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布氏桿菌病
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作者: 吳義興
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序言

  布氏桿菌病一種由布氏桿菌(Brucella)所引起之急性或慢性傳染病,以胎盤炎及流產為特微。以前曾經稱為Bang氏病,或傳染性流產。布氏桿菌為一種可寄生細胞內引起感染之革蘭氏陰性桿菌,於1887年由Bruce發現而以其命名。布氏桿菌迄目為止已知有Brucella melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.neotomaeB.canis等6種,其中前3種常會感染人成為人畜同傳染病。人感染本病稱為地中海熱馬爾他熱。臨床上呈現感冒症狀、疲倦、肌肉病、發微熱、夜間盜汗等症狀,經過很長,且不易治療。至目前為止,在台灣有報告者為B.abortusB.canis 2種。

  布氏桿菌病在動物主要之臨床症狀是流產,它常發生於接近分娩期。在懷孕第6~8個月發生率最高。流產後1~2週會有混濁之子宮分泌液排出,懷孕後期之流產會發生胎衣滯留。

畜群之感染主要由引入帶菌畜而起,污染擴散後,初次爆發流產,其流產率可達30%以上,而後流產率逐漸下降,但在畜群中之第1胎懷孕畜或新引進未感染畜仍會有很高之流產率。公畜感染時,早期發燒伴以一側之睪丸及精囊急性腫痛,數週後症狀消失,睪丸變大而硬,精液中含炎症滲物及活菌。病灶大部僅限於生殖糸統、胎盤炎、胎盤及其四週組織充滿滲液及壞死組織使其呈灰色到黃色。子宮壁,尤其在子宮角彎有水腫,子宮絨毛膜間充滿細菌、滲液及鱗脫之絨毛細胞。感染之睪丸及細精管組織含炎症滲出液及壞死區,到後期,組織由於壞死而萎縮及織維性增生(王金和等1991、林地發等1982、蔡義雄等1984d)。

一、發生及現況

(一)牛布氏桿菌病

  牛布桿菌病發生於世界各養牛國家,在1950年以前,很多國家均有很高之發生率,經各國有系統之控制及撲殺處理策略,目前在荷蘭、澳洲、加拿大及日本等已開發國家,其陽性率均減少到很低。但在開發中國家由於未作控制處理,仍有高之感染率,而在少數之養牛數不多或顉土小國家例如我國,本病則已完全撲滅。

  在美國牛布氏桿菌病於1935年,高達11.5 %,經撲滅處理到1967年,已降到0.57%。到1977年僅有0.46%之牛群列管,目前有31州感染群在0.1%以下,但尚有12州,大部在東南部,有100個以上之污染牛群,其感染率在0.15~ 2.9%。

  日本牛布氏桿菌病經糸統之控制及撲殺,其陽性率已降為萬分之一以下,據日本農林水產省畜產局之統計(1990),在過去5年 (1985~1989)中,其約140萬頭之牛隻,只零星發生4頭布氏桿菌血清陽性反應牛。

  台灣地區牛布氏桿菌病之檢查姶自1947年,早期台灣地區之畜牛以役用水牛及黃牛為乎,乳牛很少,因此抽樣檢查之對象亦為水牛及黃牛。1953年初步之調查水牛之陽性率為5.02%(22/438),黃牛為13.18%(48/364)(黃文池等1953),雖然此次之調查使用特異性較低之急速平板凝集試驗,其結果亦造成畜牧獸醫界極大之關切。於是自該年起開始作全面之檢查,並積極推動立法,把本病列入法定傳染病,以為強制檢查及撲殺之依據。1955年曾對一頭血清反應陽性牛作病理解剖及病原菌分離,結果均為陰性(黃文池等1955),認為本省耕牛並無本病之存在。為進一步瞭解本病,劉燃炎等(1955)以標準菌株作人工感染試驗,期能得到更多之資料。1958年台灣地區開始由澳洲進口乳牛,由於生產之牛乳與國人之健康關係密切,使本病更被重視,有關本病血清學檢查、人工感染後之反應等研究,及初步之檢查成績亦加緊進行(李太矜和王宗枝1954、劉燃炎等1955、楊子儒1959、王銘堪1961、林本欽1962、傳祖慧和蔡文敏1963、劉燃炎1963a)。1963年劉燃炎等報當,首次由本省檢驗陽性牛隻分離到病原菌-流產布氏桿菌,證實布氏桿菌病存在於本省之乳牛中,其後一再有分離到本菌之報當(詹益液等1964、呂

榮修等1964、蔡義雄等1985)。

  1962年,當時之農業復興委員會決定以美援經費補助,展開本省乳牛布氏桿菌病之撲滅工作。自1962年開始,全省乳牛使用血清學定期檢查及摘除陽性反應牛之方法,經27年之努力,終於在1989年使本病絕跡(表1)。

在本省乳牛布氏桿菌病撲滅之過程中,依檢出陽性反應牛之百分率升降大致可階為3個階段;第1階段自1962年始到1971年,血清學檢查採用國際法,每年定期採血檢查2次,由於乳牛數量不多(由3,447~8,592頭),其陽性反應率很快由4.99%下降到0.0349%,但由於污染牧場亦僅每年檢查2次,且無如清場等斷然之措施,本病亦未因此而滅絕。第2階段由1972年始到1979年,由修改血清學制定標準及污染牧場之每隔3個月之加強檢查,亦使擴散之污染率再次降到0.0579%,雖對所剩數個污染牧之一使用45/20不活化媒劑菌苗以摘出以擁出陽性牛而使該場清除本病,但對其他污染牧場未作處理,亦再失去撲滅本病之機會。第3階段自1980起,在密集式每個月採血及淘汰陽性反應牛下,使染牧場及陽性率很快下降,在1988年底對最後一個污染牧場,試驗四環素類藥注射牛隻預防再感染成功而全面撲滅本病(Wu and Chiu 1991)。

(二)羊布氏桿菌病

  羊之布氏桿菌病主要感染病原為被狀熱布氏桿菌及流產布氏桿菌,另公綿羊亦常感染羊食氏桿菌(Brucella ovis),造成公羊副睪炎(ram epididymitis)。

  台灣地區乳羊之飼養自 1980年後急速之增加,由於羊乳販售供用量漸增,使得乳羊是否罹患布氏桿菌病而威脅國人健康之問題備受關心,為瞭解本庚疫青,台灣省農林應委託國立嘉義農專作初步之調查,該校以美哩DIFCO公司出品之急速平板抗原作血清學檢查,於1984年提出報當,稱本省乳羊布氏桿菌病之感染率高達52.5%。由於羊以感染被狀熱布氏桿菌為主,此菌種對人類之病原性較牛之流產布氏桿菌為強,使此報當震驚全國獸界,要求台灣省家畜衛生試驗所即速展開全省乳羊布氏桿菌病之血清學調查。經以較準之血清試管凝集試驗及補體結合試驗,展開全省乳羊之血清學調查,結果在8,847頭乳羊中,檢出12頭陽性反應羊,但由於其血清力價均不高且呈散發性分怖,其中2頭血清力價較高之羊,經剖殺分離布氏桿菌,結果均為陰性,故認為其仍非特異性之偽陽性反應(吳義興1988)。為進一步瞭解乳羊感染布氏桿菌後之血清抗體升降及其排菌清形,曾以流產布氏桿菌與波狀熱布氏桿菌人工感染乳牛,發現其血清抗體在感染後第6天即出現,第14天後全部感染羊均可測出血清抗體(吳義興等1990)。

(三)豬布氏桿菌病  

  本病現遍佈全世界之飼豬及野豬,已成為豬重要疾病之一。1920年代到1950年代到間,本病曾在美國引極大之經濟損失,此後進行定期檢查撲滅計畫才逐漸控制本病。目前僅東南部尚偶而發生。美國農業部在1979年之調查(USDA 1998),血清呈陽性反應僅0.08%,這些豬分佈於697個豬場(0.87%)。由於無感染豬血清常會有非特異陽性反應,故此報告指出之感染率可能比實際所知者為高。

  在本省,肉豬之飼養期僅數個月即上市,故無布氏桿菌病之困擾。但對種豬,本病則顯得相當重要,因此本病在豬之調查亦以種豬為對象。1960年,王再等智等對台南地區之種母豬,以DIFCO公司之平板急速凝集抗原作血清學調查,發現有8.71%之陽性,但由於未發生流行及流產等臨床症狀,亦未曾分離到病原菌,一般認為可能盡抗原不良引起之非特異反應而未予重視。1977年,劉瑞生以試管凝集試驗法作全省種母豬之抽檢,結果均為陰性,認為本省種豬並無本病之污染。為瞭解本病感染後之病理及血清學彎化,林地發等(1982)以豬布氏桿菌人工感染豬,並全省豬隻之血清學抗體調查,亦未發現本;病之陽性例。

  除豬夕,歐洲野兔及野豬是本病之重要保菌動物,早於1954年即知歐洲野兔為豬布氏桿菌第2型菌之自然宿主(Bendtsen等1954),它造成豬布氏桿菌病在歐洲之週期性發生,氛國東南部之野豬現有很高之血清陽性率,並由抽樣分離到豬布氏桿菌第1型菌(Wood等1976,Becker等1978)。野豬對豬布氏桿菌病流行病學之重要性,乃依野豬與飼豬之接觸程度而定,若飼豬之管理使其不可能與野豬同處,則其對飼豬之威為大。在豬布氏桿面病流行地區附近,所捕到之齧齒動物或肉食動物曾有感染本病或血清陽性反應之病例。但一般認為此類動物為本菌之終宿主,豬群很少由此種動物而感染投生的,大部由其他感染豬群而傳播過來的。

(四)犬布氏桿菌病

  犬布氏桿菌除感染犬外,Alton等(1975)稱有少數人類感染之病例,但事實上迄今尚無正式報告,因此本病在國內並不受重視。1980年後,國人生活水準提高,對於飼養寵物健康關心,本病亦開始受重視,於是對本病之病理學變作化作人工感染後之探究(王金和等1981)。1984年蔡義雄等對本省飼犬作布氏桿菌病之抗體調查,由感染犬分離到數株犬布氏桿菌,並把其中之一株接株實驗動物觀測定其病原性。

(五)人布氏桿菌病

  人類布氏桿菌病之病原菌為平滑型布氏桿菌,在本省迄今尚未發現及分離到波狀熱布氏桿菌及豬布氏桿菌,故感染均為流產布氏桿面。事實上,布氏桿菌對熱非常敏感,於60℃3030分鐘即可殺配,牛乳若經軋斯得滅面才出售應下問題,故一般人要感染上本菌並不容易,所以感染之對象以試驗室研究及工作人員為主,其次為本病污染牧場酪農、屠宰場採材工作人員。本省首宗之病偳報告於1979年,某獸醫研究所之女研究生,因培養繼代流產布氏桿菌面株而感染,其症狀為間歇發熱、畏寒戰慄、食慾及性欲減退、倦怠、肌肉與關節酸痛等,最後由其血清抗體測定而確定。經注射四環素類而癒。其後2~3年,由於採材分離本菌而陸續有3名獸醫、6名實驗室研究或工作人員及1名屠宰場工作員感染本病。污染牧場之酪農,由於與患牛經常接觸,而有5名感染。1986台南市之某污淅場酪農1名,又被感染本病。感染之病原菌經分離鑑定為B.abortus biotype I及II(呂榮修1991)。

二、病原

  布氏桿菌呈桿狀或球桿狀,在組織中呈團塊或單個,人工培養有時呈短鍵狀。無運動作性及芽胞,初分離時偶而有莢胞。革蘭氏陰性菌,雖非抗酸菌,但可抗弱酸脫色,此種特性可剃用Modified Ziehi-Neelsen method供本菌之鑑別染色用。

  布氏桿菌有6種及若干生物型:

  流產布氏捍菌:主要引起牛之流產病,有9個生物型。各型在生化學上及血清學上不相同,但均會被”布氏桿菌噬菌體”所分解,各型菌在氧化代謝試驗上,均有不同之特性。本省早期分離株均為biotype I(呂榮修等1964、林本欽1965),但後來之分離株則發現有biotype I 及II(蔡義雄等1985、呂榮修1991)流產布氏桿面除感染牛外,其他動物之感染較少,但常會感染人類(呂榮修1991)。

  波狀熱布氏桿菌:主要引起綿羊及山羊布氏桿菌病,亦會使牛發病,並會感染人類,為一種重要之人畜共同傳染病。波狀熱布氏桿菌有3個生物型,但其彼此間只有與單一特異血清之反應不同而已。  

  豬布氏桿菌:有4個生物型,第1~3型仍豬之主要病原菌,其中第2型與歐洲野兔之流行病有關。第4型可引起馴鹿之布氏桿菌病。B. suis對人類有高度病原性。

  犬布氏桿菌:為犬高度傳染性病原菌,犬兩性均會感染。除對人類少數個感染病例外,本菌對其他動物之感染性迄無報告。犬除感染本菌外,亦會感染流產布氏桿菌、波狀熱布氏桿菌。

  羊布氏桿菌:引起公羊泛性副睪炎。在大量飼養綿羊之地區,本病在經濟上很重要。公畜為主要感染畜,但亦會傳染母畜。B.ovis對人類之病原性迄今不清楚。木鼠布氏桿菌:仍由美國西部之沙漠木鼠所發現者,由於迄今只分離到27株,故其病原性及重要性仍不明瞭。

  布氏桿菌各菌種間之形狀及代謝極相近,其中B. abortus, B. melitensisB. suis之菌落為平滑型,另生種為組糙型。各菌種之區別可利用表1之培養性狀差異而區分之,其中之色素育試驗,色素先以蒸鎦水泡感0.1液,放素氣中20分鐘或沸水中1小時滅菌後,依所需加入溶融之布氏桿菌用培養基而使用。

三、診斷

  由於操作簡單及可靠性很高,血清學試驗已被廣泛應用以診斷布氏桿菌病。在本省亦使用血清學試,其採材檢驗及處理流程如下:

  由各縣市家畜疾病防治所調查其區內乳牛牧場數及頭數,6月齡以上之牛隻全部釘耳號或烙號,並登記列管。所有列管之乳牛每年約3月及9月間各採血一次,血清在各縣市防治所先以平板凝集抗原作初步篩選試驗,血清急速平板試驗陽性牛隻列為疑陽性牛,其血清立刻轉送到台灣省家畜衛生試驗所複檢,同時通知畜主把該牛隻隔離飼養。複檢使用試管凝集試驗及補體結合試驗,複檢結果立刻通知各縣市防治所並副本報告農業委員會及省政府農林廳。由各縣市防治所把檢驗結果通知畜主,制家為陽性之牛隻,在該牛經評價後,即需立即淘汰送屠,其損失由政府作部份(約20%)補償,陰性牛則立即解除隔離。

  布氏桿菌病之血清學檢驗方清有很多:

(一)凝集試驗

  (1)陰速平板凝集試驗

  本試驗方法非常簡單,只需在玻璃平板上放抗原液及待測血清各1滴,4分鐘後依其有否凝集而制斷為陽性或陰性。本試驗法之操作幾乎不受任何限制,亦無需設備,臨床上使用非常方便,為臨床獸醫最樂意使用之試驗。

  本試驗使用之抗原,早期使用台灣省家畜衛生試驗所製造之標準平板凝集抗原,仍平滑型菌體(約4%)懸於0.5%石碳酸生理鹽水,經以國際或國家標準血清調整濃度,使其與30國際標準單位(IU)之血清可產生凝集,而20IU者則否。標準平板凝集抗原之敏感性很好,操作簡便,故一般使用於初步之血清簡選試驗,但其特異性不佳,常造成多量之偽陽性。Difco公司出品之平板凝集抗原即為染色之此種抗原,故在乳羊及豬之疫情調查常造成偏差(王再智等1960,國立嘉義農專1984)。楊子儒等(1959)曾試用酸性抗原以改善此種缺點,可惜未實際付之應用。直到1980年,吳義興等試製成功酸性化之玻瑰苯原,經成品化上市而應用,由於本抗原敏感性及特異性均極佳(陳素貞等1981),使本省布氏桿面病之檢查工作展開另一新頁。玻瑰苯抗原仍平滑型布氏桿菌菌體,以玻瑰苯色素染色後,懸於PH3.65之特製緩衝液中,經標準血清調整其濃度而成。在美國使用之Card test其抗原亦為此類抗原。

  (2)乳環凝集試驗:本試驗使用之抗原為,平滑型全菌體以Haematoxylin染色後,懸於PH4.0之緩衝液而成。試驗測定時,小試鈉中放1ml經冷藏48~72小時之乳液,加1滴(0.03ml)抗原液,以食指蓋住管口,輕輕到轉數次以混合,直立放37℃1 小時後制定。乳酪層之藍色若比乳液層深為陽性,若較淺或相等則為陰性。

  本試驗法雖然敏感性及特異性均比平板凝集試驗為差,但是由於不需採血,只需1支試管,隨時可在牧場測定,因此常提供紿酪農或集乳站,供檢查混合後之桶乳,以偵測乳牛群有否感染布氏桿菌病。在本省吳義興等(1985)亦曾試製此種試驗用抗原供用,但由於每年之血清學檢查及控制極為徹底嚴密,酪農或集乳站均很放心,因此使用之意願亦很低。

  (2)試管凝集試驗:

  使用之抗原與標潗平板凝集抗原相似,但濃度約為其1/10,並經以國際標準血清調整濃度,使其與21U之血清呈50%凝集。在玫瑰苯抗原應用於臨床篩選試驗後,移送複檢之疑性血清大量減少,本抗原使用量不多,因此雖然陳素貞等(1982)曾製出試管凝集試驗用抗原,為顧慮成本而未予成品化,本省目前仍然使用日本家畜衛生試驗場製造之抗原。

  本試驗測定時,血清以0.5%石碳酸生理鹽水,自1:5作2倍糸列稀釋後,加入等量之抗原混合,放37℃1液後判定。以血清稀釋1:20(最終稀釋倍1:40)呈50%(++)或以上凝集為陽性,1:10(最終稀釋倍1:20)呈50%凝集(++)為疑陽性,1:10呈25%(+)凝集或以下為陰性。

  (4)Coomb test:

  有些動物及人類血清所含之布氏桿菌病特異性抗體與原結合後卻不會凝集,推測仍某些抗體之抗原結合位被佔住,阻止凝集反應,即所謂之不完全抗體。Coombs試劑引起凝集反應。Cooomds 試劑仍待測動物血清球蛋白或全血清之特異性抗血清。Coomds 試驗應用於人類血清時,稱為抗人類球蛋白試驗,應用於牛血清時,稱為抗牛球蛋白試驗。

  使用懸於生理鹽水之全菌抗原。可把試管凝集試驗用抗原離心,並以生理鹽水洗3次後重懸為濃度菌而使用。試驗測定時,待檢血清以生理鹽水稀釋後,如試管凝集試驗操作。無凝集反應之試管,以2500g離心20分鐘,倒去上清液,離心時應避免溫度上升使抗體與抗原之結合脫離。沉澱以生理鹽水洗3次,第3次之離心沉澱懸於,含定量Coombs試劑之原量生理鹽水。試鈉再放37℃24小時後,依一般凝集試驗作判定。通常以最終稀釋倍數1:40呈50%或以上凝集為陽性。

  另一種改良方法是,於最後階段改用平板試驗,在初次試驗洗3次後之沉澱,加入3~4滴之生理鹽水懸浮,取1滴與1滴稀釋Coombs試劑放玻璃板上,以牙籤混合,再放人密封之含濕之盒中,放37℃30分鐘後,以低倍顯微鏡觀察。此步驟最好作一對照試驗,即玻璃板上放懸液2滴,其中12滴與1滴稀釋Coombs試劑混合,另1滴與1滴生理鹽水混合,放37℃30分鐘後制定,如此可知其凝集是否為特異性之反應。

(二)補體結合試驗

  免疫蛋白與抗原結合後即會與補會結合而產生反應,當抗原為紅血球時則產生溶血,若抗原為微生物或其成份,雖不能產生可見之變化,但補體已被抗原-抗體複合物利用而結合,此時再加紅血球及其免疫球蛋白,因無可利用之補體而不能產生溶血。由此而偵測血清中有否特異性抗體之存在。

  抗原使用布氏桿菌全菌或其魯多醣抗原,依Alton等(1975)之方法而作測定。補體由10頭以上天竺鼠採集之混合血清,經測定價後分低溫保存。溶血素使用DIFCO公司出品之50%甘油保存品。綿羊血球為新鮮採集,並經洗3次以上之3%綿羊血球液。血清稀釋1:5產生50%以上溶血抑者為陽性。

  以補體結合試檢驗布氏桿菌病抗體,主要測定IgG抗體,其敏感性與特異性均極佳,故其測定成績為目前國內布氏桿菌病血清學診斷之主要法定依據,本試驗陽性時,即使其他試驗陰性,亦判為陽性。

(三)其他血清學試驗

  布氏桿菌病之其他血清學試驗法很多,包括Rivanol test,2-Mercaptoethanol試驗(吳義興等1987),螢光抗體試驗,凝膠溶血試驗,放射線免疫試驗,淋巴球變形試驗,及皮內接種延遲性過敏試驗等,較新之血學試驗法,后酵素標示免疫吸附試驗(吳義興1987)及斑點酵素免疫吸附試驗(吳義興1990),敏成性及特異性均佳,而且不受血清含抗補會之干擾,尤其後者DOTELISA,不需昂貴之設備,僅用肉眼即可判定,極俱實用性。

四、預防與控制

  布氏桿菌病之預防及控制,需由兩方面著手,撲滅清除本身之污染,及防止外來之污染源。防止外來之污染源,需加強牧場之衛生管理,進入之人員、車輛及器皿管制並嚴密清毒,引進之新牛需自乾淨牧場,並經檢查及短期隔離檢疫。本身污染之撲滅,依美國農業部(1972)建議,最好之方法是把污染牧場全部牛隻屠殺清場,並使牧場空置一段時間,認為此方法最易成功,在長遠目標上為最經濟之方法,但此方法需要龐大之經費以補償畜主之損失,補償價格高低之認定,畜主合作之意願,如何在短期間內處理大量之牛隻等等複雜之問題,使本法很難執行。第2種方是隔離飼養污染牧場中之幼小仔畜,以保留優良品種,其他成畜全部淘汰送屠,保留之幼畜仍需作重複之查以確定本病已被消除,本方法所遇到之困難與第1種方法相同。最差之方法是每個月檢查一次,陽性牛淘汰摘除,直到每90天檢查之連續3次,或每月檢查連續6次,全部均無陽性反應畜為止。他們認為以此種方法撲滅本病之成功率很低,只能用於可疑感染之畜群。

  當污染地區過於廣大,或污染嚴重時,只有使用疫苗作全面之免疫。目前已知之布氏桿菌病疫苗有3種:

  波狀熱布氏桿菌H38菌苗,為馬林殺死之全菌苗,但免疫效果並不理想,故很少被採用。

   流產布氏桿菌粗糙型無毒45/20活菌苗,但此株並不很穩定,它有時會變異成平滑強慣型,因此改用45/20死菌苗並添加媒劑。此種菌苗對曾感染或免疫牛,不會刺激產生對平滑型流產布氏桿菌之凝集抗體,不會干擾自然感染時之血清學診斷。它對感染牛或免疫活菌苗牛則會激發產生很高之清抗體,在本省乳牛布氏桿菌病之撲滅,曾利用此種特性,以此菌苗接種污染牧場之牛,激發潛伏性感染牛之血清抗體力價,以利診斷摘出而予以濟除。

  流產布氏桿菌19號菌苗,為由牛乳中分離出之平滑型無毒株,但卻有高度免疫性,其毒力經數年來迄未有改變,因此19號活苗現在已廣泛應用於3~6個月齡小牛之免疫,它可使小牛產生短暫而很高之凝集抗體力價,保護小牛到其第一次懷孕之久(吳義興等1974,蔡義雄等1984)。故在本病流行地區,若以此種苗作免疫,同時作診斷試驗,檢出陽性牛予以淘汰,可使生本病發生率大量減低。但免疫容造成潛伏性感染帶牛,將使本病永遠存在,因此疫苗僅用在本病無法撲滅或無信心撲或之流行地區。

五、展望

  台灣地區乳牛布氏桿菌病經多年之努力終於撲滅,而乳羊、鹿及豬經長期之檢查及臨床調查亦均疏發現有本病之存在,故今後要面對是肉牛及犬之布氏桿面病,此二種動物者若能再加努力予以惱除,則本省可宣佈完全撲滅布氏桿病。

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