字體大小修改:
本省牛節肢動物媒介病毒感染症
友善列印
作者: 廖永剛
詳細內容:

前言:
  近年來,本省酪農事業隨著人民生活品質的提高,並在政府的政策鼓勵 下,酪農戶紛紛擴大經營規模及從國外 ( 尤其是美國及加拿大 ) 引進種牛以期提高鮮乳的生產量供應國民消費。因此在牛隻頭數逐年增加的情況下,對牛隻傳染病的防治和疫情監測工作須加強,以確實保護牛隻健康和提升經營效率、降低生產成本。但由於本省位於熱帶及亞熱帶氣候區,蚊蟲的孳生是非常普遍,因而一些可能由蚊蟲傳播的疾病,近年來時常在各地發生。故對本省牛群中近年來所流行的牛節肢動物媒介病毒性疾病作一簡介,及提出對疾病的診斷的方法以供同業參考。

一、節肢動物媒介病毒感染症的簡介:

(一) 節肢動物媒介病毒感染症之定義:
  所謂節肢動物媒介病毒 (Arthropod-borne viruses; Arbovirus) 感染 症,是指一些疾病的傳播是經由吸血性節肢動物為媒介(Vector),將病原由 患病的動物體傳播到另一健康的動物體,以致誘導疾病的發生,而往往造成 流行病。
(二) 節肢動物媒介病毒的種類:
  目前歸類為節肢動物媒介的病毒有 504 種 , 其中 100 種是可感染人 類, 而有 40 多種是會感染家畜的,主要分佈在五個病毒屬。表 1 列出這 些可感染家畜的節肢動物媒介病毒以供參考。
(三) 節肢動物媒介病毒的媒介:
1. 蚊(Mosquitoes)- 如傳播日本腦炎病毒
2. 糠蠓(Midges; Culicoides)- 如傳播牛赤羽病,牛流行熱,羊藍舌病等病毒
3. 跳蚤、壁蝨(Ticks)- 如傳播非洲豬瘟病毒
(四) 節肢動物媒介病毒的致病性:
1. 全身性的發熱:如牛流行熱。
2. 非化膿性腦膜腦炎:由於 Arbovirus 有神經親合性 ,故一旦感染動物後會造成動物有腦炎及神經症狀。如日本腦炎、牛赤羽病、馬腦炎。
3. 出血性症狀:病毒感染後會導致全身性出血或呈現黃疸現象,如羊的藍舌病或是人的黃熱病 (Yellow Fever disease)。
4. 流死產及異常產:因為 Arbovirus感染母畜後往往會侵害胎兒而致胎兒發生異常畸型或死亡,如牛赤羽病病毒會致胎兒腦部缺損畸型與四肢關節和脊柱彎曲、豬的日本腦炎形成死產和木乃伊胎。
(五) 節肢動物媒介病毒疾病的分佈:
  本類疾病的分佈和感受性動物的分佈與傳播的媒介之分佈有直接相關,表 2 是 Arbovirus 感染的疾病在世界上分佈的簡介。發現該類疾病多在熱帶與亞熱帶地區,但近年來因為氣候的改變,在溫帶地區也曾出現節肢動物媒介病毒感染病例,故對該類節肢動物媒介病毒的疾病須加以防治。
   以下就針對幾種節肢動物媒介病毒感染症提出簡介及診斷方法,希望在臨床診斷上能給予幫助。

二、牛節肢動物媒介病毒感染症的症狀與診斷:

(一) 牛流行熱 (Bovine Ephemeral Fever)
  牛流行熱是由桿狀病毒 (Rhabdovirus)所引起是由吸血糠蠓媒介的急性傳染病,牛隻發病時呈現短暫的高熱 (41-42 ℃ )、精神沉鬱、呼吸急促、四肢僵硬及跛足等症狀,而造成死亡或淘汰、流產、產乳量下降、導致治療費用極高及治療後乳汁中殘留抗生素或藥品而須將生乳廢棄等經濟損失。本病於 1906 年在南非首次發表,但本病早在 1867 年在非洲就曾經記載發生過。目前本病現存在的國家有非洲、亞洲、澳洲、日本及臺灣等熱帶、亞熱帶國家。引起牛流行熱的桿狀病毒是單股 RNA病毒,病毒顆粒呈子彈形或是桿狀而名之,病毒顆粒直徑為 70-80 nm,長 90-180 nm,有的呈185x75nm之圓錐型或短桿型。牛流行熱病毒感染的動物有乳牛、黃牛、水牛,甚至鹿也有類似病例。因本病不會同居感染,因此被懷疑本病是否由吸血昆虫所傳播,而由 Key(1975) 及 Standfast 等 (1973) 以試驗証實本病毒會在蚊子或糠蠓體內增殖,Davis 及 Walker (1974) 在肯亞從糠蠓及 St. George(1976) 在澳洲從蚊子身上分離到本病毒, 由此顯示本病的傳播與吸血昆虫有關。又據 Murray(1970) 報告,本病傳播之方向與風向極一致,因而主張本病之發生,係可由帶毒之吸血昆虫乘風傳播而成為感染源。本省因位處亞熱帶氣候型區,吸血蚊虫在牧場中容易孳生,因此牛流行熱疫情在本省已爆發四次,也造成酪農的重大損失,因此加強牛流行熱的預防接種是極為重要,讓牛隻隨時能保持抗體以防禦野外病毒的感染。
1. 牛流行熱之臨床症狀及病理病變
  本病為一種急性熱性傳染病, 經過 3-8 日的潛伏期後會呈現一短暫性發熱,且出現呼吸器障礙,有時併發消化器及四肢關節的異常等症狀。初發病時,在發熱前常見皮肌 ( 如背肌、後軀幹肌 ) 有寒慄,如輕症時不易發覺。發熱為本病必有症狀,體溫會突然升高至 41-42 ℃,稽留 1-2 天,最長 3-4 天後就會下降。 在發熱同時眼睛流淚,眼瞼附著分泌物,結膜充血及浮腫,鼻鏡呈乾燥狀態。呼吸器障礙為本病之特徵,突然發熱,呼吸急促,呼吸數增加 ( 70-110 次 / 分 ) ,有些病牛因呼吸困難而伸出舌頭呈開口呼吸,病牛呻吟呈現苦悶狀。由於病毒的感染在氣管引起炎症反應,而致氣管的炎症分泌物增加,由於氣管受多量泡沫性粘液所致而發生肺氣腫。因而在病情較嚴重時會導致窒息死亡。
   臨床症狀上,病牛會由咽喉頭及支氣管發出極為粗厲呼吸音,從遠處也能聽到此種異常之呼吸音。肺部聽診有高調尖銳肺泡音,並有咳嗽。其發病後食慾不振或廢絕,反芻停止,至退熱後才恢復正常。第一胃停止蠕動,因胃鼓脹或缺乏水份致胃內容乾凅,有些病牛腸之蠕動亢進,也有停止蠕動者,糞便如羊糞呈便秘,亦有排泄軟便及下痢便。大部份病牛因四肢關節浮腫及疼痛而引起跛行或不能站立,屈膝而倒臥地面。其它尚有皮溫不整、角根、耳翼、肢端厥冷亦為本病的早期症狀,此可供本病早期診斷之參考。病牛鼻鏡雖乾燥,但病牛不斷流出水樣鼻液、鼻翼擴張、粘膜潮紅,又因口內發炎,流涎甚劇而致口角周圍附著多量泡沫。尿液因發熱而減少,並排出呈混濁尿液。懷孕母牛因發熱或較嚴重者,則發生死流產的情形。
   病理病變主要於肺臟及上呼吸道。在急性感染的死亡病例往往是因為急性肺氣腫而窒息死亡,解剖病變可見咽喉頭及氣管等上呼吸道粘膜呈現充出血,肺腫大退縮不全 ( 不能伸縮 ) ,肺含多量氣體,呈間質性氣腫,較顯著病例形成如一大氣囊,氣腫有時波及橫膈膜、頸部、下腹部之肌間或皮下。肺也會出現水腫及充血,各肺小葉實質可見局限性暗紅色,如斑狀之肝變病灶。支氣管充滿黃白色黏液。心外膜可見針頭大至粟粒大出血點。肝、脾、胃等實質臟器有輕度腫脹及小壞死灶。消化道並無顯著病變,但粘膜有時可見充出血,尤其在第四胃、盲腸粘膜有漏出性出血。急性死亡病例其淋巴節會腫大及心曩液顯著增加和心內膜出血。
2. 疾病應採病材
  病材應採發病牛隻的抗凝血液約 10 ml ( 可添加肝素或是採集脫纖血) ,以冷藏方式運送到實驗室後,血液先經 2,000rpm 離心 5 分鐘, 分離出血球液及血漿,分別收集血球液及血漿後,血球液部份加入經高壓滅菌過的磷酸緩衝生理鹽水 (PBS) 至原來的採集量。經以搖晃混合後再經前述的離心方式,將上層的 PBS 溶液去除,此為血球液的第一次清洗。之後再以PBS 溶液如上述方法清洗血球液 3 次後,再以 PBS 還原為原來全血容積,經混合均勻後分裝再置入 -80 ℃冷凍保存供病毒分離用。若有發病牛經剖檢後也可採集其肺、氣管 、脾等各臟器以細胞培養液 (Eagle's MEM) 製成10 倍乳劑,經低溫離心後取上清液保存供病毒分離用。
3. 牛流行熱診斷
(1) 病毒之分離與鑑定:
  病毒分離之診斷是以上述的病材接種繼代細胞如:BHK-21、Vero 等株化細胞。培養的方式是細胞以 25 cm^2角瓶增殖成單層細胞後,再接種 0.5 ml的病材進行吸著反應一小時, 然後再加入細胞培養液3 ml後,置入 34 ℃恆溫箱中培養,在第一代培養時往往無病毒增殖的現象,往往須經過2至3次繼代才會顯現病毒增殖的病變,如有病毒增殖會形成細胞病變(CPE),可取細胞培養液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒,或是以牛流行熱免疫血清作病毒鑑定。關於病毒的分離也可以上述的病材以出生一日齡小老鼠做腦內接種,接種的老鼠若死亡或是呈現神經症狀,可將老鼠冷凍後,取出腦製成腦乳劑,以4 ℃ 3,000 rpm 離心後,取上清液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。
(2) 血清學診斷
  牛流行熱的血清學診斷方法以中和試驗為主,將牛隻發病時的血清採集 後,經過 10 至 15 天再採集發病牛隻血清,進行配對血清(Paired serum) 中和抗體檢查,以中和抗體力價升高 4 倍以上判定為牛隻感染牛流行熱 。 實施中和試驗的方法如下:
(i) 試驗用病毒保存:
  測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒,先小分裝保存於 -80 ℃冰箱中,待每次進行中和試驗時取出稀釋使用。並於每次使用前先測試其病毒力價,以病毒力價達 10^5 TCID50/ml 方可供為中和試驗使用。
(ii) 血清的處理:
  將採集的牛隻血清經分裝保存於 -20 ℃,於血清測試前,須先經非動化的處理,方法是將已溶解回溫的血清放置在 56 ℃水浴槽,經浸置 30 分鐘後,以去除非特異反應因子,然後供為中和試驗用。
(iii) 中和試驗的實施:
  取受測試血清 0.05ml,和稀釋液 (MEM) 0.05 ml 在無菌 96 孔平底力價測試培養盤上混合做兩倍序列連續稀釋 ( 稀釋倍數從 1:2 至 1:256 或以上)。試驗時並對每一血清的相同稀釋倍數做 2 個重覆。待完成血清兩倍序列連續稀釋後,經確認每個試驗孔所含溶液皆一致,始可進行下一步驟的病毒液添加。
   試驗用病毒液是由分裝保存的種毒和血清稀釋液新鮮泡製供中和試驗反應用,病毒含量為每 0.05 ml 含 200 TCID。泡製的病毒液然後以滅菌過的分裝器分別加入試驗孔中,然後經震盪混合均勻後,送入 37 ℃ 5% CO2之恆溫箱進行感作 1 小時。於感作後加入 0.1 ml 含 3x10^5 個 BHK-21細胞的細胞懸浮液,並震盪混合均勻,再以透明膠帶封住,置入恆溫箱培養觀察。經觀察 5 天後以形成單層細胞且未產生細胞病變的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 4 倍而判定為牛流行熱抗體陽性。
(3) 病理學診斷
  牛流行熱感染之牛隻病理學變化,主要在肺臟呈明顯之肺氣腫病變,肺小葉間膈擴張,大量嗜中性球浸潤於支氣管肺泡極為擴張而破裝融合成一大空洞,上皮及周圍組織,肺小葉間膈擴張,部份肺組織只因擴壓變形化,在急性期感染過的牛隻於耐過後可在四肢有關節炎的病理變化。
4. 確診依據
  目前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主,尤其牛隻在呈現體溫上升時的病毒分離率較高。而對發生牛群的配對血清檢查中和抗體反應,若發病後抗體力價較發病初的力價有 4 倍以上的升高也可判定是有牛流行熱病毒感染,此為診斷依據。
(二) 赤羽病(Akabane disease)
  牛赤羽病係由 Bunyavirus 屬的赤羽病病毒感染所造成的傳染病。赤羽病病毒最早是於 1959 年,在日本群馬縣館林市郊外的赤羽村牛舍內採集的Culex tritaneniorhychus 及 Aedes Vexans 所分離出的新病毒,故命名為赤羽病毒。赤羽病是病毒感染後引起母牛的流、早、死產或先天性的關節彎曲症與水腦症症候群,主要是對牛、綿羊及山羊引起生產異常仔畜的疾病。本病在 1972- 1975 年曾在日本關東以西大流行。其他在澳大利亞、以色列、土耳其及南非等國家亦有發生。本省近年來在夏季時常有牛隻發生精神異常、神經症狀無法站立及非化膿性腦膜腦炎的病例,於 1992 年的 7至 8月間,分別在台南縣發生母牛流死產的牧場仔牛血液及屏東縣小牛非化膿性腦炎發生牛場,首次由血液中分離到赤羽病毒,經證實是赤羽病病毒的入來株(Iriki strain),而証實台灣有赤羽病病毒感染的病例發生。本病毒是經由吸血昆蟲 ( 糠蠓 ) 媒介感染的疾病,故本病也被歸類在節肢動物媒介病毒感染症。
1. 臨床症狀及病理變化
  本病的病型分為流死產、體形異常或畸形(先天性關節彎曲症,內水腦症)和仔牛非化膿性腦膜腦炎症狀等 3 種。在日本發生的疫情是流產多發生在每年 8 至 9 月發生間,而後流產及早產且數量激增,至 10 月為最高峰然後漸減。同時關節彎曲症及伴隨內水腦症的體形異常仔牛則慢速增加,至 12 月激增而在 1 月達高峰,死產亦以 1 月為高峰至 5 月才終止發生。本病具有季節性及地域性之發生。 赤羽病的流行,約 3-5 年為 1週期,此係飼養牛的新舊牛更新較頻繁,致未獲免疫之牛被感染所致。
  本病在臨床上母牛於病毒感染時及懷有異常胎牛期間,並無明顯症狀。而母牛發生流產往往是懷孕初期(2-4 個月齡)受到病毒感染時較易發生。懷孕前期感染之流產胎兒外觀近似正常胎兒,但亦有長期留於胎內而形成木乃伊胎者。早產和死產者多有體型異常或是大腦缺損,異常仔牛體重較輕且或是四肢屈折無法站立。出生後會有間歇性癲癇樣發作,頭頸部反張等神經症狀,能站立的仔牛呈茫然佇立及迴旋運動。病牛吸吮母乳能力微弱,甚至要以人工輔助哺乳,同時也出現視力障礙及眼球白濁症狀。而出生後仔牛感染病毒則往往形成神經症狀,如精神異常、後肢麻痺無法站立的症狀,或是伴隨其它感染而有非化膿性腦膜腦炎的症狀。
   關節彎曲症是母牛懷孕 4-5 月齡時受到病毒感染而造成畸型, 前肢的腕關節、肘關節和肩關節一側或兩側均有,若左右均極度彎曲則多伴有大腦缺損。後肢發生彎曲的情形較前肢少,也多發生在膝關節。彎曲程度由外觀看無異常但走路步樣不靈活而以蹄尖著地走,四肢僵硬且起立困難。關節有的屈曲固定而無法伸長,有的則不能屈曲而呈伸展狀態。脊椎彎曲症與四肢關節彎曲同時出現,脊椎常向側方呈S狀彎曲或向背方彎曲,有的則可見斜頸、頸部扭曲和不正咬合。至於骨頭的數目和大小及關節面均無變化。大腦缺損(內水腦症)外觀可發現視力減退,盲目、眼反射消失、角膜白濁、發炎、潰瘍等眼睛異常。容貌癡呆,有時頭部外觀膨大,顏面左右稍扭曲,多呈遲鈍但有些稍有神經過敏。
  赤羽病的病理變化在中樞神經及骨骼肌或是體形異常的病例可以發現明顯病變:
(1) 非化膿性腦脊髓炎:在中樞神經組織中可見血管周圍之圍管現象,圍管細胞種類以漿細胞及淋巴球為主。
(2) 大腦缺損:在肉眼上可見各種形狀之大腦缺損,該部位的腦實質與軟腦膜之間,常滯留腦脊髓液,在組織病理學檢查可見大腦表層之灰白質有一部分脫落,白質直接接到軟腦膜,在灰白質脫落部周圍的白質發生裂隙。
(3) 脊髓腹角的神經細胞消失與減數:脊髓的腹角,組成運動性中樞的神經細胞消失或顯著的減少。
(4) 骨骼肌病變:肉眼病變呈白色或黃色,失去光澤與彈性,呈水腫樣或膠樣,肌束本身短小,容積也顯著的減少。
(5) 矮小肌症:在同一肌束內有多種形態的肌纖維,多數的肌束由矮小肌纖維所成。矮小肌症出現在體形異常的部位,如彎曲的四肢,斜頸的頸部,彎曲的背部或顏面的骨骼肌為多。
2. 應採病材
  進行病毒分離的材料,是採集流產胎兒的腦、脊髓或是胎盤。對發生無法站立而淘汰的牛隻,經剖檢檢查後採集的各臟器,以培養液 (GIBCO Co.)添加抗生素製成 10 倍乳劑,經低溫 2,500rpm 離心後取上清液保存,供病毒分離用。
  現場懷疑病例的牛隻則採集加抗凝劑全血,所採集的病材再依上述牛流行熱病材的處理方法,將血樣液血清洗 3 次反分裝冷凍供病毒分離用。
3. 跳蚤、壁蝨(Ticks)- 如傳播非洲豬瘟病毒
(三) 赤羽病診斷
1. 病毒之分離與同定病毒分離用細胞:
  主要使用 HmLu-1 及 BHK-21 繼代細胞。細胞培養用培養液是以 Eagle's MEM,添加 8% 胎牛血清,並以 7.5% NaHCO3調整 pH為 7.0-7.2。以 24 孔組織培養盤先行培養形成單層細胞,於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞,然後接種 0.2 ml 臟器的乳劑上清液或是血球液,在 37 ℃ 5 % CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。再將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 1 次,然後加入含 2% V/V Bovine Serum Albumin 及10%V/V Tryptic Phosphate Broth (以 7.5% NaHCO3 調整 pH7.0-7.2) 的細胞培養液 1ml 再送入 37 ℃ 5% CO2 的恆溫箱中培養,並觀察 2-7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生,必須再做 2 至 3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可進行電子顯微鏡檢測,或是血清中和試驗作為診斷依據。
  從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液,先以 3,000 rpm 離心 30分鐘去除雜質,然後再以超高速離心 10 分鐘 (90,000 rpm 氣動式離心機)。取出沉澱物經負染色後,以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。赤羽病病毒的型態為圓型或卵圓型,並且有外套膜包被著,病毒顆粒大小為 90 至 100 nm。
2. 血清中和試驗檢測:
  血清中和試驗的方法可依上述的牛流行熱檢測方法準備及進行。
3. 血球凝集抑制法試驗(Hemagglutination Inhibition test;HI)
  牛赤羽病病毒經証實可對鵝的紅血球有凝集性,因而可藉此特性進行血清學的 HI 力價測試,以証實有無抗牛赤羽病的抗體,而可檢測出是否受病毒感染。該試驗所用之病毒抗原是以哺乳鼠腦內接種增殖病毒後濃縮而成。試驗時先進行病毒凝集抗原的力價測試,所用的抗原稀釋液是硼酸緩衝鹽水(BBS,PH=6.0)(附錄 1),進行 2 倍序列連續稀釋(附錄 2),再加入0.3% 以磷酸緩衝鹽水 (VBS ; 附錄 1) 稀釋的鵝紅血球懸浮液,經震盪後放置在室溫一小時反應後判定抗原紅血球凝集力價。而進行血清 HI 反應時是用 4 單位的紅血球凝集力價。
  牛血清在進行 HI 測試前須先以保存在 -20 ℃的丙酮液 (Acetone)處理兩次,方法是取未經非動化之血清 0.2ml 於小試管加 2ml 之冷丙酮液後振盪 5 分鐘然後以 1,500rpm 遠心 5 分鐘,去掉上清液,依此做兩次,剩下血清沉渣物附在試管壁,放入真空乾燥器以真空幫浦減壓乾燥,然後加2ml BBS,以橡皮塞栓塞後加以振盪放置在 4 ℃一夜讓附在試管壁的血清沉渣物溶解,再加入以生理鹽水洗淨的新鮮鵝紅血球液 0.1ml,在室溫進行非特異性物質吸附 30 分鐘,再以 2,000rpm 遠心 5 分鐘。取其上清液於另外試管中 56 ℃ 30分鐘非慟化以此處理之血清即為稀釋 10倍之血清。
  處理過的血清以 BBS 稀釋液做 2 倍序列連續稀釋(附錄 2),及加入含 4 HA 單位的病毒液 0.025 ml,經震盪均勻後放在室溫感作 60 分鐘,然後才加入 0.3% 鵝紅血球懸浮液 0.025ml,經震盪均勻靜置在室溫反應後判定。以抑制病毒凝集血球的最高稀釋倍數定為 HI 力價。並以 HI 力價大於或等於 10 倍而判定為牛赤羽病抗體陽性。
4. 病理學診斷
  進行赤羽病的病理學診斷,主要是在中樞神經及骨骼肌或是體型異常的病例可以發現明顯如上述的病變。
(四) 確診依據
  目前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主,尤其牛隻在呈現神經症狀初期的血液或是流產胎兒所採集的病材病毒分離率較高。而發生牛群的抗體反應也可為診斷依據。

三、藍舌病 (Bluetongue)

  藍舌病係由里奧病毒科 (Reoviridae) 之環狀病毒 (Orbivirus) 屬中的藍舌病病毒感染引起的牛隻傳染病。本病在國際畜疫會議 (OIE)中是列為家畜類和野生動物反芻類的 A 級傳染病,同時在我國也是將此病列為甲類法定傳染病。藍舌病主要感染綿羊,其次為山羊和牛。野生反芻動物則以鹿感受性最高,羚羊、巨角野羊等亦會感染。因本病最早在綿羊發現,臨床症狀顯現舌頭發紺呈藍紫色,故稱本病為藍舌病。本病在牛通常是呈不顯性感染而成為長期間的帶毒者,在急性病例時可在口腔、蹄冠部位或是乳頭、陰道等處的皮膚呈現潰瘍病灶。故過去亦稱本病為假性口蹄疫 (Pseudo-footand mouth disease)。本病主要發生在中國大陸、非洲、澳洲、美洲、東南亞以及日本等地區。廣義的藍舌病病毒群有 32 種血清型,一般認為是有20多種血清型,這些病毒型在凝膠沉降反應試驗或螢光標幟抗體法等血清反應均呈交叉反應。而任何一血清型病毒所產生的免疫力是無法提供足夠的保護來抵抗其它型的病毒感染。而藍舌病病毒是可透過吸血昆虫的傳播,因此在疾病歸類上也稱之為節肢動物媒介病毒性傳染病。

(一) 臨床症狀及病理變化
  本病在牛通常呈不顯性感染,但有時會有臨床症狀出現,是呈長期的病毒血症及輕微的發熱症狀。而綿羊感染後的病毒血症往往是可持續3至4週左右,藍舌病病毒主要存在紅血球內。綿羊感染後往往會有出血的病變,並在口腔內會有潰瘍病灶。另外妊娠牛感染可引起流產、胎兒大腦缺損(內水腦症)或其它畸型(如齒齦過多、體軀關節變型、無頷畸型或是凸頷畸型)。輕症型有些僅暫時性的發熱和短暫的白血球減少症,有些則會併發暫時性食慾減退或是唇、口蓋和齒齦之輕微麋爛,而這些症狀往往容易被忽略。在罹病羊,會有典型的發熱、削瘦、口腔病變跛行,與大量死亡,經常造成小羊的嚴重損失。
   急性型發生時往往是短暫性高熱(40至41℃),急促呼吸,四肢僵硬和跛行,流淚、流涎,唇、齒齦、舌頭腫脹和潰瘍,鼻鏡乾燥、龜裂和剝皮。泌乳牛乳房和乳頭腫脹,有時乳頭有潰瘍。隨疾病的進行,蹄冠部和趾間皮膚充血、腫脹、潰瘍而跛行。病牛呈現沉鬱、離群和食慾不振,死亡率低。本病多發於初夏至晚秋的雨季,且地形上處於低窪多濕地區亦較易發生本病。病媒可能是某種牛糠蠓,如Culicoidesvariipennis或Culicoidesoxystoma等。發病動物的唇、齒齦、舌頭粘膜呈充出血、水腫、糜爛及潰瘍。呼吸困難的病牛其鼻粘膜或口粘膜呈充血、水腫。在中樞神經系統有時可發現非化膿性腦膜腦炎的病灶。
(二) 應採病材
  發現牛隻有發熱或是唇、齒齦、舌頭腫脹和潰瘍現象的牛隻須採集加抗凝劑的血液供病毒分離。牛隻若解剖檢查時,應採集鼻粘膜、肺臟、脾臟、腦組織製成乳劑以供病毒分離。流產胎兒採集腦、腦脊液或是脾臟。牛隻採集加抗凝劑全血後,先經2000rpm離心5分鐘,分離出血球液及血漿,經分別收集血漿後,血球液部份再經滅菌過的PBS清洗3次後,以PBS還原為原來全血容積,再置入-80℃冷凍保存供病毒分離用。
(三) 藍舌病的診斷
1. 病毒之分離與鑑定:
  分離藍舌病病毒的方法可以用老鼠腦內接種方式或是細胞接種方式進行:老鼠腦內接種方式是選取出生3日齡的哺乳鼠,以洗淨的紅血球懸浮液0.02ml進行老鼠腦內接種,然後觀察老鼠是否有症狀或死亡,而這腦內接種方式往往也須1至2代的增殖才會有明顯的症狀或死亡。將死亡老鼠的腦組織取出以培養液製成10乳劑進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。病毒分離用細胞:主要使用HmLu-1及BHK-21繼代細胞。細胞培養用培養液是以Eagle'sMEM,添加8%胎牛血清,並以7.5%NaHCO3調整PH為7.0-7.2。以24孔組織培養盤先行培養形成單層細胞,於接種前以無菌PBS或MEM清洗細胞,然後接種0.2ml臟器的乳劑上清液或是血球液,在37℃5%CO2的恆溫箱中進行吸著作用30分鐘。再將乳劑吸出後以PBS清洗細胞1次,然後加入含2%V/VBovineSerumAlbumin及10%V/VTrypticPhosphateBroth(並以7.5%NaHCO3調整PH7.0-7.2)的細胞培養液1ml再送入37℃5%CO2的恆溫箱中培養,並觀察2-7日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生,必須再做2至3次繼代。而有細胞病變產生之上清液可進行電子顯微鏡檢測,或是血清中和試驗作為診斷依據。
  從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液,先以3,000rpm離心30分鐘去除雜質,然後再以超高速離心10分鐘(90,000rpm氣動式離心機)。取出沉澱物經負染色後,以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。藍舌病病毒的型態為球型,病毒顆粒大小為60-80nm。
2. 血清中和試驗:
  血清中和試驗的方法可依上述的牛流行熱檢測方法準備及進行。
3. 凝膠免疫擴散反應試驗(AgarGelImmunodiffusion;AGID):
  該抗原的製備,是先將病毒以HmLu-1細胞增殖或是以哺乳鼠的腦內增殖病毒後以冷凍丙酮進行抗原固定後再以PBS溶解濃縮成AGID抗原。AGID的測試是以0.9%V/VAgarose溶於生理鹽水(為0.85%V/VNaCl和0.05%NaN3的水溶液pH=7.2),經煮沸溶解製成AGID測試用的凝膠操作方法是以中央一孔置抗原(直徑4mm),周圍6孔置供檢血清(距中央孔6mm)。在37℃潮濕恆溫箱作用24小時後判定,若有抗原和抗體凝集反應發生 會有沉降線在抗原孔和血清孔之間產生,因此有沉降線產生就可判定血清有 藍舌病抗體。
4. 酵素免疫吸附法(ELISA):
  目前已有藍舌病的酵素免疫吸附法診斷套組,使用可依說明書上的方法進行。以凝膠沉降反應試驗或是酵素免疫吸附法檢查牛隻抗體的結果,往往只是証實牛隻有無感染本病,對於抗體的高低或是力價表示仍須以中和試驗進行。
5. 病理學診斷
  發病動物的唇、齒齦、舌頭粘膜呈現充出血、水腫、糜爛及潰瘍病變。呼吸困難的病牛其鼻粘膜或口粘膜會有充血、水腫現象。在中樞神經系統有時可發現非化膿性腦膜腦炎的病灶。病理學變化很難與口蹄疫、茨城病、惡性卡他熱及水泡性口炎等疾病區別,須有病毒分離和血清學檢查以供診斷。而冷凍切片的螢光抗體染色法或是過氧化酵素染色法作診斷時,必須採取新鮮病材予以急速冷凍,並予以切片後以標示抗體染色檢查有無特異的螢光色質反應。所採取臟器可選擇唇、齒齦、舌頭粘膜、脾臟、淋巴節、鼻腔上皮或是其它有病灶之處。

四、確診依據

   發病牛隻的病原分離以及病死牛隻的解剖病變是確診依據,而田間牛隻的配對血清抗體比較也可証實是否有藍舌病病毒感染。

  以上是就三種節肢動物媒介病毒感染症之疾病診斷方法做說明,請同業之工作同仁參考,並期望能對本省之疫情能加強監測以確保本省畜牧事業的發展。

表1.簡介感染家畜之節肢動物媒介病毒及引起之疾病

病毒屬名感染動物疾病名稱
Togavirvim馬馬腦炎
披衣病毒屬
Flaviviridae人、豬日本腦炎
黃病毒屬
Bunyaviridae牛、羊赤羽病
崩芽病毒屬
Reoviridae牛、羊、馬藍舌病,非洲馬病
里奧病毒屬中山病,茨城病
Rhabdoviridae牛 牛流行熱
棒狀病毒屬
(病毒譯名係依75年教育部公佈之獸醫學名詞譯之)

表2.幾種主要Arbovirus疾病在世界上分佈的情形

分佈地區主要家畜疾病
非洲及中東牛流行熱,非洲豬瘟,赤羽病,藍舌病,馬腦炎
北美洲藍舌病,馬腦炎
中美洲及南美洲非洲豬瘟,藍舌病,馬腦炎
歐洲及中亞大陸非洲豬瘟,藍舌病
東南亞洲及日本赤羽病,藍舌病,牛流行熱,日本腦炎
大洋洲及澳洲赤羽病,藍舌病,牛流行熱,茨城病
臺灣牛流行熱,日本腦炎、赤羽病,茨城病,中山病

附 錄

(一) 血球凝集抑制法之試藥配方
1. 磷酸緩衝鹽水(VBS,PH=6.0)配方(紅血球懸浮液泡製用)
氯化鈉(NaCl)1.023g
磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)1.032g
磷酸一氫鈉(Na2HPO4)0.20g
去離子水(二次蒸餾水)50ml
2. 硼酸緩衝鹽水(BBS,PH=9.0)配方(抗原及血清稀釋用)
牛血清白蛋白2.0g
精製Gelatin0.001g
氯化鈉(NaCl)0.701g
硼酸0.309g
去離子水(二次蒸餾水)100ml
(二) 牛赤羽病病毒抗原之HA與HI反應
1.

紅血球懸浮液調配法:以抗凝劑(Alserve)採集鵝血液,經棉花濾過後將血球液以2,000rpm離心5分鐘後去除血漿,再加入生理食鹽水至原來體積量震盪均勻後以2,000rpm離心5分鐘,去除上清液,經3次同樣步驟清洗血球後,取洗淨之紅血球層液和VBS液製成0.3%V/V牛紅血球懸浮液供為HA和HI試驗用。

表1. H.A.反應之方式
血清對照

稀釋倍數 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
抗原 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
稀釋液(BBS) 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
稀釋液(BBS) 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
0.3%血球懸浮液 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
振盪後在室溫靜置一小時判定
============================
判定例○○○○⊙⊙⊙ ++++---
              └→HA價判定為16倍
上述判定例其抗原1單位係為1:16,當HI反應要用4單位之抗原量,所以抗原要稀釋4倍供反應用。

表2. H.I.反應之方式
血清對照

血清稀釋倍數 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560
處理血清 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
稀釋液(BBS) 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
抗原(4單位)
振盪後室溫60分鐘靜置
0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025
0.3%血球懸浮液(VBS)
振盪後在室溫靜置1小時判定

0.05 0.05 0.05 0.05 0.05        
判定例⊙⊙⊙⊙⊙○○○ ○⊙
-   -   -   -   -   +++  +- └→HI抗體價判定為160倍

表3. 使用抗原之再檢定(以HI反應使用之抗原作HA反應,確認有無4單位)
血球對照

抗原單位 421 1/2 1/4 1/8
抗原 0.025 0.025 0.025 0.025
使及用抗原於第1.2孔 0.025 0.025 0.025 0.025
稀釋液(BBS) 0.025 0.025 0.025 0.025
稀釋液(BBS)
振盪後在室溫60分鐘靜置

0.025 0.025 0.025 0.025
0.3%血球懸浮液
振盪後在室溫靜置一小時後判定
0.05 0.05 0.05 0.05
判定例○○○⊙⊙⊙⊙ +   +   +-   --- 由上例顯示抗原使用量,有正確使用4單位。
2. 判定:HI價以完全抑制血球凝集之血清最高稀釋倍數表示,判定時應注意下面幾點:
a)血清及血球對照不呈現凝集現象。
b)使用抗原須呈4單位。
3. 注意事項 :
a)赤羽病抗原的HA價對pH的敏感性很高,當pH稍有變化會影響 HA力價故使用器具要充分洗淨,並且抗原最好是新鮮泡製。
b)使用的血球要新鮮,因為製作VAD血球懸浮液,其鹽的濃度比 較高,所以泡製後時間過長會引起溶血要注意。
c)反應用試藥液,用久後須注意其pH值的變化,最好能檢測後 再使用。
隱私權保護宣告、資訊安全政策宣告
最佳瀏覽狀態為 IE6.0 以上‧1024 * 768 以上解析度最佳
行政院農業委員會家畜衛生試驗所版權所有 © 2006 NVRI All Rights Reserved‧25158 新北市淡水區中正路 376 號