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牛布氏桿菌病
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作者: 吳義興
詳細內容:

一、病名及病原

  布氏桿菌病又稱 Bang 氏病,或傳染性流產。牛之布氏桿菌病由流產布氏桿菌( Brucella abortus)所引起。一般稱布氏桿菌病仍指各種布氏桿菌在哺乳類所引起之病症,但若提到牛,則指流產布氏桿菌(Brucella abortus)所引起之病症。流產布氏桿菌有 9 個生物型,各型在生化上及血清學反應彼此不同,但均會被流產布氏桿菌嗜菌体所分解,且於氧化代謝試驗均有特徵性。

二、病病簡介

   布氏桿菌病為一種細菌性急性或慢性傳染病,以胎盤炎及流產為特徵。流產布氏桿 菌除感染牛外,很少感染其他動物,但常會感染人類。

三、典型之臨床症狀及病理變化

  牛布氏桿菌病主要之臨床症狀是流產,它常發生於接近分娩期。自然感染在懷孕第 6-8個月發生率最高。流產後 1-2 週會有混濁之子宮分泌液排出,懷孕後期之流產常會發生胎衣滯留。

  牛群之感染主要由引入帶菌牛隻而起,污染擴散後,初次爆發流產,其流產率可達 30%以上,而後流產率逐漸下降,但在牛群中之第 1 胎懷孕牛或新引進未感染牛仍會有很高之流產率。公牛感染時,早期發燒伴以一側或雙側之睪丸及精囊急性腫痛,數週後症狀消失,睪丸變大而硬,精液中含炎症滲物及活菌。病灶大部僅限於生殖系統,胎盤炎,胎盤及其四週組織充滿滲液及壞死組織而使其呈灰色到黃色。子宮壁,尤其在子宮角彎有水腫,子宮絨毛膜間充滿細菌、滲液及鱗脫之絨毛細胞。感染之睪丸及細精管組織含炎症滲出液及壞死區,到感染後期,睪丸組織由於壞死而萎縮及纖維性增生。

四、應採病材

  細菌之分離及鑑定為本病最可靠之診斷方法。細菌學分離之樣品為:

(一)

子宮滲出液;流產期及流產後 1-2 週。在此期間內,以滅菌棉棒放入陰道抹拭,拭後把棉棒放入滅菌之試管中,密封後送檢。

(二) 流產胎兒之胃內容物、肺、脾及胎糞作細菌學培養檢查最有價值。胃內容物之採取法;以熱壓舌片燒灼胃壁,再以滅菌之吸管穿過燒灼區,取一些內容物入滅菌之容器中。肺、脾及胎糞則以無菌操作採取病材,放入滅菌容器中,立即送試驗室。
(三) 胎膜,由布氏桿菌感染而引起之流產,在胎膜中常含有大量之布氏菌,胎膜應仔細檢查,採取呈暗灰黃色之整個子葉放入滅菌容器中。
(四) 乳液,乳房感染布氏桿菌常局限於一或數個乳房,故乳液病材最好各乳房均各採集約20 ml。採集前乳房先洗淨,乳頭以酒精消毒並擦乾後,先擠棄 1-2 ml,再擠乳液入滅菌之容器中,冷藏保存並速送檢。
(五) 血液;在發病期之牛血中亦會有布氏桿菌之存在,血液以抗凝劑抗凝,採集後冷藏立即送檢。
(六) 動物屍体,布氏桿菌對不同之動物有不同之偏好,故採取作為分離之組織在牛依序為;乳房淋巴結,咽背淋巴結,腸間淋巴結,腰淋巴結,脾臟,各對乳房組織,及子宮。在山羊及綿羊則為;乳房淋巴結,頜下(或咽背)淋巴結,腸間淋巴結,每邊之乳房組織,子宮,及脾臟。淋巴組織週圍以噴燈略作消毒後,以滅菌之器械切下於滅菌容器中,冷藏送檢。


五、綜合診斷

(一)

病原分離及同定
  分離使用Trypticase soy agar(BBL),Tryptic soy agar,Tryptose agar(DIFCO)或 Dextrose agar等培養基,加5%馬血清。為防止污染可使用選擇培養基,上逑加血清培養基,每1,000ml 添加 cycloheximide 100mg,Bacitracin 2,500IU,poly-myxinB 6,000IU,及 1:800,000 ethyl violet。Cycloheximide 1g 溶於 5ml 之acetone 後,再加滅菌蒸餾水到 100ml,混合後分裝保存冰箱可使用 6個月。Bacitracin 及 PolymyxinB 則分別以滅菌蒸餾水溶成每ml 含 2,500IU 及 6,000IU 之液,分裝凍結保存,前者使用期 2週,後者使用期較長,但溶解後剩液應棄之。Ethylviolet 可用 0.1%液,但使用期勿超過 3 個月。
  病材之接種方法;陰部棉拭可直接塗佈培養基表面。流產胎兒之胃內容物,以白金耳或棉拭塗抹培養基表面,胎糞可直接塗抹培養基,胎兒組織以刀或剪切片再作塗抹培養。胎膜較易污染,故培養前應以滅菌生理鹽水清洗 3 次以上,洗後以滅菌刀剪切片,塗於固体培養基表面。牛乳以 6,000-7,000g 15 分鐘離心後,取其沉澱物及乳脂塗抹於固体培養基表面。血液在培養前有人先予冷凍解凍處理,但亦有直接培養者,血液培養通常使用 Castaneda 血液培養瓶,為扁平瓶一面有固体培養基,而其下部則為含抗凝劑(2% 枸櫞酸鈉)之液体培養基,血液樣品若未混合抗凝血劑,則抽血後應立即放入瓶中與含抗凝劑之培養液混合,在固体培養基作全面接種後,瓶應直立放置,每 3 天檢查 1次,若無可疑菌落出現,則把瓶側傾讓液体流到固体培養基上,然後放直立再繼續培養。由大動物採得較大塊之組織可通過火焰或浸乙醇再以火焰燒烤滅菌,之後組織以刀剪切片,切面塗抹於培養基之表面,小動物之小塊組織應儘可能無菌採集,以避免塗抹前之火焰消毒,組織病材亦可在去油脂後,剪取無污染之部份作成乳劑後塗抹培養。
  病原菌之動物接種分離:病材若無污染,為加強之分離率,對含菌量較少之組織、分泌物及排泄物,可把病材乳劑腹腔內接種 2 到數頭天竺鼠,如為牛乳或巳分解之動物組織,則以皮下或肌肉內接種為宜。牛乳離心後取其沉澱及乳酪混合物接種,若固体病材則加少量滅菌生理鹽水再以乳化器乳化後接種。接種後第 3 週及第 6 週各剖檢半數之接種鼠,剖檢前均採血測試驗血清凝集力價。但病材若嚴重污染,接種之天竺鼠常會在數天內死亡。病材若含本病原菌,則剖檢可見淋巴結、脾臟與四肢關節腫大,肝臟壞死病灶,睪丸及副睪膿腫等病變。然後以無菌操作,由其脾臟、淋巴結或其他病灶組織切面再分離病原菌,此時可用不加抗生素及色素之血清培養基。血清凝集試驗若為陽性,即使分離未呈陽性亦確認為陽性。
  病材接種培養基後放 10%CO 恆溫箱,37℃經 5-7天,布氏桿菌在選擇培養基上形成帶青色透明小圓形菌落,流產布氏桿菌通常為平滑型菌落。菌落初步之鑑定可在玻片上放 2 滴生理鹽水,由菌落取下一些菌体懸於其中,再分別各加 1 滴抗流產布氏桿菌血清及正常血清,混合後檢查有否布氏桿菌之特異性凝集現象。
  布氏桿菌呈桿狀或球桿狀,在組織中呈團塊或單個,人工培養有時呈短鏈狀。無運動性及芽胞,初分離時偶而有莢膜。革蘭氏陰性菌,雖非抗酸菌,但可抗弱酸脫色,此特性可供本菌之鑑別染色用;Modified Ziehl-Neelsen method:細菌塗片火焰固定後,以稀釋 10倍之 Ziehl-Neelsen carbol fuchsin 液(Basic fuchsin 1g,絕對酒精 10ml,5% phenol 90ml)染色 10分鐘,水洗,以 0.5% 醋酸脫色 10-30秒,水洗後以 1% 之 methylene blue 作對比染色 20秒,結果菌体呈紅色而背景為藍色。Modified Koster method:細菌火焰固定片以 2份飽和 safranin液與 5份 1M KOH 混合液染色 1分鐘,水洗,以 0.1%硫酸脫色 10-20秒,水洗後以 1% methylene blue 作對比染色 20秒,結果本菌成橙紅色而背景為藍色。
  布氏桿菌於blood agar不產生溶血,在 MacConkey agar 上有些菌株會發育但絕不會發酵 lactose,在含 1%glucose 之 phenol red agar 中,不會利用 glucose 產酸而使其變色。布氏桿菌各菌種間之形狀及代謝極相近,但可以表 1 之性狀予以區別之,其中之色素發育試驗,色素先以蒸餾水泡成 0.1%液,放蒸氣中 20分鐘或沸水中 1小時滅菌後,依所需量加入溶融之布氏桿菌用培養基而使用。

(二) 血清學診斷
  由於操作簡單及可靠性很高,血清學試驗已被廣泛應用以診斷布氏桿菌病。
1. 凝集試驗
血清凝集試驗為牛及人類布氏桿菌病主要使用之血清學方法。
a. 標準平板凝集試驗:
抗原:

平滑型全菌(約 4%)懸於 0.5% 石碳酸生理鹽水,以國際或國家標準血清調節其精確濃度為 30 國際標準單位(IU)之血清可產生凝集而 20 IU 者則否。

操作步驟: 在攝氏二○度至二五度溫度下,玻璃板上放 1 滴抗原與 1 滴血清混合,5 分鐘內產生凝集塊者為陽性反應,否則為陰性。
判定標準:  
區 分 判 定 要 領 國 際 單 位
陰 性 不凝集或十分鐘以上凝集者 未滿二○IU
疑陽性 六分鐘以上未滿十分鐘凝集者 二○IU以上未滿三○IU
陽 性 五分鐘以內凝集者 三○IU以上
b. 緩衝布氏菌抗原(Buffered Brucella antigen,BBA)
  標準平板凝集抗原之敏感性極佳,但特異性不佳,常造成很多之假陽性,為改善此缺點,把抗原懸於酸性緩衝液中,以去除其非特異性反應。
抗原:

平滑型全菌懸於 pH3.65 之 Buffer(NaOH 12g,lactic acid 54ml,加 0.5%石碳酸生理鹽水到 600ml),此種抗原稱(BBA),為使反應結果容易觀察,把加入之菌体以色素 Rose Bengal 色素染色即為目前國內使用之玫瑰苯平板凝集抗原,另美國使用之 Card test亦使用此類抗原。抗原之標準化如上之抗原調整。

操作步驟: 如標準平板凝集試驗。
c. 乳環凝集試驗
抗原:

平滑型全菌体以 Haematoxylin染色後,菌体濕重1:27(w/v) 懸於 pH4.0 之 buffer(NaCl 8.5g,phenol 5ml,1M citric acid 2.6 ml,0.5M Na2HPO4 1ml,加蒸餾水到 1,000ml)。

操作步驟: 小試管中放 1ml 經冷藏 48-72小時之乳液,加 1滴(0.03ml)抗原,以食指蓋住管口,輕輕倒轉數次以混合,直立放 37℃ 1小時後判定。
判定要領: 陽性卅:乳油層呈藍色,乳汁層(下層)呈白色。
陽性廾:乳油層呈藍色,乳汁層呈淡藍色。
陽性十:乳油層呈藍色,乳汁層較乳油層呈淡青色。
疑陽性士:乳油層與乳汁層呈同一深度藍色。
陰性一:乳油層呈白色或微呈藍色,且其顏色較乳汁層為淡。乳汁層呈藍色。
判定標準: 乳環試驗呈陽性反應者,受檢乳汁之牛群應全部採血實施血清學試驗。
d. 試管凝集試驗
抗原:

與標準平板凝集抗原相似,但濃度約為其 1/10,經以國際標準血清調整濃度,使其與 2IU 之血清呈 50%凝集。

操作步驟: 血清以 0.5%石碳酸生理鹽水,自 1:5,1:10,1:20,---,作 2倍稀釋,加入等量之抗原混合後,放 37℃ 1夜後判定。判定以血清最終稀釋 1:40(血清稀釋倍 1:20)呈 50%凝集(++)為陽性。
判定時可作如(表 2)之判定標準液作比較。
判定要領:
1. 陰性:無凝集或一○倍稀釋血清有凝集,同時二○倍稀釋血清之凝集度,低於五○﹪凝集(廾)者。
2. 疑陽性:二○倍稀釋血清之凝集度顯呈五○﹪凝集(廾)以上,同時四○倍稀釋血清之凝集度低於五○﹪凝集(廾)者。
3. 陽性:四○倍或四○倍以上稀釋血清之凝集度,顯呈五○﹪凝集(廾)以上者。
4. 本項所稱凝集度規定:
一(○): 無凝集:溷濁不澄清無沉澱,顯呈一○○﹪溷濁度。
十(一): 二十五﹪凝集:有部份凝集沉澱,顯呈七十五﹪溷濁度。
廾(二): 五○﹪凝集:有顯著凝集沉澱,顯呈五○﹪溷濁度。
卅(三): 七十五﹪凝集:接近完全凝集沉澱,顯呈二十五﹪溷濁度。
卌(四): 一○○﹪凝集:完全凝集沉澱,顯呈無溷濁度(上清液澄清如清水)

判定標準及判定實例:
判定\血清
最終稀釋倍數
十 倍 二十倍 四十倍 八十倍 國 際 單 位
陰性 ○ - 四 ○ - 一 血清力價每公撮未滿五○IU
疑陽性 二 - 四 二 - 四 ○ - 一 血清力價每公撮五○IU以上未滿一○○IU
陽性 二 - 四 二 - 四 二 - 四 ○ - 四 血清力價每公撮一○○IU以上
e. Coomb test
  有些動物血清所含之布氏桿菌病特異性抗体與抗原結合後卻不會凝集,推測仍某些抗体之抗原結合位被佔住,阻止凝集素之凝集反應,即所謂之不完全抗体。Coombs試驗仍利用 Coombs試劑,引起凝集反應。Coombs試劑仍待測動物血清球蛋白或全血清之特異性抗血清。Coombs試驗應用於人類血清時,稱為抗人類球蛋白(anti-human globulin,AHG)試驗,應用於牛血清時亦稱為抗牛球蛋白(Anti-bovine globulin, ABG) 試驗。
抗原:

懸於生理鹽水之全菌抗原。可把試管凝集試驗用抗原離心,並以生理鹽水洗 3 次後重懸為原濃度菌液而使用。

操作步驟: 待檢血清以生理鹽水稀釋後,加作等量之抗原液,放 37℃ 1 夜,無凝集反應之試管離心 2500g 20分鐘,倒去上清液,離心時應避免溫度上升使抗体與抗原之結合脫離。沉澱以生理鹽水洗 3次,第 3次之離心沉澱懸於原量之生理鹽水稀釋定量之 Coombs試劑。試管再放於 37℃ 24小時後,依一般凝集試驗作判定。其力價通常以呈 50%或以上凝集之最高最終稀釋倍數 1:40或以上為陽性。
  另一種改良方法是,於最後階段改用平板試驗,在初次試驗洗 3 次後之沉澱,加入 3-4 滴之生理鹽水懸浮,取 1 滴與 1 滴稀釋 Coombs 試劑放玻璃板上,以牙籤混合,再放入密封之潮濕盒中,放 37℃ 30分鐘後,以低倍顯微鏡或放大鏡觀察。此步驟最好作一對照試驗,即玻璃板上放懸液 2滴,其中 1滴與 1滴稀釋 Coombs試劑混合,另 1滴與 1滴生理鹽水混合,放 37℃ 30分鐘後判定,如此可知其凝集是否為特異性之反應。
2. 補体結合試驗
  免疫球蛋白與抗原結合後即會與補体結合而產生反應,當抗原為紅血球時則產生溶血,若抗原為微生物或其成份,雖不能產生可見之變化,但補体巳被抗原-抗体複合物利用而結合,此時再加紅血球及其免疫球蛋白,因無可利用之補体而不能產生溶血。由此而偵測血清中有否特異性抗体之存在。
抗原:

布氏桿菌全菌或其脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)抗原,其力價在一般商品化抗原約含 100倍。

材料: Barbital buffer saline(BBS):Barbital sodium 3.75g,Barbital 5.75g,NaCl 85g,MgCl2 0.475g,CaCl2 0.185g,加蒸餾水溶成 2000ml 之原液,使用時再稀釋 5倍。
補体:由 10頭以上天竺鼠採集之混合血清,分裝存於 -70℃,使用之力價為可使測定系統產生 50%溶血之 4倍強度(即4單位),補体取出使用後剩液即丟棄。
3% 綿羊紅血球:綿羊血球以 BBS 洗 3次後,懸於 BBS 中而成。溶血素,即綿羊紅血球之免疫球蛋白懸於 50%甘油液(DIFCO)者相當穩定,其溶血力價需經測定,購得之DIFCO此類產品,其完全溶血力價約為 2,000倍,因此採其略高力價,稀釋 1:1,500 而使用。3% 綿羊紅血球與等量之稀釋血紅素混合,放 4℃感作 1夜即成敏感紅血球。
操作步驟: 表3
判定要領:
1. 陰性:五倍或五倍以下之稀釋血清廿五﹪阻止溶血(十)或完全溶血(○)者。
2. 陽性:五倍或五倍以上之稀釋血清五○﹪阻止溶血(廾)以上者。
3. 本項所稱完全溶血、不完全溶血或完全溶血規定如下:
完全溶血:一○○﹪溶血一(○)
不完全溶血或:二五﹪阻止溶血 十(一)
       五○﹪阻止溶血 廾(二)
       七五﹪阻止溶血 卅(三)
完全阻止溶血:一○○﹪阻止溶血卌(四)

判定標準及判定實例如下:
判定\血清
稀釋倍數
五倍 十倍 二十倍 四十倍
陰性 ○ - 一 ○ - 一 ○ - 一 ○ - 一
陽性 二 - 四 ○ - 四 ○ - 四 ○ - 四

  當血清對照陰性(100%溶血)而血清稀釋 1:5或以上有 50% 以上溶血抑制(++)時,即為陽性。補体結合試驗之成績為目前國內布氏桿菌病血清學診斷之主要法定依攄,本試驗陽性時,即使其他試驗陰性,亦判為陽性。
3. 其他血清學試驗
  布氏桿菌病之其他血清學試驗很多,包括 Rivanol test,2-Mercaptoethanol 試驗,螢光抗体試驗,凝膠溶血試驗(Hemolysis in gel),放射線免疫試驗(Radioimmu-no assay),酵素標示免疫吸附試驗(ELISA),斑點酵素免疫吸附試驗(DOT-ELISA),淋巴球變形試驗(Lymphocyte transformation test),及皮內接種延遲性過敏試驗等,但均未正式立法應用於本病之診斷。
(三)

病理學診斷
(1)肉眼病變
  本病之病灶大部僅限於生殖系統,病情嚴重時,突發之流產,絨毛尿膜內面嚴重不均勻之水腫,胎盤水腫,胎盤及其四週組織有混濁滲出液及壞死組織。胎盤子葉由正常之粉紅色變為灰色到黃色。子宮壁,尤其孕子宮角小彎常會有水腫。有些母牛會有關節炎之滑囊炎。在公牛,感染之精囊變硬腫,單側性或雙側性睪丸炎及副睪炎,感染之睪丸變大而硬,常粘附於其鞘膜,切面常有一到數個發炎病灶或壞死。

(2)組織病理
  絨毛膜上皮細胞脫落,未脫落者細胞質脹大充滿細菌,細胞核變糢糊。子宮內膜及絨毛膜間充滿細菌、滲出液及脫落之絨毛細胞。胎盤四週炎症滲出液浸潤子宮內膜及子宮腺腔。感染之睪丸細精管有壞死區、滲出液及細菌之聚落。病情更進一步,則大部之細精管破壞或萎縮而失去作用。精囊呈慢性炎症、纖維性增生、局部腺細胞發炎及壞死。

(3)臨床病理
  孕母豬之流產、產後胎盤滯留及不孕症。公畜睪丸炎,睪丸腫大或萎縮,不孕症。

六、確診依據

  血清學陽性反應及病原菌之分離。

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八、附錄

表 1. 布氏桿菌各菌種之一些性狀比較

菌 種 CO2 HS Basic fuchsin Thionin Thionin phageTb 溶解(RTD)
需 求 產 生 1:50,000 1:25,000 1:50,000 1:50,000 1:10,000
B.melitensis
B.abortus 十(一) 十(一) 十(一)
B.suis 一or十
B.neotomae
B.ovis
B.canis

    註 +(-) :大部菌株陽性,少數陰性。
     -or+ :陰性及陽性菌株約各半。
     Tb:Tbilisi
     RTD:一般試驗濃度。


表 2 試管凝集試驗判定之標準液

添加之試劑 凝 集 程 度
石碳酸鹽水 ml 1 0.75 0.5 0.25 0
抗原(1:2) ml 0 0.25 0.5 0.75 1
清澈之百分率 100 75 50 25 0


表 3 補体結合試驗操作方法

試 劑 對 照 1:5 1:10 1:20 1:40  
BBS稀釋液(ml) 0.48︴ 0 0.2︴ 0.2︴ 0.2︴
血 清 (ml) 0.12︴↘ 0.2↘ 0.2︴↘ 0.2︴↘ 0.2︴
BBS稀釋液(ml) 0.2 0 0 0 0
抗 原 (ml) 0 0.2 0.2 0.2 0.2
補 体 (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
4 ℃ 1 夜
敏感紅血球(ml) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
  37℃ 水浴,每 10 分鐘取出搖動,經 30 分鐘後判定。
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