廿四、傳染性華氏囊病
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(一)病名及病原
1.病名：傳染性華氏囊病 (infectious bursal diease) 又稱甘保羅病或康保羅病 (Gumboro disease)
2.病原：係由傳染性華氏囊病毒 (infectious bursal disease virus) 所引起。
(二)疾病簡介
傳染性華氏囊病係由一種二截雙股 RNA 傳染性華氏囊病毒 (birnavirus) 所引起的雞隻傳染病。2-3 週齡以內雞隻感染本病時，多為不顯性感染，但剖檢時可見華氏囊萎縮，華氏囊細胞到遭到破壞，引起雞隻永久性免疫機能抑制。當 3-4 週齡以上雞隻感染本病時，常爆發急性感染，臨床上以突然發生 ，傳播快速，高死亡率，嚴重下痢、脫水、啄肛及發熱為主徵。時至今日，因本病毒造成感染雛雞之永久性免疫機能仰制，致使雞隻容易二次性感染其他病毒而引起的經濟損失更受重視。
(三)典型之臨床症狀及病理變化
本病臨床表現有兩型，一為無臨床症狀但可造成永久性免疫機能抑制。有臨床症狀顯現的傳染性華氏囊病多發生在 3-7 週齡雞隻。病毒感染後 2-3 天可見羽毛蓬鬆、精神沉鬱、嚴重下痢造成脫水和糞便沾黏肛門周圍繼而有啄肛現象。
剖檢時可見肌肉，尤以胸肌、腿肌及翼肌顯著出血。腎臟腫大，尿酸鹽沉積而蒼白。脾臟腫大，感染初期華氏囊炎症反應嚴重顯現腫大，水腫甚至出血;後期則呈現萎縮。組織切片檢查可見淋巴瀘泡中淋巴細胞變性、壞死。淋巴瀘泡間隔水腫液堆積而加大。另有異嗜球浸潤。粘膜上皮增生，且有囊泡 (cyst) 形成，出血等病變。
(四)應採病材
病材應採華氏囊及脾臟，冷凍送至檢驗室或以冷藏方式於 24 小時內送抵檢驗室。
(五)綜合診斷
1.病原分離及同定
送檢華氏囊或脾臟，加入PBS緩衝液，經研磨製備 10 倍乳劑。低速離心 (1000-2000rpm)10 分鐘，取上清液供病毒分溝。若因細菌污染嚴重，可於上清液中加入抗生素 ( 青黴素 200IU/ml，鏈黴素 200μg/ml) 或先將上清液以 0.45μ 過濾膜過濾。
(1)病毒分離：
雞胚胎接種：以上述上清液 0.1ml 接種到 9-11 日齡 APF 雞胚胎蛋絨毛漿尿膜 (CAM) 上。一般經 3-5 天，引起胚胎死亡，胚胎病變包括腹部水腫脹大。皮下水腫可見出血點尤其在翼部，偶而在腦部及腳趾亦可見相同病變。肝臟可見壞死點、出血點。心臟蒼白，腎臟充血及壞死點，肺極度充血。脾臟腫大且有壞死點。CAM可見出血斑。該項方法最敏感，適用於一般診斷室快速診斷。 細胞接種：病材乳劑 0.1ml 接種雞源 B 細胞來源之株化細胞或雞胚胎纖維芽細胞、雞胚胎肝、腎細包及哺乳動物來源細胞株如 Vero 細胞及 BGM-70 細胞。觀察細胞病變效應如細胞顆粒化、細胞脫落等變化，也可將病材接種於初代雞胚胎華氏囊 B 細胞。其步驟如下：取 18-20 日齡雞胚胎華氏囊，置於 PBS 緩衝液，以剪刀剪碎後，再用鋏子分離華氏囊組織，使B細胞游離。接著以 1000rpm 低速離心。去上清液後，將細胞懸浮於 RPM11640 培養液。分裝約 2ml 於試管中並接種病材乳劑 0.1ml，以懸浮培養方式在 37℃ 中培養 2-3 天。
(2)病毒鑑定：
因為 IBD 病毒能在雞胚胎或 B 細胞中增值，但不一定會在纖維芽細胞中增值。所以病毒鑑定方法，一般需配合燭光標示抗體染色或使用電子顯微鏡直接鏡檢病毒。 直接螢光標示抗體染色法：將供檢華氏囊病材製作冷凍切片，或將病材接種後 2-3 天之含單層細胞之蓋玻片上，或將懸浮培養 2-3 天之華氏囊細胞離心再將細胞塗抹於蓋玻片上。待乾後。將上述不同來源之組織或細胞先以丙酮固定 10 分鐘。取出玻片。待乾後再滴上螢光標示抗體於 37℃ 染色 40 分鐘。取出玻片以 PBS 緩衝液洗滌三次。待乾後滴上含 50% 甘油之 PBS 液，並覆蓋在載玻片上。以螢光顯微鏡鏡檢。若病材有 IBD 病毒感染，通常可在細胞質內見特異性螢光。 電子顯微鏡鏡檢：將華氏囊病材或經接種之胚胎做成乳劑，或接種細胞液先以 10000-115000rpm 高速離心一小時取上清液，受以 30000-35000rpm 離心 2 小時。吸取管底沉澱物。行負染色後以電子顯微鏡直接鏡檢病毒顆粒。或將上述病材先以 2%formaldehyde 於 4℃ 固定至少 2 小時，製作超微切片以電子顯微鏡觀察。病毒顆粒大小約 70nm，無封套，正二十面體。
2.血清學診斷
(1)β- 病毒中和試驗 ( 病毒量固定-待測血清不同稀釋倍數 )：
a.待測血清在 56℃ 經 30 分鐘非動化。
b.血清 0.05ml( 或 0.025ml) 置於 96 孔微量組織培養盤，再以等量 PBS 緩衝液或不含血清之MEM連續 2 倍稀釋。c.於每孔洞中加入每 ml 含 100-200TCID50 之病毒液 0.05ml(0.025ml)37℃ 感作 1 小時。d.取出測定盤，於每孔洞中加入 0.1ml(0.5ml) 的雞胚胎纖維芽母細胞懸浮。以透明膠帶加封後，培養於 37℃。e.培養 3 日後取出，倒掉培養液。以 95% 酒精固定細胞一分鐘。去固定液後，再以 1% 結晶紫酒精溶液染色一分鐘。f.待測定盤乾燥後判讀。 供病毒中和試驗毒株須是做本試驗所使用之細胞馴化株。另須先測定病毒力價 (TCID50/ml)，再先稀釋到所須之力價。用結晶紫染色因有 CPE 已死亡之細胞無法捕捉染色劑而無法被染色。判讀時以能抑制 50% 病毒增殖之血清最高稀釋倍數來表示中和抗體力價。此外，尚須同時作病毒對照組。先將 100-200TCID50 病毒液連續 10 倍稀釋。每個稀釋倍數至少滴入測定盤 4 個孔洞中，並加入細胞培養。結 100-200TCID50 之病毒液於 4 孔洞中需全部有 CPE 出現，而大於或等於 102 稀釋液應只一孔洞或全部沒有 CPE 出現。
(2)免疫擴散法：
此法操作簡便，但敏感度低且不易定量。
a.抗原製備：以強毒 1000CID50 口腔接種4週齡 SPF 雞隻，經 2-3 天後撲殺並取華氏囊以 PBS 緩衝液做成 10 倍乳劑，和標準血清作用測定其反應適當濃度後，稀釋保存於冷凍櫃中。
b.測定方法：將待測血清及抗原滴入 Agarose 膠體孔洞中，置於室溫溫 18-36 小時。判讀。在上述抗體一抗原孔洞間有無沉澱線產生。此間可以吸水之濾紙置於含膠體之培養皿，以防膠體乾裂。
3.病理學檢查：
剖檢時可見肌肉尤以胸肌、腿肌及翼肌顯著出血。腎臟腫大，尿酸鹽沉積而蒼但；脾臟腫大，感染初期華氏囊炎病反應嚴重顯現腫大，水腫甚至出血；後期則呈現萎縮。組織切片檢查可見淋巴濾泡中淋巴細胞變性、壞死。淋巴濾泡間隔水腫液堆積而加大。另有異嗜球浸潤。粘膜上皮增生，且有囊泡 (cyst) 形成，出血等病變。
(六)確診依據
本病臨床病狀及病理學檢查 ( 尤以華氏囊病變 ) 結果應進一步和血清學反應及病毒分離同定之結果相配合，以確實診斷本病。惟以細胞分離本病毒相當困難。因此，可利用聚合脢連鎖反應或核酸探針直接測定病材中的病毒核酸；另外，也可利用酵素接合免疫吸附法 (ELISA) 替代血清中和試驗，一次測定的量血清樣品，節省時間。
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