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牛傳染性鼻氣管炎

內容
目的
牛傳染性鼻氣管炎實驗室診斷標準作業程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行牛傳染性鼻氣管炎病毒分離及鑑定操作時所必須遵循之程序，以確保實驗室及操作人員之安全。
 
名詞定義
1. 牛傳染性鼻氣管炎：
  牛傳染性鼻氣管炎是由牛第一型疹病毒（bovine herpesvirus 1; BHV1）引起之牛隻傳染性疾病。本病臨床症狀以上呼吸道症狀為主徵，有粘液樣或化膿性的鼻液，發病時亦可見結膜炎。一般常見的症狀為，發燒、沉鬱、無食慾、流產、泌乳下降。同時本病毒亦可感染生殖道，造成膿皰陰戶膣炎或是龜頭陰莖炎。本病的感染率很高，若於發病時給予適當的症狀療法則死亡率很低。許多感染是沒有症狀，而是呈持續感染（persistent infection）若有二次細菌感染，則可造成更嚴重的呼吸器病，病理檢查可發現鼻炎、喉炎、氣管炎。
   
2. 牛傳染性鼻氣管炎病毒：
  BHV1是Alphaherpesviridae亞科中varicellovirus 屬中的一員，病毒的基因組含有雙鏈的DNA ，可製造30~40 個結構蛋白，其中位於病毒表面的醣蛋白對於致病與免疫最為重要。經由DNA限制的分析可將BHV1分為，第一亞型、第二A亞型（似IBR）與第二B亞型（似IPV）病毒，第二B亞型病毒之毒力較第一亞型病毒為低，雖然如此，但BHV1之抗原仍只有一種。
 
設施及材料
(1) 實驗室：符合國家安全標準II級實驗室
(2) 高速離心機：Himac SCP 85H2, Hitachi
(3) 離心機：KOKUSAN, H-103N
(4) 桌上小型離心機：KM-15200, Kubota
(5) 顯微鏡：Zeiss, Germany
(6) 恆溫箱：Napco
(7) 旋轉振盪器 (rocker)：HIS-50
(8) 水浴槽 (water bath) ：Hotech-810
(9) 酸鹼值測定器 (pH Meter)：JENCO6091
(10) 自動控溫循環機：Perkin Elmer Cetus 9600
(11) 可調式供電器和電泳槽：（Mupid-2同級品）
(12) 螢光顯微鏡：ZEISS, Axiophot
(13) 已滅菌之乳缽和乳棒（台製）
(14) 25 cm2無菌塑膠培養瓶：(Nunc®)
(15) 96孔微量培養盤：(Nunc®)
(16) 24孔培養盤：(Nunc®)
(17) 15 mL離心管
(18) 1.5 mL微量離心管
(19) 0.2mL PCR用微量離心管
(20) 分注器 (pipette aid) 及1-10mL各式滴管 (pipette)
(21) 微量分注器 (pipetteman) 及各式滴尖 (tip)
(22) 牛傳染性鼻氣管炎病毒株
(23) 牛傳染性鼻氣管炎標準血清
(24) MDBK 株化細胞
(25) 兔抗牛IgG免疫球蛋白螢光標示抗體：(Jackson)
(26) 肝素 (heparin)：Sigma
(27) 氯仿 (chloroform) ： Merck
(28) 絕對乙醇 (absolute ethanol) ： Merck
(29) 異丙醇 (isopropanol) ： Merck
(30) 丙酮 (acetone) ： Merck置於-20℃
(31) 磷酸緩衝食鹽溶液：
NaCl (Merck) 8.0 gm
KCl (Merck) 0.2 gm
Na2HPO4.7H2O (Merck) 2.172 gm
KH2PO4 (Merck) 0.2 gm
加蒸餾水至   1,000 mL
以121 ℃ 15 lb / cm2高壓滅菌20分鐘。並以T.S.A. Agar 作無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。
(32) 輸送液：同細胞維持液
(33)

細胞培養液：
每包 1 L裝 MEM 鹽基粉末 (Gibco) 加入滅菌的二次蒸餾水至 1 L。經溶解後加入 2.3 gm 的NaHCO3，以0.22μm Millipore 過濾並分裝於 500 mL 血清瓶內， TSA agar無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。
(34) 細胞生長液：
每 100 mL MEM 細胞培養液內加入10 mL 胎牛血清(10%) 及抗生素 (penicillin 100 U/mL 和streptomycin 100 ug/mL，供細胞增殖培養用。
(35) 細胞維持液：係於每 100 mL MEM 細胞培養液內加入 2 mL 胎牛血清 (2%)及抗生素（同細胞生長液），供細胞維持用。
(36) QIAamp DNA Mini kit-DNA純化套組(QIAGEN)：
每組包含以下： Spin columns 250 個
  收集用離心管(2mL) 750 個
  Buffer AL 54 mL
  Buffer ATL 50 mL
  Buffer AW1 95 mL
  Buffer AW2 66 mL
  Buffer AE 110 mL
  Proteinase K 6 mL
(37) 引子溶液：引子1 (IBR gp1F852) (濃度為5μM)
　引子2 (IBR-gp1R1533)(濃度為5μM)
　引子3 (IBR-gp1R1470) (濃度為5μM)
(38) 1.25 mM dNTP 混合溶液：
在 360μL 無菌蒸餾水中，各別加入 10μL 濃度為 50mM 的 dATP，dCTP，dGTP 和dTTP (phamacia)。
(39) 100 bp DNA分子量標記(Gen Sura Lab. Inc.)
(40) 載入緩衝液 (loading buffer) 為含 0.25% Orange G 之 30% 甘油溶液。
(41) 50 X TAE 緩衝液：
Tris base   242 g
Glacial acetic acid   57.1 mL (pH 8.0)
0.5 M EDTA   100 mL
加蒸餾水至 1 L。供洋菜膠片製作和電泳用。
(42) 2﹪瓊脂膠溶液 (agarose)：
  取2 g agarose (Difco或同級品)加入100 mL之1x TAE電泳緩衝液配製成2﹪瓊脂膠溶液，以微波爐加熱溶解瓊脂膠直到呈現完全透明狀態。置於55℃恆溫水槽中，待內外溫度平衡後加入50 ng之溴化乙醯液(ethidium bromide)將膠液倒入製膠台中，插入電泳梳(comb)，待膠液冷卻凝固後拔出電泳梳。將膠片裝入塑膠袋密封後，置入4℃冰箱中保存。
(43) Buffered glycerol mounting medium：
磷酸緩衝溶液/甘油混合液 (1:1) 並混合均勻。
(44) prozymeTM聚合 (protech; 2U/mL)
(45) 10 X prozymeTM 聚合緩衝液 ( protech）
 
初代分離培養樣品採集與處理
1. 可疑牛隻病例的鼻汁呈漿液性而尚未變成粘膿液性的情況可採集病牛鼻腔拭子，要選取發燒且流漿液鼻汁牛的樣品較容易分離出病毒，病牛若已出現化膿性或出血性鼻汁通常分離的結果常是陰性。若是陰戶膣炎或龜頭陰莖炎時則從生殖器採集拭子。
2. 拭子應用力從粘膜面採集，包皮部位亦可用生理鹽水洗滌採集。採集樣品後的拭子置於輸送液（細胞培養液含抗生素與2 ％的胎牛血清），在4 ℃冷藏並迅速送到實驗室。
3. 鼻汁和陰道分泌物樣品的處理：
  鼻汁和陰道分泌物樣品拭子到達實驗室後，先在運輸液內振盪數秒，然後去除拭子將運輸液以750 xg低溫離心10分鐘，收集上清液，保存於- 70℃可供病毒分離或抗原檢測用。
4. 病材乳劑的製備：
  在屍體解剖的病材，採集呼吸道粘膜，其它如扁桃腺、肺、脾、腎、胎盤均需檢查及採集病材供病毒分離或抗原檢測用。臟器病材約0.5g 以無菌剪刀和鑷子剪切成小塊，放置無菌乳缽內以乳棒磨碎，再加入 5 mL 細胞培養液沖散後移至 15mL 離心管內，經 1,000 xg 低溫離心 5 分鐘，收集上清液即製成10％（W/V）乳劑，保存於-70℃可供病毒分離或抗原檢測用。
5. 精液病材的製備：
  從精液做病毒分離則需特別處理，因為精液內含有一些酵素因子對細胞有毒性，而抑制病毒在細胞內的複製，故一般精液樣品須先處理過後才供病毒分離用。最少需0.5mL之原始精液，且需2次細胞繼代才能分離病毒。若是經過稀釋的精液，則要取相當於原始精液的精液量。原始精液通常對細胞有毒性，故接種細胞前要先稀釋，取0.2mL新鮮精液加入2mL胎牛血清（無BHV1抗體）。用力將它混合，室溫靜置10分鐘後，小心吸取上清液保存於-70℃可供病毒分離用。
 
牛傳染性鼻氣管炎病毒之鑑定
1. 株化細胞分離病毒與同定：
  病毒分離之診斷是以上述的病材接種繼代細胞如：初代或繼代之牛腎、肺、睪丸細胞，胚胎來源之牛胎肺、鼻甲骨、氣管細胞株及MDBK細胞等均可適用。
(1) 細胞繼代：
(a)

以目視及鏡檢選取生長良好，無污染細胞株於25 cm2塑膠培養瓶長滿後，於無菌操作台內操作。首先抽棄培養液，並於每支塑膠培養瓶加入 3-5 mL 胰蛋白酶細胞消化液(trypsin)沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次倒出胰蛋白細胞消化液時，留少許消化液於塑膠培養瓶內。
(b) 將塑膠培養瓶置於 37℃ 消化三分鐘或直至細胞脫落後，注入15mL細胞生長液用滴管將細胞沖散作成細胞懸浮液並計算細胞數。
(c) 取0.1mL上述細胞懸浮液加入0.9mL 0.4% trypan blue染劑。以細胞計數器，計算細胞數。加入適量細胞培養液，將其濃度調整為5x105 細胞/亳升。
(d) 各取5mL細胞懸浮液分別注入三支25 cm2角瓶內，置入37℃恆溫箱中培養。
   
(2) 鼻汁和陰道分泌物樣品或病材乳劑接種：
(a) 約第二天後待細胞增殖成單層細胞，取三支25cm2角瓶將瓶內培養液吸除，加入等量的細胞培養液輕輕洗去細胞碎片後吸除培養液，再重複沖洗一次。一支瓶內接種0.5mL的鼻汁和陰道分泌物樣品或10% 病材乳劑；一支接種0.5mL的細胞培養液做為陰性對照；另一支接種0.5mL牛傳染性鼻氣管炎病毒做為陽性對照，三支同時置於旋轉振盪器之上，於37℃恆溫箱中，進行一小時感作反應。
(b) 操作陽性對照時必需非常小心不可污染到其它的試驗，可在最後才操作陽性對照。
(c) 分別將瓶內培養液吸除，加入3至5mL的細胞培養液輕輕洗去未感作的病毒，然後再加入細胞維持液3 mL，置入37℃恆溫箱中培養。最後才可操作陽性對照以避免污染。
   
(3) 判定：
(a)

在顯微鏡下每日觀察是否有細胞病變作用，若有病毒感染者通常3天內會有葡萄串狀的圓化細胞聚集圍在單層細胞破孔的周圍。有時多核的巨細胞亦可見。若有CPE可取病毒液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒，或是以牛傳染性鼻氣管炎標準血清做間接螢光染色法來確認。
(b)

若七天後仍無CPE，培養細胞以-70℃冷凍、再解凍後離心取上清液再以上述步驟五、2.方法，接種新的單層細胞。
(c) 若有CPE可取病毒液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒，或是以牛傳染性鼻氣管炎標準血清做間接螢光染色法來確認。
   
2. 從精液分離病毒：
(1) 以目視及鏡檢選取生長良好，無污染MDBK細胞株於24孔組織培養盤長成單層細胞後。
(2) 每孔接種0.3mL 精液／血清混合液到MDBK細胞上，37℃感作1小時（方法如前述之五、1.(2)步驟）。
(3) 去除混合液，以1mL 維持液將單層細胞洗2次，再加入1mL 維持液/孔。
(4) 本試驗需含有BHV1陰性與陽性的對照，但必需非常小心不可污染到其它的試驗。可最後才操作陽性對照，並且使用不同的細胞培養盤。
(5) 顯微鏡下每天觀察是否有CPE，若有CPE，則再做間接螢光染色法來確認。
(6) 若7天後仍無CPE，培養細胞以-70℃冷凍、再解凍、離心取上清液，接種新的單層細胞。若經2次繼代後觀察7天仍無CPE，樣品則可認為是陰性。
 
聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction； PCR)
1.

應用反轉錄聚合鏈反應技術，計設出一組具特異性的引子可檢測病材中牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸，引子核酸序列如下：
 

引子1 (IBR-gp1F852)，序列為：
5'- GGCATCGGCGTCATTTACAA-3' （正鏈）
  引子2 (IBR-gp1R1533)，序列為：
5'- TCGTCTCGCAGCATTTCGTC -3' （負鏈）
  引子1和2配對進行PCR合成的產物大小為682 bp。若想提高病毒核酸檢測的敏感性，可在引子序列內側再設計一個引子3，將合成的PCR產物再利用引子1和3進行巢式PCR可以提高1000倍病毒核酸檢測的敏感性。
 

引子3 (IBR- gp1F1489)，序列為
5'- GCACCCAGTCCCAGGCTACC -3' （正鏈）
  引子1和3配對進行PCR合成的產物大小為638 bp。
   
2. 病毒去氧核醣核酸(DNA)的萃取方法：
(1) 應用QIAamp DNA Mini kit-DNA純化套組來萃取DNA。 取80 μL病材乳劑（鼻汁或陰道分泌物或精液）置於1.5 mL微量離心管中，加入1001μL Buffer AL，再加入20 μL proteinase K劇烈震盪後置於56℃水浴槽中，作用直到組織塊完全消化為止，一般需要1-3小時，作用期間每小時可以震盪2-3次，加速消化作用。
(2) 加入200 μL Buffer ATL壓住微量離心管頂蓋，劇烈震盪15秒後置於70℃水浴槽中作用10分鐘，短暫高速離心除去附著於蓋內邊緣的液體。
(3) 加入200 μL 絕對乙醇 (96-100%)，間歇性震盪約15秒後,短暫高速離心除去附著於蓋內邊緣的液體。
(4) 取一Spin column下面套上2mL離心管，將液體滴入Spin column內蓋緊蓋子6000xg (8000rpm) 離心1分鐘，保留Spin column將離心管丟棄。
(5) Spin column下面換一個乾淨的2mL離心管，小心打開Spin column蓋子，加入500 μL Buffer AW1蓋緊蓋子6000xg (8000rpm) 離心1分鐘，保留Spin column將離心管丟棄。
(6) Spin column下面換一個乾淨的2mL離心管，小心打開Spin column蓋子，加入500 μL Buffer AW2蓋緊蓋子20,000xg (14,000rpm) 離心3分鐘，保留Spin column將離心管丟棄。
(7) Spin column下面換一個乾淨的1.5mL離心管，小心打開Spin column蓋子，加入200 μL Buffer AE置於室溫作用5分鐘，6000xg (8000rpm) 離心1分鐘，收集濾液。重覆一至二次這個步驟，從column中析出的DNA量可以增加15%。若不立即進行PCR反應可將DNA保存於-20℃中備用。
3. 聚合鏈反應(PCR)：
(1) 取一0.2 mL PCR離心管依序加入下項：
DNA template 10 μL
DDW 61.5 μL
10X prozyme buffer(protech) 10 μL
dNTP(1.25 mM) 8 μL
primer 1(5μM) 5 μL
primer 2(5μM) 5 μL
prozyme(1U/μL) 0.5 μL
反應總體積為100 μL，反應液混合均勻後將離心管置於循環加熱器上。
(2) 循環加熱器設定時間和溫度反應條件如下：
 
File 1 ： 94℃，40秒→60℃，40秒→72℃，40秒
35個循環
File 2 ： 72℃，10分鐘
File 3 ： 4℃保存
(3)

最後產物以1%電泳膠片，分析產物分子量大小約682bp。
   
4. 巢式聚合鏈反應(Nested PCR)
(1) 取一0.2 mL PCR專用離心管依序加入下項：
RT-PCR 產物 2 μL
DDW 69.5 μL
10X prozyme buffer (protech) 10 μL
dNTP(1.25 mM) 8 μL
primer 1(5μM) 5 μL
primer 3(5μM) 5 μL
prozymeTM (1U/μL) 0.5 μL
反應總體積為100 μL，反應液混合均勻後將離心管置於循環加熱器上。
(2) 循環加熱器設定時間和溫度反應條件如下：
 
File 3 ： 94℃，40秒 → 60℃，40秒 → 72℃，40秒
35個循環
File 4 ： 72℃，10分鐘
File 5 ： 4℃保存
(3) 最後產物以1%電泳膠片，分析產物分子量大小約638bp
   
5. 電泳分析
(1)

取出5 μL的100 bpDNA分子量標示預先與2 μL 6倍載入緩衝液混合均勻後注入齒槽洞第一孔中，PCR或Nested PCR反應產物取出10 μL預先與2 μL之6倍載入緩衝液混合均勻後依序注入齒槽洞中。
(2) 將電極選定為"-"極到"+"極，以100伏特電壓泳動約20分鐘。電泳完畢後將膠片置於UV透視燈下觀察。
(3)

陽性樣品及陽性對照組會出現一條分子量682 bp之PCR產物或638 bp之Nested PCR產物，陰性樣品及陰性對照則無產物出現。每次反應皆須包括一個陰性對照及一個陽對照。陰性對照：不含病毒 RNA，以12 μL 蒸餾水代替，其餘皆與試驗組相同。陽性對照：RNA template為純化的牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸溶液。
 
血清學診斷
 
牛傳染性鼻氣管炎的血清學診斷方法以中和試驗來比較配對血清 (pair serum) 力價，第一次是採集急性發熱期病牛血清，經過10至15天再採集相同發病牛隻血清，進行中和試驗檢查，以感染期中和抗體力價升高 4倍以上判定為牛隻感染牛傳染性鼻氣管炎。實施中和試驗的方法如下：
1. 試驗用種毒保存：
  測試中和抗體之前先要準備一批試驗用種毒，先小分裝保存於-80℃冰箱中，待每次進行中和試驗時取出稀釋使用。並於每次使用前先測試其病毒力價，以病毒力價達105 TCID50/mL以上方可供為中和試驗使用。
   
2. 血清的處理：
  將採集的牛隻血清經分裝標示後保存於-20℃。於血清測試前，須先經非動化的處理，方法是將已溶解回溫的血清放置在56℃水浴槽，靜置30分鐘後，以去除特異反應因子，然後供為中和試驗用。
   
3. 中和試驗的方法：
(1) 取96孔微量培養盤以細胞培養液做為血清的稀釋液，將血清從原液進行2倍序列連續稀釋至256倍。A1至H1孔先加入50μL稀釋液，取50μL血清樣品加入A1孔混合均勻後，再由A1孔取50μL兩倍稀釋血清加入B1孔混合均勻後，再由B1孔取50μL四倍稀釋血清加入C1孔，連續重覆相同步驟直到H1孔，再由H1孔256倍稀釋血清取50μL丟棄，最後每一孔稀釋過的血清體積皆為50μL。血清樣品稀釋方式如下：
   
(2) 每個血清至少做2孔A1和A2 (duplicate)，每個96孔微量培養盤可以檢測6個血清樣品。
   
(3)

陽性、弱陽性、陰性血清之序列稀釋液亦需與試驗樣品一同操作，另加一組為未加稀釋血清做毒性對照。
   
(4) 從-80℃超低溫冷凍櫃中取出牛傳染性鼻氣管炎病毒株，待溶解後以細胞維持液稀釋成200 TCID50/mL，病毒力價是否正確，另以病毒的回歸力價測定。
(a) 稀釋血清每孔加入50μL 含有200 TCID50/mL 的牛傳染性鼻氣管炎病毒，在毒性對照孔則以培養液取代病毒液，細胞對照則是不加樣品血清也不加病毒而加100μL 之培養液替代。血清試驗樣品及陽、陰性對照組的微量培養盤振盪混合均勻後置入37℃，5% CO2培養箱中進行感作1小時。
(b) 感作後，每孔加入50μL之MDBK細胞懸浮液濃度為5×105細胞/mL，最後繼續置入37℃ 5% CO2培養箱培養3-5天，等待判定。
   
(5) 病毒回歸力價測定：
(a) 先製備20、4、2、1、1/2、1/4 TCID50/mL的病毒液。取0.1 mL的200 TCID50/mL 稀釋病毒液加到0.9 mL的細胞培養液稀釋成20 TCID50/mL，於試管振盪器上充分混勻，再取0.2 mL的20 TCID50/mL病毒液加入0.8 mL細胞培養液即成4 TCID50/mL，經充分混勻後，再取0.5 mL的4 TCID50/mL病毒液加入含0.5mL細胞培養液即成2 TCID50/mL，再依相同步驟連續稀釋二次完成1、1/2及1/4 TCID50/mL的病毒液。
(b) 從各濃度之稀釋病毒液 (100、20、4、2、1、1/2、1/4 TCID50/mL)中取50μL加入含50μL細胞培養液的病毒回歸力價對照盤，每濃度之稀釋病毒液分別加入四孔內。並同時與血清試驗樣品及陽、陰性對照組的微量培養盤振盪混合均勻後置入37℃，5% CO2培養箱中進行感作1小時。
(c) 感作後，每孔加入50μL 之MDBK細胞懸浮液濃度為5 ×105細胞/mL，最後繼續置入37℃ 5% CO2培養箱培養3-5天。計算四孔中有幾孔產生細胞病變現象 (CPE)，作為計算病毒回歸力價的測定依據。
   
(6) 力價判定：
(a) 從顯微鏡下觀察CPE，並檢查病毒的回歸力價測定是否為200 TCID50/mL（30~300 log10 TCID50/mL均可接受）、檢查陽性、陰性血清對照、細胞對照。陽性血清對照應在2倍序列稀釋的±1稀釋度範圍之內（±0.3單位），弱陽性對照檢驗結果應為陽性，陰性血清應該沒有中和力價，在細胞對照其細胞應完好不變。
(b) 血清的力價以可完全中和病毒的血清稀釋倍數之倒數表示。任何力價高於2可判為陽性，若血清對照顯示有毒性，則樣品判定為沒有結果，而須重新測試，或血清重新採集一次以供測試，這樣的情形在血清抗體力價高時可用更高的稀釋度做血清毒性對照再來判定。
 
間接螢光抗體試驗 (Indirect fluorescent antibody test)
 
1. 分別將疑似感染牛傳染性鼻氣管炎病毒和無感染任何病毒的MDBK細胞塑膠培養瓶，以前述之細胞消化方式四、1.(1)，作成細胞懸浮液濃度約為5×105細胞/亳升，然後分別在一玻片上滴一小滴，塗抹開後風乾。
2. 分別置入不同的固定槽內，固定槽內加滿-20℃丙酮，固定細胞約10 分鐘後，放置一旁令其自然風乾，若不馬上染色壓片可收集於-70℃保存以維持其抗原性。
3. 牛傳染性鼻氣管炎標準血清先以食鹽緩衝液適當稀釋後(必須先評估測試其最適當的反應濃度)，分別滴於牛傳染性鼻氣管炎病毒感染細胞抹片和未感染對照細胞至可覆蓋抹片為止。
4. 抹片置於37℃濕式恆溫箱內感作30分鐘。抹片以磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌數次後，面朝下輕輕地以衛生紙吸除水份。
5. 兔抗牛免疫球蛋白IgG螢光標示抗體以PBS稀釋100倍每瓶螢光標示抗體，必須先評估測試其最適當的反應濃度，並避免反覆冷凍解凍，使蛋白質變性而凝集)。分別滴於牛傳染性鼻氣管炎病毒感染細胞抹片和未感染對照細胞至可覆蓋抹片為止。抹片置於37℃濕式恆溫箱內感作30分鐘。
6. 抹片以磷酸緩衝鹽溶液(PBS)洗滌數次再以蒸餾水清洗一次，面朝下輕輕地以衛生紙吸除水份然後滴上一滴磷酸緩衝溶液/甘油混合液，蓋上蓋玻片後於螢光顯微鏡下鏡檢。。判讀時先觀察無感染病毒的陰性對照玻片，再觀察感染病毒的陽性玻片，陽性細胞抹片呈現特異性螢光，而其他均需為陰性。若欲測血清於感染細胞呈現特異性螢光時則判為陽性。
 
參考文獻：
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3. Perrin B., Calvo T., Cordioli P., Coudert M., Edwards S., Eloit M., Guerin B., Kramps J. A., Lenihan P., Paschaleri E., Perrin M., Schon J., Van Oirschto J.T., Vanopdenbosch E., Wellemans G., Wizigmann G. & Thibier M. (1994). Selection of European Union standard reference sera for use in the serological diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 13, 947-960.
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◎ 診斷流程圖 ◎

1. 血清學試驗：
  病材：配對血清
方法：中和抗體力價測定，感染期中和抗體力價升高 4倍以上判定為牛隻感染牛傳染性鼻氣管炎
   
2. 病毒學試驗：
A. PCR檢驗
B. 病毒分離
  病材：鼻汁、陰道分泌物、精液、臟器乳劑
方法：接種MDBK細胞株
   
3. 病毒確認：
  間接螢光抗體試驗
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