、彭衍、楊效誠、楊效齡等合譯 (1973) : 最新微生物學,大學圖書出版社印行,P.139-142。
    (3)陳清、柏崎守、波岡茂郎 (1973):嫌氣性條件下豚由來大腸菌Carbadox 感受性,獸醫畜產新報 No.599、P.983~985。
    (4)石山俊次、上田泰、桑原章吾 、小酒井望、古屋曉一、紺野昌俊、 藤井良知 ( 1968 ) :Chemotherapy 16、P.98~99。
    (5)東京大學醫科研究所學友會編 (1988):微生物學實習提要,抗菌作用與測定法,P.106~
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    (7)Blair J.E., Leunette, E.H., & Truant, j.P. (1970):Manual of Clinical microbiology, P.299~310。
    (8)Culture media and reagents for microbiological and Clinical Laboratory Procedures ( 1971 ) :
Difco Laboratories, Detroit. Michigan 48232 U.S.A P.76~77。
    (9)The American Type Culture Collection (1976):Catalogue of Strains I. Twelfth Edition. P.31。
    (10)Supplementary literature, Difco Laboratories, Detroit Michigan 48232 U.S.A. (1972)。
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