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豬瘟實驗室診斷步驟
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豬瘟實驗室診斷步驟

(The Diagnostic Techniques of Hog Cholera)
豬瘟可疑患處畜

採取病豬血液並施行
病理解剖,觀察病變
。並採脾臟、淋巴結、
扁桃腺及其他各臟器。
 
(A)病理組織
  切片檢查
(B)冷凍切片
  豬瘟螢光
  標示抗體
  染色檢查
 ( 直接法
 與間接法 )
(C)細胞培養
  (PK-15
  或 CPK )
  接種後
  48 小時
 行豬瘟螢
 光抗體染
 色法( 直
 接法與間
 接法 ) 或
 接種後行
 間接免疫
 酵素斑點
 染色檢查
(D)取全血計
  算白血球
  數及作血
  液塗抹片
  觀察白血
  球像,並
  取脫纖血
  行 PCR
  檢測病毒
  ;取血清
  行 END
  中和抗體
  測定

(E)細菌培養


病 材 採 取

(The Collection of Specimems)
僅可能在病理早期採取病材
;若死亡應立刻解剖採材。
採取血液計
算白血球數
,作血液塗
抹片行白血
球像觀察。
動物解剖以
消毒劑擦拭
體表,戴手
套,以無菌
工具剝離皮
膚。
液體病材以
無菌針筒抽
取,分裝於
小容器內,
密封。
刮取病材以
無菌刮匙取
上皮細胞或
黏膜,加入
適當含抗生
素之緩衝液
棉拭病材以
棉棒採取病
材,立即浸
泡於含抗生
素之緩衝液
中。
糞   便
取糞便加入
緩衝液,做
成 20% 混
懸液。
 
病原分離
採取病材
 
病原分離以
無菌工具採
取內臟器官
置於無菌容
器內,如果
未能馬上檢
查,冷凍於
-70℃。
病理檢察切
取適當大小
,浸泡於
10 % 福馬
林液內,(
組織厚度不
超過 3 mm
為宜 )。
凍結切片採
取內臟器官
,切成 0.5
cm×1.0cm×
0.3 cm大小
。若無法立
即製作切片
,應置金屬
盒內,密封
後外包鋁箔
,於 -70 ℃
凍結保存。
    離    心

4 ℃ 1,950 g
30 分鐘取
上清液,以
緩衝液配成
20 %混懸液
後,再離心
一次。
  ↓
第二次離心
所得之上清
液加入 5 X
抗生素,4
℃放置 1小
時。
  ↓
病原分離
豬 瘟 實 驗 室 診 斷 方 法

(一) 豬瘟之細胞培養接種及螢光標示抗體染色檢查步驟

以含 10% 小牛血清及 5 倍抗生素之 MEM,做 10~20% 之脾臟、淋巴結、扁桃腺等檢體乳劑
取 8 孔細胞培養玻片 (Chamber Slide),每孔加入 0.2 ml 檢體乳劑與 0.2ml 之 PK-15 細胞懸浮液 (含 4 × 105 個細胞 / ml )
經 37℃ 培養 48 小時後,甩棄培養液,除去塑膠盤壁,以吹風器吹乾。
經甲醇固定 2 分鐘,再除去甲酵,以 PBS 清洗。
加入豬瘟螢光標示抗體 (0.1 ml / 孔 )並於 37℃ 染色 30 分鐘。
以 PBS 洗 3 次,除去孔間樹脂帶,再滴 50% Glycerin-PBS 混合液一滴,覆蓋玻片。
螢光顯微鏡下判讀豬瘟特異螢光。
陽性者有細胞質內之綠色均質化的特異螢光,陰性無螢光出現。

  (二) 豬瘟中和抗體 END 檢測法準備工作
(The Preparation for Exaltation of Newcasle Disease virus;END Method)
(A) 細胞:
  初代豬睪丸細胞 (Primary Swine Testicle Cells;ST):以無菌操作技術取下 4~6 週齡健康小豬睪丸,經去莢膜、剪碎,並以 0.0l M PBS,PH7.2 和 0.25% 胰蛋白酶液各洗過一次後之組織碎塊,再以 0.25% 胰蛋白液於細胞消化瓶內在磁力攪拌器上,室溫攪拌消化 10~15 分鐘。細胞消化液,先經 15O mesh 濾網過濾後加入 1/10 倍量之 56℃,30 分非動化處理小牛血清,並置 4℃ 冰箱中。剩餘之組織塊,再重複予以消化,直至全部被消化掉為止。最後,將收集得之細胞濾液經 4℃,1,000 rpm 離心 5 分鐘。沉澱細胞再以含 10% 胎牛血清 ( 無 BVD 抗體 )、抗生素 (Penicillin G Sulfate 100 U/ml 和 Streptomycin 100 μg/ml) 和抗霉素 (Fungizone 250 μg/ ml) 之 MEM 細胞培養液 ( Minimum Esential Medium,Eagle Base) 泡製成約 4.0×1O6 Cells/ml 的豬睪丸細胞懸浮液。供豬瘟病毒力價和豬瘟中和抗體 END 法測定用。
註: 0.25% 胰蛋白酶液配製法
秤取胰蛋白酶粉末 30gm(Gibco,1:250),溶於 3,000 ml之0.0l M,PBS,PH 7.2 溶液內。再經 0.45 和 0.2μm 過濾膜過濾,並分裝於滅菌血清瓶內,置 -20℃ 冷凍保存,即為 1% 胰蛋白酶原液。使用時,先經解凍後再以 0.0l M,PBS,PH 7.2 泡製成 0.25% 胰蛋白酶 (1% 胰蛋白酶原液:PBS=1:3)
(B) 病毒:
1. 新城雞瘟病毒 (NDV):宮寺株新城雞瘟病毒係以雞胚胎尿囊腔內接種增殖。10~11 日齡雞胚胎蛋,在照蛋燈光透視下,選擇接近氣室邊緣,避開血管處,拭以碘酊消毒,打洞,再拭以碘釘。以 26 gauge 5/8 inch 長之針頭,採腔與蛋平行方向插入約 1/2 inch,並將病材 0.2 ml 注入尿囊腔內。蛋孔以臘密封,置孵卵器內進行病毒增殖。每日照蛋收集斃死胚蛋 ( 接種後 24 小時內死亡之胚蛋丟棄不收集 ),收取尿囊液。經 4℃,3,000 rpm 離心 30 分鐘後,小量 (1 ml) 分裝於試管內並置 -70℃ 冰凍保存,同時測定其血球凝集力價。
**血球凝集反應 (Hemagglutination ;HA)
  先以注射針筒抽取 4 ml Alsver 液 ( 葡萄糖 2.05%;枸櫞酸鈉 0.80%;食鹽 0.42%,枸櫞酸 0.055%),然後由雞之翼靜脈採血 4 ml。加入 5 倍量之 PBS,PH 7.2 溶液 ( 或 0.85% 生理食鹽液 ),以 2~3 層紗布過濾後,1,500 rpm 離心 10 分。棄上清液,沉澱血球以 PBS,PH 7.2 溶液 ( 或 0.85% 生理食鹽液 ) 作成懸浮液,再離心,如此重覆洗 3 次。最後之沉澱血球,則以 PBS,PH 7.2 溶液 ( 或 0.85% 生理食鹽液 ) 作成 0.5% 血球懸浮液,供新城雞瘟病毒血球凝集反應用。其操作步驟如下:
(1)

在血球凝集板第一行第 1 孔加入0.9 ml PBS,PH 7.2 溶液 ( 或 0.85% 生理食鹽液 )。其餘第 2 至第 10 孔每孔分別加入 0.4 ml,供病毒液稀釋用。 另在第二行任意一孔亦加入 0.4 ml 作為對照。

(2) 在第 1 孔加入 0.1 ml 新城雞瘟病毒液使成 10 倍稀釋。充份混合後以吸管吸取 0.6 ml 並移 0.4 ml 至第 2 孔使成 20 倍稀釋,同時丟棄剩餘的 0.2 ml。第 2 孔混合液經充份混合後,以吸管吸取 0.4 ml 並移至第 3 孔使成 40 倍稀釋。如此重覆操作並行至第 10 孔,經充份混合後丟棄 0.4 ml。如此做成 10 倍至 5,120 倍間之 2 倍連續稀釋。
(3) 在血球凝集板各孔分別加入 0.4 ml 之 0.5% 雞紅血球懸浮液。
(4) 血球凝集板經充份震盪後置於室溫 1 小時後判定結果,並登記病毒之血球凝集價。

血球凝集反應術式
  
註:一單位 (HA) 為 640X
2. 豬瘟病毒 (HCV):A76 株豬瘟病毒係由日本分讓而得。本試驗使用時再經豬初代睪丸細胞培養增殖,小量 (1 ml) 分裝於試管內並置 -70℃ 冰凍保存,同時測定其組織感染力價 (TCID50)。
**以細胞培養法測定豬瘟病毒力價:
(1) 將 A76 株豬瘟病毒液以細胞生長液 (Growth Medium) 由 l0-1 至 l0-6 作 10 倍連續稀釋。於 96 孔塑膠細胞培養盤第 1 和第 2 列每孔放入 10-1 稀釋倍數病毒液 0.025 ml,第 3 列每孔放入 10-2 稀釋倍數病毒液 0.025 ml。以此類推,直至第 7 列每孔放入 10-6 稀釋倍數病毒液 0.025 ml 為止。其餘第 8 列至第 12 列每孔則放入細胞生長液 0.025 ml。
(2) 上述 96 孔微量塑膠培養盤,每孔再加入 0.1 ml 之初代豬睪丸細胞液 (4×105 個細胞),然後放置 37℃,5%CO2 孵卵器內培養 4 天。
(3) 經吸去培養液後,第 1 列以及第 11 列和第 12 列每孔加入細胞生長液 0.1 ml 作為豬瘟病毒感染細胞和正常細胞之對照。而於其第 2 列至第 10 列每孔加入 0.l ml 的宮寺株新城雞瘟病毒液 (1 HA 單位 ) 攻擊,其中第 8 列至第 10 列為新城雞瘟病毒液感染對照。再放置 37℃,5%CO2 孵卵器內培養 3 日。
(4) 每天觀察細胞情形並以第 3 天為最終判讀。TClD50 之計算係依 Reed-Muench Method 法計算之。


 
*僅高於 50% 之感染率百分率 **僅低於 50% 之感染百分率
由以上公式求得之 0.6 加到僅高於 50% 感染率的稀釋指數 ( 此例中為 10-3) 得
10-3 即該病毒之感染力價為 10-3.6 TCID 50 / 0.025ml。

  (三) 豬瘟中和抗體END檢測法的操作方法
  豬瘟中和抗體試驗 (END method) 步驟
1. 中和試驗係以 96 孔微量塑膠培養盤進行試驗,以 0.025 ml 細胞生長液作為稀釋液並加等量血清進行 2 倍連續稀釋。
2. 稀釋後之血清再加入等量的 A76 豬瘟病毒液 (100 TCID50),培養盤在震盪器上充份震燙後放置於 37℃5%CO2 孵卵器內感作 1 小時。
3. 感作後每孔再加入 0.1 ml 之初代豬睪丸細胞液 (4×105 個細胞 ),然後放置在 37℃5%CO2 孵卵器內培養 4 天。
4. 經吸去培養液後,每孔加入 0.1 ml 的宮寺株新城雞瘟病毒液 (l HA 單位 ) 攻擊。再放置 37℃5%CO2 孵卵器內培養。
5. 試驗中同時設立豬瘟陽性和陰性血清、豬瘟病毒、豬瘟與新城雞瘟病毒、新城雞瘟病毒以及正常細胞等對照組。標準陽性血清與預測血清的處理方法同。
6. 每天觀察細胞情形並以第 3 天為最終判讀。
7. 判讀時,若量太多而不便使用顯微鏡觀察,則可用 0.5% 結晶紫甲醇溶液固定染色十分鐘,以自來水沖洗乾淨後觀察之。
註:

0.5% 結晶紫甲醇溶液配法如下:
結晶紫 (Crystal Violet) 0.5 克
70% 甲醇 (Methanol) 100 ml
完全溶解後即可使用。

註: 1. 每一稀釋倍數採用 2 孔培養盤
2. 判定時+:表示有 CPE,即無豬瘟抗體價;-:表示無 CPE,即有豬瘟抗體價。
3. P.S= 豬瘟陽性標準血清;N.S:豬瘟陰性標準血清。
  (四) 豬瘟之PCR診斷方法
(A)

RNA 的製備步驟:
  取 100 微升 (ul) 的病毒血液置於 1.5 ml 微量管 (Microtube) 中,加 0.6 毫升 GTC Buffer,以研磨棒研磨,再加入 70 微升的 3M 醋酸鈉 (Sodum Acetate),0.6 毫升水飽和酚 (Phenol) 及 0.2 毫升的 CI 溶液,完全混合後,震盪 l0 秒鐘,隨即冰浴 15 分鐘,再經 4℃,10000g 離心 20 分鐘,將水層轉置於另一支經 DEPC 處理過之微量管中,加入等量異丙醇 (Isopropanol) 放入 -20℃ 冰櫃,冷凍 1 小時,再以上述條件離心,倒去上層液,再加入 60% 酒精以 4℃,10000g 離心 15 分鐘後,抽去上層液,經抽氣乾燥,加入經 DEPC 處理過之水再溶解,即以完成核酸之製備。

(B) cDNA 的製備方法:
  將萃取的豬瘟病毒 RNA,加入 2.4 單位的鳥類骨髓母細胞症病毒 (Avian Myeloblastosis Virus;AMV) 之反轉錄及 16 單位的 RNA 抑制劑 (RN-asin),0.01 Nanomole 的 HCVl 引動子,在 2.5 倍 Taq 緩衝溶液中,於 42℃ 進行反轉錄作用 30~60 分鐘,即完成 cDNA 的製備。
(C) PCR 反應條件:
  將反轉錄作用後所得之 cDNA 產物,在 95℃ 處理幾分鐘,把反轉錄不活化後直接加入 0.0l Nanomole 的 HCV2 引動子,及 2.0 單位的 Taq DNA 聚合,並補充 0.02 Nanomole 的核甘三磷酸,最後加蒸餾水至 l00 微升之總反應體積。反應條件為 94℃ 變性 30 秒,45℃ 煉合 1 分鐘,72℃ 延展 1 分鐘,共 30 個循環數。
(D) PCR 產物電泳分析:
1. 洋菜凝膠片 (Agarose Gel) 製作
  用 TAE 緩衝液泡製 2% 洋菜凝膠片,方法是取 2 克的洋菜凝膠粉末,加入 98 ml 的 TAE 緩衝液加熱使 Agarose 溶解,待降溫至 50℃ 時,再加入 50 微克 (μg) 的溴化醯液 (Ethidium Bromide),充分混合後,倒入製膠台,待冷卻凝固後,即可供跑電泳。
2. PCR 產物之載入、電泳及判讀
  取 10 微升 (ul) 的 PCR 產物,與 1 微升 (ul) 的載入緩衝液 (Loading Buffer),充份混合後,以微量吸管注入洋菜凝膠中,再以 100 Volts 電壓,電泳分析 30 分鐘,經 UV 燈照射檢視,當有 300bp 長的 BAND 產生,而陰性對照組不產生時,即為豬瘟陽性反應;若均沒有 BAND 產生則為豬瘟陰性反應。
(E) 化學藥品及溶液之配方:
1. GTC 緩衝液:
4M Guanidinium Thiocyanate
25 mM Sodium Citrate, pH 7.0
0.5% Sarcosyl
O.1 M B-mercaptoethanol
2. CI 溶液:Chloroform (24) + Isoamylalcohol (l)
3. 電泳 TAE(Tris-Acetate EDTA) 緩衝液:
先泡成 50 倍的濃縮保存溶液,使用時再稀釋成 1 倍溶液。50 倍濃縮溶液之組成如下:( 每公升含 )
 242g Tris Base
 57.1 ml Glacial Acetic Acid
 200 ml 0.5M EDTA (PH8.0)
4. 載入膠片緩衝液 (Gel-Loading Buffer):
 0.25% BPB (Bromophenol Blue)
 + 40% (W/V) Sucrose in Distilled Water
 儲存於 4℃ 冰箱冷藏。


豬生殖與呼吸綜合症

豬生殖及呼吸症候群診斷技術

The Diagnostic Technique of PRRS

  (一) 豬肺臟巨噬細胞之製備
(The Preparation of Porcine Palmonary Macrophage)
一、 肺臟之採取
  選取 2~6 週齡健康 SPF 小豬,麻醉 ( 或電昏 ) 後剖腹,切斷後大動脈放血後解剖,以無菌止血鉗夾住咽喉頭處氣管,小心取下心肺,置無菌操作盤備用。
二、 肺巨噬細胞之收集
1. 以無菌止血鉗夾住下端氣管,剪去其上之氣管,插入無菌注射筒 ( 或漏斗 )。
2. 以 150 ml 細胞培養液*灌入肺臟,輕輕按摩後,自氣管倒出,以離心管收集之。反覆灌洗 6 至 8 次。
*細胞培養液指含有 10% 胎牛血清及一般量之 5 倍抗生素與制黴劑之 MEM。
3. 收集細胞沖洗液,以雙層細濾網過濾。
4. 將所得之細胞濾液離心收集 (4℃、280g、13 分鐘 )。
5. 棄上清液。以 10 ml 細胞培養液*沖散沉澱。收集所得之細胞懸浮液,離心 (4℃、280g、13 分鐘 )。反覆沖洗 3 次。
6. 以 10 ml 細胞生長液*懸浮最後一次離心所得之沉澱。
7. 取 0.l ml 細胞生長懸浮液以 PBS 適當稀釋混和後,加入等量之 Trypan Blue 水溶液**,混合均勻。
**Trypan Blue 水溶液:
 1.60g Trypan Blue 粉末+100 ml 生理鹽水泡製備用。
8. 吸取適量混和液,滴入細胞計數盤,計算大而光亮之細胞顆粒 ( 藍色顆粒為死細胞 )。所得每 lmm2 之平均細胞數以下式計算之,即得細胞總數。
巨噬細胞總數 =lmm2 之平均細胞數 × 計算室和蓋玻片之間隔逆數 × 稀釋倍數。
例如稀釋 20 倍後,1mm2 中有 40 個細胞,則:
巨噬細胞總數 = 40 × 10 × 20 = 8,000 ( 個 / mm3)= 8.0 × 106 ( 個 / ml)。
9. 視培養目的,下表稀釋分裝之。
培養容器
細胞數
99 孔培養盤
1.8 × 105 個/孔
25cm2 小角瓶
l2 × l06 個/瓶
75cm2 小角瓶
35 × l06 個/瓶
175cm2 小角瓶
82 × l06 個/瓶
10. 分裝後置 37℃ ,5% CO2 恆溫箱內培養備用。
三、 冷凍保存
1. 以含 10%DMSO 及 20% 胎牛血清之 MEM 將細胞稀釋成 1.5×l07 個/ml 後分裝於安瓶內。
2. 先將安瓶置 4℃ 2 小時冷卻,而後於 -70℃ 冷凍庫一夜再移入液態氮桶內保存。
 
(二) ELISA 診斷法
(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)
一、 抗原盤之製備:
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤,第 1、3、5、7、9、11行加入經 PBS 適當稀釋之病毒液(Ag+) (0.l ml/ 孔 ),而第 2、4、6、8、10、12 行則加入等倍稀釋之巨噬細胞液 (Ag-)。
2. 覆蓋膠膜,於 37℃ 恆溫箱中感作 1 小時後,置 4℃ 冷藏一夜備用。
二、 血清稀釋:
1. 稀釋液:含 10% 胎牛血清及 2% Casein 的 PBS 溶液。
2. 於試管內將血清稀釋 100 倍備用。
三、 試驗步驟:
1. 去除膠膜,甩棄抗原液,以含 0.1% Tween 20 之 PBS(PBS-T) 浸洗 3 次#後甩乾。
#每次浸泡 5 分鐘。
2. 每孔加入 0.1 ml 血清稀釋液##,置 37℃ 恆溫器感作 1 小時。
##每頭兩孔 (Ag+ 與 Ag -各一孔),而對照孔 B3、B4、B9 及 Bl0 加入已知陽性血清,C3、C4、C9 及 Cl0 加入已知陰性血清。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D

3. 甩棄血清稀釋液,以 PBS-T 浸洗 3 次#後甩乾。
4. 將適當稀釋之山羊抗豬 IgG 結合酵素 (Goat-Anti-Swine IgG Peroxidase Conjugate)0.1 ml 加入,於 37℃ 恆溫器內感作 30 分鐘。
5. 甩棄酵素,以 PBS-T 浸洗 3 次#,甩乾。
6. 每孔加入 0.1 ml 受質###,置 37℃ 搖擺器上作用 15 分鐘後,加入 0.05 ml 硫酸 (1N),作用 5 分鐘後以光度比色機測定 OD 值。
###受質之泡製:
OPD(O-Phenylendiamine Dihydrochloride)

l0.0 mg

醋酸緩衝液 @
22.0 ml
9% 雙氧水 (H2O2)
0.022 ml
於不透明玻璃瓶中混和均勻後備用。
@ 醋酸緩衝液:
  取 0.58g 醋酸鈉 (Sodium Acetate Anhydrous-CH3COONa) 加 200 ml 蒸餾水,完全溶解後,再以 lN 醋酸 (Acetic Acid-CH3COOH) 調整酸鹼度至 pH=5。4℃ 保存備用。
☆本受質為致癌劑,請小心操作。             
7. 判讀:
計算下列各值:
 (1)P=1 / 2 OD ( B3-B4+B9-B10 )
 (2)E=OD (Ag+) - OD (Ag-)
 (3)S / N= OD (Ag+) / OD (Ag-)
  當 E / P > 0.4
    S / N > 1.5
  判定為陽性。    
  (三) IPMA 診斷法
(lmmuno-Peroxidase Monolayer Assay)
(A) 病毒分離:
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤,每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 (2×106 個細胞/ml),於 37℃ 5% CO2 恆溫器中培養 2 小時。
2. 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液&行 10 倍稀釋之血清 ( 未經非慟化 ) 或乳劑,覆蓋膠膜,置 37℃ 5%CO2,恆溫器中培養 2~5 天。
&細胞生長液:
  含 10% 胎牛血清、200 U/ ml Penicilline、0.2 mg/ ml Streptomycine 及 80 U/ ml Polymyxine B 之 MEM。
3. 當 10~20% 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出,以含 0.1% Tween 20 之 PBS(PBS-T) 快洗 1 次,浸洗 1 次&&後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。若培養 5 天後仍無細胞變性發生,需繼代 3 次以確診。
&&每次浸泡 5 分鐘。
4. 完全乾燥後,每孔加入 0.1 ml 4% 福馬林液,於 4℃ 固定 15 分鐘 ( 或於 -20℃ 以 80%丙酮固定 45 分鐘 )
5. 甩棄固定液,以 PBS-T 快洗 1 次,浸洗 2 次&&後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
6. 每孔加入 0.05 ml 適當稀釋之標準陽性血清,進行 B 之試驗步驟。
(B) 抗體測定:
1. 抗原盤之製備:
(1) 取無菌平底 96 孔細胞培養盤,每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 ( 內含 2×106 個細胞/ml),於 37℃ 5% CO2 恆溫器中培養 2 小時。
(2) 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液稀釋,含 1.5×103 TCID50/ ml 之病毒液,置 37℃ 5%CO2 恆溫器中培養 20~24 小時。
(3) 當 10~20% 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出,以含 0.l% Tween 20之PBS(PBS-T) 浸洗 2 次&&後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
(4) 完全乾燥後,每孔加入 0.1 ml 4% 福馬林液,於 4℃ 固定 15 分鐘。
(5) 甩棄固定液,以 PBS-T 浸洗 2 次&&後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥後密封,貯存於 -2O℃ 冰庫備用。
2. 血清稀釋:
(1) 稀釋液:含 10% 胎牛血清及 2% Casein 的 PBS 溶液。
(2) 於試管內將血清稀釋 50 倍 ( 當作血清原液 ) 後,取出 0.1ml 加入等量稀釋液行 2 倍速續稀釋 。
3. 試驗步驟:
(1) 待抗原盤回溫後開封,以 PBS-T 浸洗 2 次&&後甩乾。
(2) 每孔加入 0.05ml 稀釋液,置 37℃ 恆溫器內 30 分鐘使飽和。
(3) 以 PBS-T 浸洗 2 次&&後甩乾,加入 0.05ml 血清稀釋液,於 37℃ 感作 45 分鐘。
(4) 甩棄血清稀釋液,以 PBS-T 浸洗 4 次&&後甩乾。
(5) 加入適當稀釋的山羊抗豬 IgG 結合酵素 (Goat-Anti-Swine IgG Peroxidase Conjugate) 0.05 ml ,於 37℃ 感作 45 分鐘。
(6) 甩棄酵素液,以 PBS-T 浸洗 4 次&&,甩乾。
(7) 每孔加入 0.05ml 受質&&&,於 37℃ 作用 15~20 分鐘。
  &&&受質之泡製:
3 Amino-9-Ethy1 Carbazol 2.0 mg
N, N Dimethylformamide 0.3 ml
醋酸緩衝液 @ 5.0 ml
9 % 雙氧水 (H2O2) 0.01 ml
於不透明玻璃中混和均勻後備用。
@醋酸緩衝液:
取 0.58g 醋酸鈉 (Sodium Acetate Anhydrous-CH3COONa) 加 200 ml 蒸餾水,完全溶解後,再以 1N 醋酸 (Acetic Acid-CH3COOH) 調整酸鹼度至 pH=5。 4 ℃ 保存備用。
☆本劑為致癌劑,請戴手套於抽氣裝置下小心操作。
(8) 甩棄未作用之受質以 PBS-T 浸洗 2 次&&。每孔加入 0.1 ml PBS-T,於光學顯微鏡下判讀。細胞內有紅色受質者為抗體陽性。
 
(四) IFA 診斷法
(Indirect Immunofluorescence Assay)
(A) 病毒分離:
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤,每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 (2×106 個細胞/ml),於 37℃ 5% CO2 恆溫器中培養 2 小時。
2. 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液$行 10 倍稀釋之血清 ( 未經非慟化 ) 或乳劑,覆蓋膠膜,置 37℃ 5% CO2 恆溫器中培養 2~5 天。
$細胞生長液:
  含 10% 胎牛血清、200 U/ ml Penicilline、0.2 mg/ml Streptomycine 及 80 U/ ml Polymyxine B 之 MEM。
3. 當 10~20% 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出,以含 0.1% Tween 20 之 PBS(PBS-T) 快洗 1 次,浸洗 1 次$$後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5小 時乾燥。若培養 5 天後仍無細胞變性發生,需繼代 3 次以確診。
$$每次浸泡 5 分鐘。
4. 完全乾燥後,每孔加入 0.1 ml 4% 福馬林液,於 4℃ 固定 15 分鐘 ( 或於 -20℃ 以 80% 丙酮固定 45 分鐘 )
5. 甩棄固定液,以 PBS-T 快洗 1 次,浸洗 2 次$$後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
6. 每孔加入 0.05 ml 適當稀釋之標準陽性血清,進行 B 之試驗步驟。
(B) 抗體測定:
1. 抗原盤之製備:
(1) 取無菌平底 96 孔細胞培養盤,每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 ( 內含 2×106 個細胞/ml),於 37℃ 5% CO2 恆溫器中培養 2 小時。
(2) 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液稀釋,含 1.5×103 TCID50/ ml 之病毒液,置 37℃ 5%CO2 恆溫器中培養 20~24 小時。
(3) 當 10~20% 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出,以含 0.l% Tween 20 之 PBS(PBS-T) 浸洗 2 次$$後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
(4) 完全乾燥後,每孔加入 0.1 ml 4% 福馬林液,於 4℃ 固定 15 分鐘。
(5) 甩棄固定液,以 PBS-T 浸洗 2 次$$後甩乾,置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥後密封,貯存於 -2O℃ 冰庫備用。
2. 血清稀釋:
(1) 稀釋液:含 10% 胎牛血清及 2% Casein 的 PBS 溶液。
(2) 於試管內將血清稀釋 50 倍 ( 當作血清原液 ) 後,取出 0.1 ml 加入等量稀釋液行 2 倍速續稀釋。
3. 試驗步驟:
(1) 待抗原盤回溫後開封,以 PBS-T 浸洗 2 次$$後甩乾。
(2) 每孔加入 0.05 ml 稀釋液,置 37℃ 恆溫器內 30 分鐘使飽和。
(3) 以 PBS-T 浸洗 2 次$$後甩乾,加入 0.05 ml 血清稀釋液,於 37℃ 感作 45 分鐘。
(4) 甩棄血清稀釋液,以 PBS-T 浸洗 4 次$$後甩乾。
(5) 關燈,加入適當稀釋的山羊抗豬 IgG 螢光標示抗體$$$ 0.1 ml,於 37℃ 感作 45 分鐘。
$$$含 1% Evans Blue 之 Fluorescein(FITC)-Conjugated Goat Anti-Swine IgG(H+L)
(6) 關燈下甩棄抗體液,以 PBS-T 快洗 1 次。
(7) 每孔加入 0.1 ml PBS,於螢光顯微鏡下判讀。細胞內有綠色螢光者為抗體陽性。
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