十一、牛中山病
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(一) 病名及病原
1. 病名： 牛中山病 (Chuzan disease) 又稱仔牛先天性水無腦症、小腦形成不全症候群 (Hydraencephaly-Cerebellar Hypoplasia Syndrome)。 2. 病原： 本病係由里奧病毒科 (Reoviridae) 的環狀病毒屬 (Orbivirus)，Palyam 群之中山病毒 (Chuzan virus) 感染所引起的牛異常產疾病。 (二) 疾病簡介
本病在 1985 年首先在日本九州鹿兒島市中山町 ( 家畜衛生試驗場九州支場所在地 ) 之畜養牛血液及牛舍內所採取的牛糠蠓分離的新種病毒。本病於 1985 年 11 月至 1986 年 6 月期間，在日本九州地區共有 2,293 頭母牛發生異常產，對養牛戶造成極大損失。 在本省，筆者業於 1989 及 1990 及年調查本省牛群對本病之中和抗體分佈，結果陽性率分別為 47% 及 84%。之後在 1991 午時分別在高雄縣及台南縣由異常小牛首次分離到本病毒，為世界上繼日本之後第二個證實本病發生的國家。並在 1994 年再對本省牛群進行抗體調查，結果陽性率達 91%，顯示本省牛群已普遍感染中山病病毒。 (三) 典型之臨床症狀及病理變化 本病在日本以肉牛發生較多，乳牛為數較少，懷孕牛被感染後並無異常，但感染後會引起白血球減少症及毒血症 (8 小時內 )，病毒經血流至胎盤，引起胎兒感染而發生異常仔牛之生產，異常產多發於懷胎初期 (2-4 個月齡 ) 與赤羽病頗類似。本病比起赤羽病流、早、死產之發生較少，且無頭部，關節或脊柱之彎曲等體形異常病牛，生產之異常仔牛多呈虛弱，無法自力哺乳以起立困雞者多，有神經症狀之仔牛多呈癲病狀發作，四肢屈折或迴旋動作，後弓反張，呆然站立，迴旋等運動。這些病牛多有開口、流涎、眼球之白濁及盲目。 在中樞神經系都有病毒，大部分的異常小牛均呈現大腦之缺損、或是形成不全及腦髓液之滯留，但大部分之病例在腦幹部 ( 海馬角、尾狀角 ) 略以正帶狀態露出或是型態較小，也有水腦症者，雖非必然病變，但在多數例可見小腦缺損或形成不全。 (四) 應採病材
進行病毒分離的材料，是採集流產胎兒的腦、脊髓或是胎盤。對發生無法站立而淘汰的牛隻，經剖檢檢查後採集的各臟器，以培養液 (GIBCO Co.) 添加抗生素製成 10 倍乳劑，經低溫 2,500rpm 離心後取上清液保存，供病毒分離用。 現場懷疑病例的牛隻則採集加抗凝劑全血，先經 2000rpm 離心 5 分鐘，分離出血球液及血漿，經分別收集血漿後，血球液部份再經滅菌過的 PBS 清洗 3 次後，以 PBS 還原為原來全血容積，再直入 -80℃ 冷凍保存供病毒分離用。 (五) 綜合診斷 1. 中山病病毒之分離與同定 病毒分離用細胞：主要使用 HmLu-l 及 BHK-21 繼代細胞。細胞培養用培養液是以 Eagle's MEM，添加 8% 胎牛血清，並以 7.5%NaHCO3 調整 PH 為 7.0-7.2。以 24 孔組織培養盤先行培養形成單層細胞，於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞，然後接種 0.2ml 臟器的乳劑上清液或是血球液，在 37℃，5%CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。再將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 l 次，然後加入含 2% Bovine Serum Album 及10%Tryptic Phosphate broth( 以7.5%NaHCO3 調整 PH7.0-7.2) 的細胞培養液 1ml 再送入 37℃5%CO2 的恆溫箱中培養，並觀察 2-7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生，必須再做 2 至 3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可進行電子顯微鏡檢測，或是血清中和試驗作為診斷依據。 (1) 電子顯微鏡檢測： 從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液，先以 3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，然後再以超高速離心 10 分鐘 (90,000rpm 氣動式離心機 )。取出沉澱物經負染色後，以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。赤羽病病毒的型態為圓型，有時有外套膜包被著，病毒顆粒大小為 50 至 60nm。 (2) 血清中和試驗檢測： 將分離的病毒株進行 10 倍序列連續稀釋後，加入抗中山病病毒的標準血清進行中和試驗，以血清中和的痛毒力價和未加血清的痛毒力價比較，以証實病毒是否受標準血清中和，而判定分離的病毒是否為中山病病毒。 2. 免疫學診斷方法 牛隻一旦受到牛中山病病毒感染後，其體內會產生抗病毒之特異性抗體，故檢測牛血清中是否有抗體就可以診斷牛隻是否已感染病毒。介紹中和試驗方法供檢測牛中山病抗體： 測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，測試其病毒力價，然後小分裝保存於 -80℃ 冰箱中，待每次作中和試驗時取出稀釋使用。受測試的血清必須先經非動化 ( 在 56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘 )，以去除非特異反應因子。取血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM)0.05ml 混合在無菌平底培養盤上做 2 倍序列連續稀釋，並對每一個稀釋倍數做 4 個重複，然後加入 0.05m1( 含 200TCID) 的病毒液，經震盪混合均勻後，再送入 37℃5%CO2 之恆溫箱進行感作 l 小時。經感作後加入 0.1m1 含 3×105 個細胞的細胞懸浮液，並震盪混合均勻，再以透明膠帶封住，置入恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後以形成單層細胞但未產生細胞病變的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 2 倍而判定為牛中山病抗體陽性。 3. 病理學診斷 進行中山病的病理學診斷，主要是在中樞神經及牛隻精神異常的病例可以發現明顯如上訴的病變。 (六) 確診依據 前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主，尤其牛隻在呈現神經症狀或是流產胎兒，所採集的痛材病毒分離率較高。現場懷疑病例牛隻的加抗凝劑全血，進行病毒分離，以及發生牛群的抗體反應也可為診斷依據。 (七) 參考文獻 1. 廖永剛、呂榮修、黃土則、張秋燕 (1994) 臺潛牛群感染赤羽病及中山病病毒之疫學研究，壹灣省畜衛所研報 30：47-54。 2. 三浦康男、後藤義之、甲野雄次 (1987) 牛性異常產，牛異常產。日獸會誌，40；473－480。 3. 黑木洋、秋葉和溫、三浦康男、九保正法、後藤養之、寺尾泰子 (1986)(Culicoides oxystoma)分離，日獸會誌，39；698-703。 4. GotoY., Miura Y. and Kono Y.(1988) Epidemiological survey and epidemic of congenital abnormalities with hydranencephaly cerebellar hypoplasia syndrome of calves occurring in 1985/86 and seroepidemiological nvestigation on Chuzan virus, a putative causal agent of the desease, Japan. Jpn. J. Vet. Sci., 50：405-413. 5. Goto Y., Miura Y. and Kono Y.(1988) Serologic evidence for the etiologic role of Chuzan virus in a epizootic of congenital abnormalitise with hydranencephaly cerebellar hypoplasia syndrome of calves in Japan. Am. J. Vet. Res., 49：2026-2029. 6. Lu Y.S., Liao Y.K. Miura Y. and Chiu S.Y.(1990) Serological investigation of Arbovirus in Cattle in Taiwan . In：The Fifth Ani-mal Science Congress of The Asian-Australia Association of Animal Production Societies, Taipei, proceeding 3：206. 7. Miura Y. Goto Y. and Kono. Y.(1988) Isolation of Chuzan virus. A member of the Palyam subgroup of the genus Orbivirus from cattle and Culicoides oxystoma in Japan. Am. J. Vet. Res., 49：2022-2025. 8. Miura Y., Goto Y., Kubo M. and Kono Y.(1988) Pathogenicity of Chuzan virus, a new member of the palyam subgroup of genus Orbivirus for cattle. Jpn. J. Vet. Sci., 50：632-637.