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豬   瘟
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作者: 劉培柏
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緒 言

 豬瘟 (Swine fever, Classical swine fever),又稱豬霍亂 (Hog cholera, HC),又稱歐洲型豬瘟 (European swine fever),為一種豬隻急性或超急性發熱性的病毒性傳染性疾病,以嚴重的全身性出血為主徵,死亡率極高 (Schwarte 及 Mathews 1954a, 1954b, Dunne 等 1959)。本病最早發現於北美地區的美國田納西州 (1810 年),而在俄亥俄州、印地安納州(1830 年) 亦有類似豬瘟的報導。豬瘟病例的確診首在美國愛荷華州(1893 年),而後世界各地都有發生的報告 (Hanson 1957, IVanyi 1984)。豬瘟雖已普遍發生於世界各地,但由於大多數國家的防疫單位採取嚴格的撲殺計劃,因此,澳洲、加拿、丹麥、芬蘭、英國、冰島.愛爾蘭、紐西蘭、瑞典和美國均聲稱已將豬瘟撲滅(Stewart 1981)。

  台灣在日據時代就有豬瘟發生且相當嚴重(小倉 1938)。1947 年本病發生率曾高達8.13%(陳及陳 1982)。1929 年至 1949 年間,使用寺門福馬林臟器死毒疫苗施行豬隻預防注射,此種疫苗安全性雖高,但免疫效力差(寺門 1949) 1980年至1984年間改用結晶紫豬瘟疫苗,惟由於免疫期限短,仍不理想(李等 1950,鄭等 1951,Lee 1953,林 1958)。上述兩種苗之製造都由人工感染之發病豬隻採取臟器或/及血液為材料,成本昂貴。

  Lee (1954) 自菲律賓引進美國 Leaderle 公司所開發的 Rovac 株兔化豬瘟病毐,該種毒業兔隻繼代 250 代。當引進台灣後,再以家兔連續繼代 800 餘代,成為高度兔化之豬瘟病疫苗毒株,稱為LPC株,應用作豬隻之田間免疫,有效控制豬瘟之發生(林及李1983)。而目前用於疫苗製造的種毒為 819。本株病毒稱為 LPC 乃取名紀念原株為經兔化之病毒 (Lapinization, L) 由菲律賓(Phillippine, P) Coronel 博士 (C) 贈送之,係其英文之寫(林及李 1983)。

  自 1958 年以來。台灣全面性使用此種苗,豬瘟發生率降為 0.06%,1965 年發生率再到 0.02% 以下(陳及陳 1982,林及李 1983)。林及李 (1983)綜評多年來 LPC 株病毒疫苗應用之研究報告,劉等 (1987) 和李等 (1988) 再用最近 2 年來由台灣分離的野外病毒株,作為該疫苗免疫豬隻攻毒試驗,確認疫苗病毒目前仍足以作台灣豬瘟之防疫工作。

  1966 年台灣省家畜衛生試驗所由日本引進 LOM 株豬瘟組織培養疫,田間試用時因發生意外而停用(陳及陳 1982)。1968 年該所再度由日本引進 GPE- 株豬瘟組織培養疫苗。該疫苗目前仍廣用於日本國內作豬瘟之防疫工,惟台灣經田間試驗後,認為其效力不及 LPC 株病毒疫苗而不採用(林等 1969a,謝等 1970)。

  為克服豬瘟移行抗體干擾疫苗之免疫效力,1975 年至 1977 年間,該所再由美國引進牛病毐性下痢病毒 (Bovine viral diarrhea Virus, BVDV),作預防豬瘟之試驗,實驗室雖初步證明其對豬瘟具有免疫效力且不受豬瘟移行抗體的干擾(劉等 1975a,1975b,1975c,1976),但田間應用時,其免疫效力則不甚理想(黃等 1977 )。劉( 1979 )證明經 BVDV 免疫的豬隻,雖然可耐過豬瘟強毒的攻擊,但攻毒後體常有潛伏性的豬瘟病變發生且會排毐,故採行此種異型抗原 (Heteroantigen) 作為台灣豬瘟的防疫計畫,可行性很小。

  自從 Koprowski等 (1946)和 Baker (1946) 首先用兔子作豬瘟病毐之減毐後,國內外研究者曾經研究、報告的兔化豬瘟病計有Rovac(劉等 1952),Hudson (Hudson 1953),Sharabrin 及 Ageeva 1971,Burtsev (Brutsev 1972),LPC (Lee 1954),Bulgaria(Russeff 及 Bontscheff 1958),ASV (Likhachev 及 Ageeva 1964),Suvac (Biro 等1965),IFFA(Keeble等 1966),Suiferin(Zinn 1966,Liebke 等 1969), Chinese(Aynaud 及 Asso 1970)等。其他尚有 Swivax, SFA Truvac, MLV, Jen-Sal(Van Waveren 1956, Jerabek 1964, Olah 及 Palatka 1965, Carra 1968)等病毒株。這些病毐株經開發或追試後,被認為都具有免疫效力且病原性極低。而 Stewart(1981)認為全球應用最廣的豬瘟疫苗為中國株 (Chinese strain) 兔化豬瘟疫苗。該病毒來源未明,但已有報告指出可能來自台灣的LPC株病毒(Popa 1976, Lee 及 Lai 1980,林及李1983)。1959 年我國政府曾將 LPC(等469代兔化病毒)分讓於琉球政府,供為該地區豬瘟防疫之用,至琉球歸還日本後才改採用 GPE- 疫苗。(Lin 1959)。1966 年我國政府將第 760 代兔化病毒分讓予越南政府作該病之防疫工作(Lin 1966)。1975 年則將第 816 代兔化病毒分讓予巴拉圭政府(陳等 1976a,1976b)目前有些中南美洲國家仍採用該病毒作豬瘟之防疫。

  目前國外生產之豬瘟疫苗,其成品標示由中國兔化豬瘟病毒製備的有 4 個國家,其中比利時、義大利和匈牙利產品,以兔為材料,法國產品則以小羊腎臟培養細胞來製造,並聲稱其為世界上首次以培養法製造的中國株病毒疫苗(Rhone M'erieux 1986)。上述 4 種疫苗之病毒和台灣使用的 LPC 株病,對豬和兔隻之抗原性相似(劉及傅 1988)。

  使用 LPC 株病毒製造疫苗,需利用家兔以供病情增殖,再用採集家兔的脾臟及淋巴結作為材材,致費用昂貴,又因兔源紊亂或/及供需失調,導致疫苗品質難予控制。雖然以本法製備疫苗較為簡便,但現代化疫苗製造,大都採取細胞培養法,除可保持品質並控制迷入的病毒或雜菌外,尚可有效減少組織成分的介入,以降低過敏現象的發生(王1983)。

  自1978年至1983年間,有許多的研究者嘗試將 LPC 株病毒以組織培養增殖,但由於增殖的病毒對豬隻之免疫效力不佳,而未進一步以組織培養法來作該病毒疫苗的開發(賴等 1978,1979,1981,1982,楊等 1983b)。而依台灣目前科技環境觀之,LPC 苗株病毒疫曲的製造,採用組織培養法並非困難。遺憾的是,LPC 株病毒很難直接在豬、兔或其他動物的培養細胞中增殖(林及賴 1970,賴等 1978,1979,1981,1982);假如能增殖及繼代,也會降低或失去對豬隻的免疫效力(蘇及林 1971,賴等 1982,楊等 1983b)。因此,無法以組織培養法製造疫苗。

  依據國外研究學者的報告,在培養細胞內持續感染的豬瘟病毒,於細胞繼代培養過程中,可將強毒馴化成弱毒,而對豬隻具有免疫效力,因此可開發為疫苗製造用病毒(Loan 及 Gustafson 1961,Izawa 及 Soekawa 1976,Shimizu 等 1969,Izawa 等1969,1971)。若此病毒為弱毒,則可繼續減毒,而不失其對豬隻的免疫效力(Torlone 1964,Mengeling 等 1970)。基於上述論點,劉(1988)採用 LPC 株病毒持續感染在繼代養的兔睪丸細胞中,藉此培養細胞的自然選殖,以獲取適應在組織培養法增殖的種毒,並探究此一種毒在培養細胞中的特性及持續感染病毒的兔睪丸細胞,其在形態學、細胞遺傳學及超顯微結構學上的變化,再以免疫電顯法解明 LPC 株病毒持續感染於此細胞的機序。另外探討該種毒對兔之抗原性及對豬之免疫效力,種毒用兔睪丸養細胞增殖試驗,以及試製組織培養冷凍乾燥疫苗和實施田間試驗,可作為豬瘟組織培養疫苗開發及應用之依據。

  鍾等 (1988,1989,1990) 則以 LPC 株病毒直接以株化細胞馴化,並聲稱開發出適合於組織培養之種毒,可作為疫苗之研製。近幾年來,有些疫苗製造廠商且和日本技術合作,以 LPC 株病毒研製組織培養疫苗,其商業成品之推出當指日可待了。

第一節 豬瘟病毒特性  

  豬瘟病毒目前歸類於披衣病毒科(Togaviridae)之瘟疫病毒屬(Pestivirus)(Mattews 1982, Westaway 等 1985a)。同屬中尚有牛病毒性下痢病毒和羊先天性髓質形成不全症病毒(Border disease virus);這兩種病毒和豬瘟病毒間都有共同的抗原性(Darbyshire 1960, Kumagai 等 1962, Dinter 1963, Horzinek 1973b,劉1979,Neukirch等1980,Liess 1981,Matthaeus 1981,Dahle等1987)。

1.病毒的形態及其形態發生(Morphogenesis)

  從1967年以來有些研究者以負染色(Negative stain)電顯技術作豬瘟病毒之觀察(Horzinek 等1967, Mayr 等 1967, Ritchie 及 Fernelius 1967a)。Horzinek(1973a)綜評這些報告,認為豬瘟病毒顆粒為小、球形、具套膜、直徑40~60nm的顆粒。Dunne(1975)彙集有關豬瘟病毒大小的資料(表一),指出豬瘟病毒的大小均為 38~40nm。在豬腎細胞培養馴化增殖且具細胞變性(Cytopathogenic)的病毒,具有大小不同的顆粒,其直徑約為 3~6nm、12~15nm 及 16~23nm;其中直徑 14~16nm的顆粒可能為污染的其他種類病毒 (Ritchie及Fernelius 1967a, 1967b)。病毒形狀依顆粒大小而異;大顆粒趨向於六方形或球形,小顆粒則呈圓形。

  Frost等 (1977) 以甘油及蔗糖梯度法 (Glycerol and sucrose gradient) 純化病,再以電顯觀察,估計出病毒大小為 49+-plusmn;18nm。Ho等 (1987) 以同法純化ALD、LPC及A76株豬瘟病毐,再以電顯觀察結果,認為這些病毒都有4種不同大小且帶套膜 (Envelope) 的顆粒,其直徑分別為 70+-;5、49+-;5、35+-;5及20+-;1nm。套膜外之乳突約為8~10nm。Frost等 (1977) 以 Urografin 梯度法純化的病,其直徑 47+-;5nm,而 Enzmann及 Hartner(1977),Enzamann 及 Weiland (1978) 以同法純化的病,直徑為 42+-8nm。

  豬瘟病毒感染的培養細胞或感染的臟器,經薄切片路電顯觀察,病毒顆粒之直徑為 40~53nm (Cheville 及 Mengeling 1969, Scherrer 等 1970, Schulze 1971)。Rutili 及 Titoli(1977),Rutili 等(1977) 電顯觀察罹患豬瘟病豬扁桃腺腺窩 (Tonsillar crypts) 上皮細胞,發現病毒為圓形,或略呈多方形 (Polygonal),直徑為40~45nm,含有一個 30~35nm 電子緻密(Electron-dense) 的核心。Scherrer 等 (1970) 使用PK-15細胞接種豬瘟病毒也有同樣的發現:病毒顆粒有一 29~33nm 電子緻密的類核 (Nucleoid),通常呈多方形,外被以一窄狹的套膜。在具胞膜的胞器 (Organelles) 小池中 (Cisternae) 可發現到病毒顆粒。

  感染豬瘟病毒的細胞培養上清液,用 0.5% 甲醛在 4℃ 固定 24 小時,以電顯可觀察到病毒顆粒周圍有 6~8nm 的乳突 (Enzmann 及 Weiland 1978, 1979)。Ritchie 及 Fernelius (1967B) 認為此乃豬瘟病毒的可溶性抗原。病毒經以尿素或 Nonidet P40處理,可見直徑 27+-;2nm(Horzinek 等 1971, Horzinek 1973a, 1973b) 和 29+-;3nm的顆粒(Frost 等 1977)。

表一 豬瘟病毒的大小 (Dunne 1975)

 

Horzinek (1973a, 1973b) 曾觀察豬瘟病毒的形態,而作如下的綜評:對於豬瘟病毐核蛋白衣表面模式 (Nucleocapsid surface patterns) 之對稱性研究,困難之處在於選用純化的核心顆粒(Core particles) 作負染色時,缺少明確的一面影相(One-sided image)。又由於病毒的脂質直接和蛋白衣作用,其疏水性殘基 (Hydrophobic groups) 可能干擾染色液的穿透而不易染色。此一難題目前仍未能解決。

  Scherrer 等 (1970) 報告在 PK-15 細胞增殖的豬瘟病毐,其形態上及形態發生上的特性和黃病毒科病毒極相似。細胞接種病毒後 10 小時就可檢出新合成的病毒;這些新合成的病毒大部份存於細胞的培養液,於高氏器(Golgis' apparatus) 及細胞質的小泡中(Vesicles) 也可發現,但每個薄切片只可觀察到2~3個病毒,因此,可見到的病毒數目不多,病毒顆粒直徑為 44nm,具有一緻密性的類核 (Nucleoid, 29~33nm) 及窄狹的套膜,但未見有出芽現象,因此,細胞和病毒套膜的關係仍不明。另有不少的研究者報告感染豬瘟病毒的細胞,在細胞質空泡 (Cytoplasmic vacuoles) 內可見到具套膜的病毒 (Rutili 及 Titoli 1977, Rutili 等 1977, Ho 等 1987)。這些研究,仍未能由細胞中檢出新合成的病毒核蛋白衣。

2.病毒的物理化學性質

  豬瘟病毒為單股RNA病毒,分子量約為 4×10 6daltons,其核酸具有感染力(Vaheri 等 1967a, 1967b)。該病毒的結構性蛋白質 (Structural protein) 有3種,其中兩種為醣蛋白 E1 及 E2 (Horzinek 1981),分子量分別為 55,000 daltons 及 46,000 daltons。另一種蛋白為病毒的蛋白衣 C 蛋白,分子量為 36,000 daltons (Horzinek 1973b, Enzmann及Hartner 1977)。何 (1986) 報告由ALD及LPC株病毒感染豬及兔脾組織濃縮或純化的病毐,分別有 8及2種蛋白;經純化的病毒含有2種蛋白,其分子量別為28,000 daltons 及 47,000 daltons,但由ALD株病毒感染豬隻血液純化的病毐則有 4~6 種蛋白,其分子量分別為 33,000,35,000,43,000,46,000 及 50,000 daltons。其純化的蛋白可能為蛋白衣蛋白,而封套蛋白可能於病毒純化過程流失。

  經檢酸序列分析 (Sequencing) 知其核酸約12.5kb (Meyer 等 1989,Moormann 等1990,Thiel 等1991),且只含一個開放讀碼區 (Open reading frame, ORF)。

  由較近的文獻資料得知,病毒的結構蛋白 (Structural protein) 已知有四種,其中三種為封套醣蛋白 (Envelope glycoprotein) 分別是 gb44/48(分子量約 44/48kd)、gp33(分子量約 33kd)及 gp55(分子量約 55kd),一種為核蛋白衣蛋白 (Nucleocapsid Protein),P14(分子量約 14kd)。結構蛋白的碼區 (code region) 位於靠近核酸的 5'端(Stark 等 1990,Thiel 等 1991,Rumenapf 等 1991)。其中 gp55 即所謂 E1 蛋白,是參與中和反應的主要蛋白,其他蛋白的功能則尚未明確定知。但若將 gp55 刪除 (delete),所得的疫苗雖無法測得中和力價,但免疫豬隻卻對致死攻擊有部份保護力。

  病毒的非結構性蛋白已有三種,分別是 P23(分子量約 23kd),P120(分子量約125kd)及 P75(分子量約75kd)。除了 P23之外,其他非結構蛋白的碼區都位於結構蛋白的碼區之後。

  豬瘟病毒的梯度密度為 1.15~1.17g/ml,1.14~1.17g/ml,或 1.14~1.16g/ml。經56℃60分鐘或60℃10分鐘處理,病毒會失去感染力,而經56℃30分鐘處理後之豬瘟強毒株、減毒株及弱毒株,其感染力價分別減低10,10及10 ID 50/ml。因此,Kubin 和 Aynaud 等認為豬瘟病毒的抗熱性可作為一種遺傳標誌。豬瘟病毒經凍結與解凍過程容易降低其感染力。該病毒在 4℃ 中經 96 小時,力價降低10ID 50/ml,室溫中 72 小時降低10 ID 50/ml, 37℃ 中 48 小時則降低10 ID 50/ml,而 72 小時則降低10 ID 50/ml以上。

  豬瘟病毒在 pH6~9 之間相當穩定,而於微鹼性中更佳。對低 pH 值則有敏感性。於 pH3 時病毒被破壞。因具有套膜,含有脂質成分,故對乙醚、氯仿或去氧膽酸鹽都有敏感性,對 TWEEN 80 等清潔劑、蛋白酶及胰蛋白酶等酵素亦頗為敏感。培養液中加入丫黃素 0.5ug/ml 可抑制病毒增殖。

3.豬瘟病毒的抗原型

  Pirtle 及 Mengeling 曾使用對病毒株特異性抗血清來區別 Ames 株和 331 株豬瘟強毒的抗原性,因而發現 Ames 株病毒和 331 株病毒間至少有一種不同的抗原。Aynaud等依豬瘟病毒抗原性的變異和病原性的改變,將其分為兩個亞屬:I 為弱毒株,包括 Alfort株病毒、兔化豬瘟病毒和 Thiverval株病。II為強毒株,包括 331 株病毒和引起慢性豬瘟的病毐。

  Darbyshire,Kumagai等,Dinter 發現豬瘟病毒和牛病毒性下痢病毒有抗原相關性,因而 Kamijo 寺認為可用牛病下痢病毒抗血清和豬瘟病毒中和能力的關係,將豬瘟病毒分為 H 和 B 兩型:H 型病毒能引起豬隻典型豬瘟病變,這類病括 ALD 株病野外分離病毒株; B 型則使豬隻呈慢性豬瘟感染,這類病毒包括 331 株病毒, GPE- 株病毒和某些野外分離病毒株。Shimizu 及 Shimizu 用同法作野外病毒株的分析,認為豬瘟病毒並非屬於單一型,在野外存有不同抗原性及病原性的病毒株。Lai 等以免疫擴散法區別豬瘟強毒和兔化豬瘟病。Biront 等嚐試用抗血清作野外毒株和中國株病毒之鑑,其結果也不理想。Pan 等認為以 IIPS 法,可用於檢出接種於組織培養細胞內之豬瘟病毒,而由病毒引起之斑灶形態大小可區豬瘟強毒及 LPC 株疫苗病毒。

  Wensvoort等應用豬瘟單株抗體及 IPMA 法(免疫過氧化氫酶層細胞測定,Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)作接種於培養細胞的瘟疫病毒屬病毒的檢出,並以單株抗體和冷凍切片免疫過氧化氫梅試驗(Immunoperoxidase test, IPT法)作感染於豬隻扁桃腺之該屬病原的檢出。由試驗結果顯示,單株抗體可用於中國株病毒。Hess 等曾應用 4 種豬瘟單株抗體區別 90 株野外分離病毒間之差異,但由於此等單株抗體對抗抗原的部份不明而未能如願。劉等亦曾以 A76 株豬瘟強毒為抗原備製單源抗體應用該單源抗體,以 IPMA 法雖可檢出細胞質中的豬瘟病毒抗原,但無法區別 A76 株或 LPC 株病毒抗原。Wensvoort 利用多株單源抗體的競爭結合法及抗原捕捉法,知豬瘟病毒的抗原決定基的分佈歸類在四個功能位分別是 A、B、C、D,而 A domain 又區分成 A1、A2、A3 次區。又利用過氧化氫酶連結法,將單源抗體分成四群,Group 1 具有泛披衣病毒特異性,Group 2 是豬瘟病毒特異的,Group 3 是中國株病毒特異的,Group 4 是牛病毒性下痢及羊先天性髓質形成不全症病毒特異的,故單源抗體對於病毒的區分及鑑定實為有用之利器。Wensvoort 又利用免疫親和性純化法,以單源抗體來純化病蛋白,並加以分析,發現 E1(gp55) 蛋白含 A1、B、C domain。A1 domain 是所有豬瘟病毒都有的,A1、B 及 C domain 與中和抗體的產生有關,且 gp33 是較不具有免疫原性的。

表二 以單株抗體作豬瘟病毒株之鑑別 ( Wensvoort 等 1986)

 

第二節 豬瘟之診斷:豬瘟病毒及中和抗體之檢出

  豬瘟病毒在培養細胞內不呈現細胞變性作用,故在試管內比能引起細胞變性的病毒更難檢。因此能在試管內檢出豬瘟病毒以前,研究者常以豬隻接種作豬瘟病毒的檢出。Kumagai 等開發出 END 法,以用於試管內作豬瘟病毒的檢出,該法除被引用作豬瘟病檢出及定量外,並作為豬瘟中和抗體的測定。到目前,日本和台灣仍採用本法作豬瘟病毒的研究工作。

  Kumagai 等報告的 END 法操作過程,係將被檢豬瘟病毒以十倍釋法稀釋後,分別接種於 4~8 支小試管,每支試管接種 0.1ml,然後每支試管再加入 0.4ml 初代豬睪丸細胞縣浮液,置 37℃ 中靜置培養 4 天後,倒棄培養液,各試管分注內含 10 PFU/ml 新城雞瘟病毒之培養液 0.5ml,置 37℃ 中迴轉培養 3 天後,鏡檢 CPE 供為判定。其結果為 CPE 陽性時,該被檢稀釋度病毒性為陽性。由於以本法測定之結果和豬隻接種試驗成績相似,因此 OIE 於 1961 年將本法推薦於豬瘟診斷之用。

  END 法被引用為豬隻血清之豬瘟中和抗體測定時,乃以定量病 (200 TCID 50/0.1ml) 與等體積經二倍稀釋法稀釋的血清混合,置 37℃ 中靜置 1 小時,再加入初代豬睪丸細胞。培養 4 天後,倒棄培養液,加入內含 10 PFU/ml 新城雞瘟病毒的培養液作攻,再置 37℃ 中培養 3 天後鏡檢。其結果如為 CPE 陰性,則表示該稀釋度之血清為抗體陽性。

  END 法迭經修改,如改為添加山羊血清於培養液用而不用牛血清、號迴轉培養上的改進,使用微量測定法、改用 CPK 豬腎株化細胞作測定或以濾紙微量採血法採取血清樣品等,而使田間採血及實驗室操作上趨於簡便,使本法更臻理想。

  END 法不適用於豬瘟弱毒及兔化豬瘟病毒之檢。Korn 及 Nishimura 認為 END 法可用於鑑別豬瘟強毒和豬瘟弱毒。林及賴將 LPC 株病毒增殖於初代豬丸細胞或 PK-15 細胞,未能以 END 法檢出該病,而 Liu 和楊則報告 LPC 株病毒於初代兔腎細胞或初代豬睪丸細胞培養一代後,可用 END 法可檢出的病,其病原性較 END 法陰性的病毒為高。

  Solorzano 首先應用 FA 法作豬瘟的診斷,並經 Mengeling 等加予追試及改進。Lin 將此方法應用於豬瘟強毒之檢出及定量。Witte 用微量培養盤操作,使其應用更趨簡便。

  FA 法應用於豬瘟診斷可分為螢光抗體–組織培養法、螢光抗體–塗抹法及螢光抗體–冷凍切片法等 3 種。螢光抗體–組織培養法由 Mengeling 等報告,其法為將病材乳劑或病毒培養接種於已形成單層細胞的 PK-15 細胞,再以 FA 法檢出細胞內的病毒抗原。其後不少學者加以追試檢討並確認其於豬瘟病毒抗原的檢出時,特異性反應極佳。螢光抗體–塗抹法,係由 Aiken 等,Sirbus 等,佐藤等以FA法處理臟器塗抹片而作病毒抗原之檢出。其結果,咸認為是最迅速的診斷方法。螢光抗體–冷凍切片法,由 Robertson 等,Maess 及 liess,Zimmermann 報告。其方法為以FA法處理病豬之臟器冷凍切片,以作病毒抗原之檢,結果頗為理想。

  Carbrey 等報告螢光抗體–組織培養法對病毒抗原的檢出率比冷凍切片路法為高。Mengeling 等使用前法診斷 324 個田間豬瘟病例,認為和豬隻接種試驗有 89% 的一致性。Teebken 等使用後,認為以 FA 法可鑑別存在於扁桃腺的病毒為強毒、弱毒或不活化的豬瘟病毒。目前台灣應用 FA 法檢出豬隻扁桃腺冷凍切片病材之病毒抗原,以作豬瘟之快速診斷。當使用螢光抗體–組織法作豬瘟中和抗體測定時,其操作過程為:以定量病毒 (200 TCID 50/0.1ml) 與等體積經二倍稀釋法稀釋的血清混合,置於 37℃ 中 1 小時,再接種於已形成層細胞的 PK-15 細胞或初代豬睪丸細胞,培養 48 小時後,利用 FA 法檢出細胞中的病毒抗原,若螢光陰性,則表示該稀釋度之血清為抗體陽性。

  除上述外,尚有很多研究者所發展的方法,如 Segre 和 Pichard 及 Segre 的血球凝集反應,Nishimura 等的 HEIC 法,Pirtle,Lai 等的瓊膠雙向擴散法,Bool 及 Ressang 的 ETV 法,Eskildsen 及 Overby 的補體結合反應,以及 Terpstra 的免疫電泳滲透法。這些研究者都強調其方法可作豬瘟強毒的測定,但鮮少被採用。

  豬瘟弱毒不能以 END 法檢,但天竺鼠腎細胞馴化的 GPE- 株病毒可應用西部馬腦脊髓炎病毒干涉法或負斑灶法檢出,豬腎細胞培養的 LOM 株病毒可應用 INC 法檢出,兔隻馴化的 LPC 株病毒則可用 E- 二干涉法作病毒的檢出及定量。

  林及賴報告的 Homo 毒干涉法,或稱 E- 二段干涉法,可用於 LPC 株病毒的檢。該法之原理為初代豬睪丸細胞中若有 LPC 株病毒增殖時,則會干涉同類 GPE- 株病毒的侵入,但不會干涉 WEE 病毒的侵入及增殖。因此, LPC 株病毒在初豬丸細胞增殖時, GPE- 株病毒則被干涉而不增殖,如以 WEE 病毒攻擊時,由於 LPC 株病毒不能干涉WEE病毒,而呈現 CPE 。反,如 LPC 株病毒陰性時, GPE- 株病毒不被干涉而可於細胞中增殖,至於攻擊用之 WEE 病毒因被 GPE- 株病毒干涉,結果細胞不呈現 CPE 。因此, LPC 株病毒於試管內之檢,為利用其對 Homo 毒 (GPE-株病毒) 之增殖干涉作用達成。雖然本法之敏感度差且過程繁瑣,但 Liu 及楊等應用本法於試管內作 LPC 株病毒的定量,但得到令人滿意的結果。惟本法若使用不同的細胞作測定,其結果差異很大。

  兔化豬瘟病毒接種兔隻所引起的熱反應,亦可作 LPC 株病毒及其他兔化病毒病毒定性及定量之用。目前台灣,兔熱反應法仍被廣用於感染兔脾乳劑之病毒含量測定。

  最近已有很多研究者開發出酵素免疫測定法,以供豬瘟強毒和弱毒以及豬瘟中和抗體的檢出。該比上述豬瘟病毒及其中和抗體之檢出方法更具特異性且甚為簡便。Saunders 首先應用間接過氧化氫酶抗體法作豬瘟病毒及其中和抗體的測定,隨後 Holm Jensen 引用此法,並和其他測定方法的結果相比較,認為此法頗為理想。Terpstra 等,Terpstra 及 Wensvoort 使用 IPMA 法作豬瘟病毒的檢出,並已推廣應用於田間豬瘟中和抗體的調查工作;Wensvoort 等利用該法及豬瘟單株抗體,進步作豬瘟野外病、中國株病毒及牛病毒性下痢病毒的鑑別。豬瘟病毒和牛病毒性下痢病毒間具有共同抗原,若豬隻感染牛病毒性下痢病,則其豬瘟中和抗體測定時,會呈現假陽性反應。賴及何曾應用單源抗體於斑點檢定技術檢測豬瘟病毒抗原及抗體,但效果仍未盡理想。Pan 等則認為應用 IIPS 法檢出豬瘟病毒及其抗體為目前測定上之利器,將來或可能推廣應用。

第三節 組織培養的豬瘟病毒特性

1.組織培養的豬瘟病毒增殖情形

 豬瘟病毒含有核醣核酸、脂質和蛋白質,具有套膜結構。因,其於細胞內的複製過程和此特性有關。和其他大部份的 RNA 病毒一樣,豬瘟病毒的伏期很短,而複製過程似乎完全在宿主細胞的細胞質中進行。

  很多學者以 FA 法測定豬瘟病毒於 PK-15 細胞增殖之週期。其結果發現潛伏期為 5~7 小時,病毒於感染後 15 小時大量增殖,50 小時達最高值,培養液病毒量 10~10PFU/ml,而估算出每個細胞含有 500~1000 Infectiousunit 的病毒。Mengeling 及 Drake(1969)報告 ALD 株病毒連續用 PK-15 細胞繼代,病毒能適應此細胞而增殖,並縮短其潛伏期(從6小時成為5小時),亦可增殖而得高力價病毒。使用初代豬腎細胞或初代豬睪丸細胞,其潛伏期較長(約為7小時),不論所使用的豬瘟病毒是否適應於 PK-15 細胞,細胞外的病毒量總比細胞內為多。Mengeling及Drake(1969)認為此乃因成熟的病毒並未堆積於細胞內,一旦成熟就立刻釋放於細胞外之故。但 Danner 及Bachmann 則報告細胞內的病毒量比細胞外高 10~100 倍。不同的豬瘟病毒株於不同的溫度下,其生長曲線 (Growth Chrves)的特性,可作為其對豬隻病原性的遺傳標誌。

  Mahnel 和 Mayr 綜評豬瘟病毒於實驗動物和雞胚胎的增殖試驗報告,認為兔隻適合於作豬瘟病毒的增殖;有許多疫苗病毒為由兔隻繼代發展出來。

  Pirtle 及 Kniazeff 使用由 7 屬 29 種哺乳動物而來的 24 種初代培養細胞,14 種低繼代細胞和 13 種高繼代細胞株,作為對 Ames 株病毒及 TCV 株組織培養的豬瘟弱毒之感受性試驗,並於病毒接種在細胞後 24~48小時,以 FA 法檢出細胞內的病毒抗原。其結果顯示經組織培養的弱毒比由豬隻而來的強毒較能適應多種細胞的增殖,而認為此可能是選擇性病毒族群(Selected viral population)增殖的特性。這兩株病毒對不同的培養細胞有不一樣的感受性,其中以豬之初代或株化細胞最適合於此二種豬瘟病毒的增殖。

  Horzinek 於 ”Non-arthropodborne Togaviruses" 一書中,彙整有關培養細胞對豬瘟病毒之感受性報告,其中有不少動物的初代及低繼代細胞對豬瘟病毒有感受性,如豬的腎、脾、睪丸、氣管、肝、脊髓、淋巴球和巨噬細胞,牛的腎,牛胚胎的皮膚、脾及氣管。羊胚胎的腎及食道,天竺鼠及松鼠的腎,兔的腎等等(詳見表三)。有些由動物而來的株化細胞,對豬瘟病毒也有感受性,如豬的腎及睪丸細胞,牛腎細胞,靈長類的 Hela 細胞等等(詳見表四)。但有許多的細胞對該病毒感受性甚低或完全無感受性,如肉食獸(貓、犬、貂、狐狸、浣熊),齧齒類(中國倉鼠、敘利亞倉鼠、大白鼠、小白鼠),靈長類(恒河猴、非洲綠猴),以及由馬和由人來的細胞等等。

表三 :對豬瘟病毒有感受性的初代和低繼代細胞株(Horzinek 1981)

 

有關兔化豬瘟病毒再以細胞培養增殖或繼代的報告,Keeble 等曾以兔腎細胞,Kushnir 以小羊睪丸細胞,Goret 等以小羊腎細胞,Leftheriotis 等以兔腎及綿羊腎細胞,作免化豬瘟病毒的增殖。法國製造之豬瘟疫苗(商品名稱為 Pesto Vax),則聲稱係由中國株病毒於小羊臟細胞培養增殖所製備的疫苗(Rhone Merieux 1986)。至於 LPC 株病毒,在培養細胞增殖的試驗報告,首先為蘇及林以初代豬睪丸細胞和兔腎細胞交互培養,而以兔腎細胞作該病毒的增殖。Liu 報告初代兔腎及兔睪丸細胞,PK-15 細胞及 RK-13 兔腎株化細胞,不易增殖 LPC 株病毒,但可用初代豬睪丸或初代豬腎細胞加以增殖;此時,培養 7 天後之病毒力價最高,分別可達 10及10TCID 50/ml。Lai 等也有類似的報告。楊等以初代兔腎細胞作該病毒的增殖及繼代;繼代 10 代的病毒力價可達 10TCID 50/ml。這些研究者以 E- 二段干涉法,使用 SKH 豬腎株化細胞來測定增殖的病毒力價。

表四:對豬瘟病毒有感受性的株化細胞(Horzinek 1981)

 

2. 培養細胞內持續感染的豬瘟病毒特性

  豬瘟病毒在宿主動物-豬隻及由豬隻而來的組織培養細胞中會呈現持續性感染。藉母體胎盤感染胎兒的豬瘟病毒,於出生後的仔豬體內,仍可能持續感染。有些學者報告仔豬接種毒性較低的豬瘟病毒會造成持續感染。實際上,帶病毒的豬隻是豬瘟撲滅計畫最棘手的問題之一。

  Loan 及 Gustafson 將豬瘟強毒持續感染於豬白血球培養細胞,經 204 天的換液培養,其培養液的病毒含量仍有 10PID 50ml(50% Pig infective dose per milliliter),並且病毒對豬隻的毒力,並未因長期間的培養而明顯下降。Izawa 及 Soekawa 報告持續感染豬瘟病毒的細胞經繼代培養,會加速其病毒的減毒,但僅換液而未經繼代培養的細胞,則並無此種效果。其原因可能為繼代培養可使某些細胞族群造成強迫性的增殖(Forced proliferation),而未繼代的細胞沒有這種現象,縱使會減毒,也要耗更長的時間。另外造成減毒的原因為繼代時,病毒受使用的胰蛋白梅和 EDTA 的直接作用,以及細胞和病毒間的相互作用所引起。

  Sato 等將具有病原性的 Miyagi 株豬瘟弱毒及 ALD 株毒,分別接種於豬腎培養細胞中,每隔 4~7 天更換培養液或刮除部份老細胞,並繼續培養 400 天以上。其結果為培養細胞內的病毒,對豬隻之病原性依培養時間之延長而漸降,最後病毒會失去對豬的病原性,但仍具有免疫效力,此即 Sato 等報告的所謂連續性細胞-病毒增殖法(Continuous cell-virus propagation method,CCVP 法)作豬瘟病毒減毒的依據。Bass 及 Ray,將豬瘟強毒,以豬胚胎腎臟細胞培養並繼代 100 代,也可將其毒性消除,而不失其對豬之免疫效力。這些研究者認為病毒於具有代謝能力的細胞中作連續性且自然選擇性(Continuous natural selection)的增殖,毒性較高的病毒於細胞中增殖速率比毒性較低的病毒為差,且毒性較低的病毒所感染的細胞,可抵抗較高毒性病毒的再入侵,由於此種機能而使病毒減毒。

  Izawa 及 Soekawa 報告將感染豬瘟強毒的豬隻,摘取腎臟作細胞培養 600 天,其間實施定期換液及 80 代的繼代培養,發現病毒會持續感染此培養腎臟細胞並可繼代培養,在培養液內亦可檢出由細胞釋放出來的病毒。這些病毒對豬隻已無致病性。Shimizu 等報告豬隻接種持續感染 PK-15 細胞的豬瘟病毒後,可耐過強毒的攻擊。Mengeling 等以 5 株豬瘟強毒,持續感染於 PK-15 細胞,經 63 週、125 代繼代培養,所有 5 株病毒的毒性都有減低的現象,且對豬隻產生免疫效力,而這些持續感染的病毒可藉分離或 FA 法予以檢出。Izawa 等由培養在 28~29℃ 下,持續感染豬瘟病毒的豬腎細胞中,分離出耐低溫的變異株(Cold mutant),此變異株無法以 END 法檢出,惟在細胞中可抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的增殖。豬隻接種此病毒後,可耐過豬瘟強毒的攻擊。

  Izawa 及 Soekawa,Mengeling 等報告持續感染豬瘟病毒的培養細胞,以 FA 法發現所有的細胞都含有病毒抗原。病毒藉細胞的有絲分裂,由母細胞傳給子細胞。因此,用豬瘟特異性抗體處理培養細胞,並未能停止此種持續感染作用。持續感染豬瘟病毒的培養細胞,細胞外的病毒量低,約只有 10  PID 50/ml,可能因只有少部份的感染細胞產生或釋放病毒於培養液中。Izawa 及 Soekawa 報告於持續感染病毒的培養細胞,若培養液中加入抗體,則可收集的病毒量比未加入者為高,原因不明。

  Pirtle,Pirtle 及Woods指出豬瘟病毒持續感染於 PK-15(NADL株)細胞,甚至將這些細胞作 80代 的繼代培養,其染色體並無變化;若豬瘟病毒持續感染於 PK-15(ATCC株)細胞,則於細胞遺傳學上造成的改變(Cytogenetic alterations)極為明顯,例如染色體發生內倍體化(Endoredup-lication)及碎化(Pulverization)等現象。感染豬瘟病毒細胞所引起的染色體變化,亦為許多研究者所證實。但 Torlone 等使用豬之細胞株施行的試驗,證實持續感染豬瘟病毒的細胞和未感染的細胞,其染色體組型(Karyotype)並無差異。Mengeling 等以 5 株豬瘟強毒持續感染於 PK-15(NADL 株)細胞,發現病毒並未引起細胞形態學上或細胞遺傳學上的改變,其染色體組型亦無任何變化。

  Cram 及 Brunsting 報告將感染豬瘟病毒的 PK-15 細胞和未感染病毒的對照組細胞加以比較,於細胞病理學上,二種細胞的體積並無差異;但以雷射光散射(Laser light scattering)觀察,發現細胞之反射性形態學和折光指數(Refractive index)變化上,有明顯的不同。

  急性和持續性感染豬瘟病毒的 PK-15(NADL株)細胞,其分裂時之 S 相(S phase)分別為 0.9 及 0.7 小時。

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