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假性狂犬病
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作者: 鍾明華
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緒言

  假性狂犬病是由疱疹病毒所引起之家畜及野生動物急性且高死亡率之傳染病,幾乎所有的哺乳類,包括人類對 PR 病毒皆具感受性,動物感染後,最主要的特徵為中樞神經症狀。本病最早是在1902 年由匈牙利獸醫師兼人醫的 Aujeszky 在牛的病例中發現,故本病又稱為 "Aujeszky's disease";1904 年 Marek 發現本病毒對兔子延髓頗具親和性,故各名傳染性延髓麻痺症;牛隻感染後會發生特徵性的劇痒現象,號稱狂痒症;在牛的病例中也會出現流涎、咬嚼等類似狂犬病的症狀,因此又命名為假性狂犬病。

  雖然很多動物對 PR 病毒皆具感受性,但豬被認為是本病毒之自然宿主。因於 PR 病毒對牛、羊、犬、貓具有很強烈的病原性,在這些動物感染後,尚未產生免疫力前即發病死,也不會排出病,因此被稱為“終端宿主”。豬隻對 PR 病毒之感受性隨年齡之增長而遞減,2 週齡以下哺乳仔豬感染後之死亡率高達 100%;成年豬則呈現輕微的症狀,甚至不明顯;懷孕母豬感染後,本身並無明顯症狀,但卻會引起流、死產,造成重大的經濟損失。

  對豬而言,PR 病毒主要係經由口腔及鼻腔侵入,隨即在鼻粘膜、咽部及扁桃腺等部位增殖,然後沿嗅神經、三叉神經、舌咽神經及週邊神經上溯至嗅球、橋腦、腦幹等中樞神經而致病。病毒進入中樞神經後即四向擴散,亦可能隨血液侵入臟器,造成壞死,或侵入胎盤、胎兒,引起流死產。 PR 病毒亦可能不經血流,而由細胞間橋感染鄰近細胞,豬隻感染恢復後,病毒常潛伏於神經結細胞,成為潛伏感染,在緊迫情況,如注射腎上腺皮質素,懷孕或其他自然及人為因素之下,病毒核酸即開始活化,複製病毒,終致排出病毒污染豬場,成為感染源,此為 PR 難以撲滅的最重要的原因。

疫情

  1914 年首先發現豬假性狂犬病例以來 (16),本病已蔓延世界各大洲,美國、歐洲各國、南美、中東、紐西蘭、東南亞、中國大陸、日本等均有病例發生之報告,且都造成相當的經濟損失,也成為業者及獸醫研究人員的惡夢。本病在台灣最先由林孫權等 (10 )於 1971 年在屏東地區發現,根據農林廳調查報告顯示,1971~1979 年間,本省有 10 個縣市有病例報告,而目前全省各地均已被 PR 病毒污染,同樣地引起嚴重的經濟損失。

  1971 年至 1974 年間,本病在本省流行之初,病豬之內臟病變至不多見,純為神經型居多,爾後內臟型病變漸為主要的肉眼病變,最近又有肺臟型,甚至可見皮膚型之病變。其原因是否病毒已發生變異?有待深入探討。

病毒分離及分析

  在病毒感染急性期間,病毒會從口腔、鼻腔、糞便、尿液、乳汁、精液中排出,病毒亦可從鼻腔粘膜、扁桃腺、淋巴腺、腎上腺、脾臟、肺臟、肝臟、腦、神經等組織器官中分離到。分離病毒最常用之材料及方法有:

1.組織培養細胞

  PR 病毒對目前實驗室常用的豬、牛、羊、家兔、小白鼠等組織細胞幾乎無一不愛,病毒在這些細胞中之增殖性也都非常好。不過,PR病毒在不同的動物來源的細胞中所形成的CPE形態不一樣,有的形成融合性(如圖二),有的是圓化 CPE;正常細胞(圖一)。

 

 

2.實驗動物:

  各種實驗動物中以家兔最為敏感,而一般常用之小白鼠則具相當的抵抗性。家兔在皮下或肌肉內注射組織乳劑後 3~5 天,會引起強烈的搔痒,至死為止,是為非常良好的分離及鑑定材料。(圖 三)

 

本省之 PR 在流行次初,即有人懷疑可能係由歐美地區隨著豬之引進而侵入,但由病毒核酸之內核酸酶切割圖譜觀之,本省分離毒株與歐美地區差異極大。因此,有人認為本省之 PR 病毒可能源生於本島,而非由歐美地區引進,或侵入台灣後,在動物體內產生重大變異。由於內核酸酶切割圖譜被認為是一種辦認病毒株差異性的利器,尤其是在分析基因重組技術構築之基因切除病毒株、自然變異株及野外毒株之核酸差異極為有效。不過,各地區中病毒株之核酸切割圖譜會有少許之不同,重要片斷則倒相當安定,多無差異。(圖4)

 

一、病理學檢查

1.肉眼病變:

  肺水腫或多發針頭大白色壞死灶。

  肝多發針頭大白色壞死灶,腎上腺亦有類似病灶。

  腦膜充血、腦脊髓液增加。

  扁桃腺可見潰瘍灶(圖五~十一)。

 

                   

      

2.組織病理變化:

  腦組織病變以非化膿性腦膜腦脊髓炎為主,星狀細胞、小神經膠細胞及神經之皆可見嗜酸性核內包涵體。

  肺水腫充血,肺上皮細胞增生,肺泡壁局部壞死。

  淋巴腺、肝、脾、腎上腺局部壞死。

  各器官組織奧死區域其周圍可見嗜酸性核內包涵體。(圖十二~十四)

           

 

二、血清學測定

1.中和抗體測定:

  中和抗體測定為傳統、標準的血清學測定方法。豬隻感染 PR 病毒後,抗體產生緩慢,力價也不高。大約在感染後7天始測得很低的抗體,約在 3 週後達最高。

2.免疫擴散測定:

  免疫擴散為抗原、抗體在半固體瓊脂中互相擴散,在兩者適當的濃度比例處凝集沈澱成線,可用肉眼判讀的古老測定方法。利用胰蛋白酶溶解(Solublize)病毒顆粒封套上或感染細胞膜上的病毒特異性醣蛋白做為抗原。

  免疫擴散測定方法十分簡捷,不需貴重儀器設備,適合第一線之作業,所需時間短,24 小時內即可判定,特異性高,但敏感性不足為其缺點。因在低抗體情況下,沈降線極靠近洞緣,不易判讀。所得結果陽性率較中和抗體測定者稍低。

 

3.酵素結合免疫吸附反應(ELISA)

  ELISA 是一種快速、高度敏感性的測定方法,通常是將抗原吸附於 96 孔 EIA 盤上,滴入待測血清後,加入抗豬免疫球蛋白標示抗體,再以受質呈色後,以判讀機判讀之。

  其他血清學測定方法尚有 HI, Latex 凝集反應等皆可應用。

三、細胞免疫測定

1.皮內遲發型過敏性反應:

  將 PR 病毒抗原經不活化處理後,注入豬隻下耳臉、尾根部或其他部位皮內,24小時後由注射部位的紅腫與否判定是否感染過 PR。試驗證實,PR 病毒感染細胞培養液以硫酸銨沈澱後,以 56℃,3 小時不活化處理做為抗原,注入豬隻下眼臉及尾根部皮內,下眼臉之反應十分強烈,尾根部的反應則較溫和(圖 十六,十七,十八)。由組織病理切片中亦可發現,皮下水腫,單核球及漿細胞浸潤等特徵性變化(圖 十九)。

  

  

豬感染 PR 病毒後,細胞免疫反應比抗體產生較早,因此可比抗體測定早期偵測出 PR 之感染,俾利疫性之控制。皮內反應中和抗體測定及免疫擴散測定三者間之特異性及敏感性相若(表 2)。

 

2.淋巴球芽生測定:

  由於豬隻感染 PR 病毒後,其淋巴球受到病毒抗原致敏化(Sensitized),將此淋巴球取出後,在3H-thymidine 同位素培養液中與病毒抗原共同培養之,淋巴球受到刺激即分裂增生攝入 3H-thymidine 同位素,然後由閃光計數儀(Scitilation counter)測定攝入量,由刺激指數(Stimulation index)計算其反應程度。

  在試驗中從頸靜脈採取之週邊淋巴球與 PR 病毒抗原共同培養後,其刺激指數未見顯著增加(圖廿)。

 

四、病毒及其核酸鑑定

1.病毒分離:

  依前述的病毒分離技術,由其形成之 CPE 及其生化性狀,中和試驗加以鑑定。

2.螢光抗體染色:

  採取病畜組織器官(如扁桃腺),予以冷凍切片,經直接或間接螢光標示抗體染色可資鑑定。

3.核酸雜合(Hybridization)及聚合酶鏈鎖反應(PCR):

  這些是最新發展的高度敏感性,鑑定潛伏感染的技術。可疑豬隻若含有微量的病毒核酸可以雜合技術與探針結合,或利用聚合酶加以放大證實病毒的存在。

預防

  俗語說“預防重於治療”,良好的預防措施對疾病的發生有重大的影響,由於 PR 病毒有潛伏感染之特性,偵測極為不易,再加上本省養豬場過於密集,養豬頭數眾多,使得傳播速度快,亦使撲滅工作益形困難。於今之計,端賴嚴密的豬場環境衛生管理及疫苗的注射加以控制。

PR 之預防

一、環境衛生管理

加強豬場環境管理,包括進出車輛消毒,老鼠、蟑螂滅撲,犬貓管制。
飼養管理人員更衣、消毒,禁止員工在家飼養豬隻。
徹底執行豬舍、飼養器具、清掃器材的清潔及消毒。
不引進豬隻,如非引進不可,必從無 PR 污染之乾淨豬場購買,且在引進後隔離飼養 30 天,其間應採血檢查。
公豬定期檢查精液。
謝絕參觀,防止閒雜人員進出。
二、疫苗注射

  利用疫苗注射,使母豬產生免疫抗體,藉移行抗體保護仔豬渡過極易感染的時期,避免 PR 病毒之荼毒。在行抗體消失後,如情況危急,亦可在保育期間注射疫苗。

三、疫苗開發

  PR 疫苗有傳統性不活化及活毒疫苗、遺傳工程活毒疫苗及次單位疫苗,除了後者外,其他皆有為數眾多不同廠牌的疫苗可資應用。

  多數文獻報告指出,活毒疫苗之免疫效力較不活化疫苗為優;但亦有部份報告指稱不活化疫苗能刺激較高的抗體,使仔豬獲得較好的移行抗體保護。本所研究人員早就對活毒疫苗之開發極感興趣。1973 年蘇杰夫等以 PK-15 細胞為橋樑細胞,將本省分離屏東株馴化於 CK(雞腎細胞)細胞至 30 代,對 SPF 小豬已無病原性,接種小豬可耐過強毒攻擊 ;對家兔的病原性已較原先降低 10 之。 1977 年林敬覆以BK(牛腎細胞)馴化本省分離之 N3 及 T3 株至 120代,對 4 週齡小豬之病原性已降低,接種小豬攻毒後皆正常耐過。

 

 

鑑於胸腺嘧啶激酶之活性對疱疹病毒病原性的表現有關,在病毒族群中,偶有 TK-negative 之病毒出現,若能將其分離,即可獲得無病原性的 TK-negative 變異株。為了分離 TK-negative 變異株,可在培養液中加入鹵化嘧啶,如 BUdR。因其結構與 TK 相似,可以取代 TK,在 5-Bromodeoxyuridine (BUdR) 存在下,正常的 TK-positive 病毒無法增殖,TK-negative 者可以繼續生存,且在 BUdR 在在下病毒 DNA 核酸中之 Thymidine 會被 BUdR 取代,經過斑灶選株後即可獲得 TK-negative 變異株。本所鍾明華等利用 BUdR 及 5-iodo-2-deoxyuridine(IUdR) 使本省分離之 PRV-TNL 株病毒產生變異而獲得 TK-negative 變異株。此變異株不僅對三日齡初生仔豬無病原性,且對家兔亦喪失了病原性,此為目前所僅知對家兔無病原性之少數 PR 病毒之一。

  此 TK-negative 變異株尚擁有良好的免疫原性,可使免疫仔豬耐過攻毒,而攻毒後之排毒、發燒期間均較未免疫者為短。懷孕母豬免疫後,無任何異狀,顯示此一 TK-negative 變異株對胎兒極為安全;免疫母豬攻毒後正常分娩,仔豬亦正常成長,反觀未免疫母豬攻毒後產出 13 頭仔豬,其中 3 頭死胎,其餘 10 頭亦在一週內陸續死亡。

 

 

 

政府有鑑於傳統性活毒疫苗對幼齡仔豬之病原性尚有疑慮,遺傳工程活毒疫苗對幼齡仔豬之原性雖有大幅降低,甚或已不具病原性,但在田間實際應用時,病毒株間因核酸重組使病原性迴歸之可能性仍然存在,因此政府仍未開放活毒疫苗之使用。國內學者、研究人員對不活化疫苗之開發仍不遺餘力。呂榮修、董明澄、劉榮標、林敬覆曾分別以 Formalin, Crystal Violet, Phenol, AEI 為不活化劑研究其免疫效力。本所鍾明華等曾於 1978 年使用紫外線 (UV) 照射方式將PR病毒不活化後製造疫苗,結果顯示 UV- 不活化疫苗對小豬及母豬之免疫效力均佳,但由於欠缺大規模生產之設計以及擔心不活化後之 PR 病毒核酸會受較長波長光線照射後再被活化之可能,此 UV- 不活化疫苗未進一步商品化。

  因疫情需要,本省遲至 1979 年始自國外輸入不活化疫苗,當時之售價極為昂貴,高達 100 元dose以上,農民所費不貲,無法推廣使用,無濟檢疫情之控制。有鑑於此,本所鍾明華等乃於 1981年分別使用戊二醛 (GA) 及溴乙胺 (BEI) 為不活化劑,以 DEAE-Dextran(D-D) 及礦物油 (OE) 為佐劑試製不活化疫苗,以家兔及小豬比較其免疫效力。結果顯示溴乙胺不活化、D-D 為佐劑之疫苗之免疫效力最佳,再經過大規模田間試驗後獲得經濟部頒發國內第一張組織培養疫苗製造執照。1983 年起正式商品化,廉價供應農民使用,國外輸入疫苗之售價自此節節下降。

 

自本所開發不活化疫苗成功起,農林廳即於 1983 年成立預防注射計畫,各各縣市防治所負責實施疫苗注射工作。民營各生物藥品廠在本所藉講習班學習疫苗製造技術後陸續加入生產行列。根據農林廳調查報告指出,隨著疫苗使用量之增加,本省豬隻發生PR之件數及頭數即隨之降低,由此可見,疫苗之應用已達到控制之目的。

  目前礦物油或其他油品在動物用生物藥品製造上日受重視,油劑疫苗在體內停留時間長,更能吸引免疫細胞刺激產生較高的免疫力。為了提高改進本所之 PR 不活化疫苗品,乃將 PR 病毒液加以濃縮,不活化後分別與礦物油及 D-D 混合製造疫苗,並取法國製 (F) 及荷蘭製 (H) 兩種進口疫苗做比較,分別注射家免測定免疫保護效力,並以小豬測定免疫持續力。兩種結果均顯示濃縮疫毒製造之油質疫苗之免疫效力最佳。

        

 

展望

  PR 病毒 DNA 核酸分子量有 9×106 daltons,與其他病毒相較,其分子量相當大,所攜帶的基因相當多,至少可合成 8 種醣蛋白、4 種非結構性蛋白,故其結構相當複雜,也比較聰明些,其核酸會躲進細胞內,甚至以 Provirus 形態寄生於寄主細 胞核酸內逃避寄主體液免疫及細胞性免疫的攻擊,並伺機而動。目前先進歐美各國雖有各種控制、撲滅方案,其結果並未如預期成功,除了英國因採行撲殺政策,宣稱已將 PR 撲滅外,其他各國未能將 PR 病毒撲滅。本省地處島國,應易將各種疾病置諸於控制、撲滅才對,事實並不儘然。縱觀各種方案,應以撲殺政策最為徹底有效,但花費過鉅,風險亦高,主客觀因素皆不宜在國內採行。多年來,本省在疫苗注射計畫之下,大規模流行已不復見,僅見零星病例,故農林廳執行之疫苗注射計畫已然奏功。

  在歐美諸國採行的控制、撲滅方案之中,疫苗免疫注射仍為重要的一項,所使用的疫苗當中,以遺傳工程技術重組的活毒疫苗居多,如法國、德國、荷蘭、北愛爾蘭、美國等,日本亦在試驗當中。一般傳統性活毒疫苗已漸被揚棄。遺傳工程活毒疫苗係將野外病毒 DNA 核酸中與病原性有關、又不影響病毒增殖之基因,如 TK,gl 等基因予以切除;有的則再將非結構蛋白基,如 gx 基因切除,或植入外來基因如乳糖酵素基因做為 marker,以供試測之用。此種疫苗對豬隻不再具病原性,且不會產生 gl 或 gx 抗體或會產生 marker 物質,因此可藉豬隻血清內 gl 或 gx 抗體之有無,或 marker物質之有無判定是否受到野外病毒之感染如有 gl 或 gx 抗體存在,即表示豬隻已被野外病毒感染,反之則否;如有 marker 物質存在則表示為疫苗反應。藉此判定指標提供畜主或農政單位採取管制、淘汰或撲殺之依據。歐美諸國採用遺傳工程疫苗之目的係欲藉可與野外病毒區別之特性,把野外病毒感染豬隻一一摘除,斬斷野外病毒在豬場循環來源,清除野外病,最後則完全停止疫苗注射,達成撲滅之目的。

  理想的 PR 疫苗應符合:(1)不造成潛伏感染、不排毒。(2)可保護豬隻不發病。(3)可阻止野外病毒在豬隻體內之殖增 (Colonization)。但迄今尚無任何一種疫苗,包括傳統的、遺傳工程的不活化及活毒疫苗、次單位疫苗,可以完全有效阻止免疫過的豬隻再感染,不過,疫苗確可降低發病程度、縮短排毒及失重日數,對疫情上及經濟上之貢獻可予肯定。展望未來國內之 PR 預防策略仍應朝開發更有效且可能與野外毒區別之不活化疫苗,以及最適免疫計畫方向進行,再配合可區別野外病毒感染檢測試之應用,檢驗淘汰方式逐步減少豬場內野外毒之存在,以期將 PR 病毒自豬場內消失。

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