牛瘟
- 內容
牛 瘟 (Rinderpest , RP)
牛瘟是由麻疹病毒 (Morbillivirus) 所引起，可造成家用牛及水牛的急性及致死性的疾病，綿羊、山羊、豬及狩獵動物等也可被傳染。在非洲的衣索匹亞及南蘇丹，本病仍屬於地方性疾病，在南亞洲的巴基斯坦也是屬於地方病，斯里蘭卡可能也是地方病，在西亞幾乎無本病，但週期性的暴發卻持續發生，而撲滅計畫已開始進行。
臨床上，本病的特徵是發燒，在齒齦、舌尖、頰及硬顎等處會發生漸進性糜爛，並伴有漿液性及黏液膿性的眼鼻分泌物，消化道則明顯的發生嚴重性下痢。
病原鑑定：本病在家用牛及水牛的病例，實驗室的確診是依據急性感染動物的脾臟。淋巴結乳劑或眼鼻分泌物在瓊脂膠片免疫擴散試驗或對流免疫電泳試驗中顯現沉澱抗原。如果發生區域性的蔓延或明顯的動物健康惡化，則必須從淋巴組織乳劑或血液以細胞培養來分離病毒。在有小反芻獸疫病毒感染報告的國家，對於綿羊或山羊的牛瘟病例，不能依據沉澱抗原作為確診方法，因為這二種病毒的沉澱抗原反應是相同的。在此狀況下，必須使用酵素結合免疫吸附法 (ELISA)，在抗原捕捉之後以特異性單株抗體來反應。或是以聚合酶鏈反應，用病毒特異性引子對 cDNA 反應，以供區別診斷。死後變化的檢查，需特別注意皺胃，可能呈現高度充血或灰色的變色，在派亞氏淋巴結 (Peyer's patches) 則會呈現類淋巴的壞死，在盲腸、結腸及直腸則有線性的充血及皺襞脊 (crests of foldes) 變黑。最主要的區別診斷，在綿羊與山羊為小反芻獸疫 (peste des petits ruminant；PPR)，在牛為牛病毒性下痢病，這些疾病的區別需要應用適當的實驗室方法。 血清學測試 現在已有競爭性的 ELISA 方法可用，其可決定因感染野外病毒或接種牛瘟疫苗而在動物體出現的牛瘟抗體。此外，中和抗體的測試也可達到相同的效果。
疫苗與診斷用生物製劑之使用：現在已有組織培養的馴化活毒疫苗可用，對牛而言，接種一次之後即可提供終身的免疫力。對於綿羊、山羊及不同的比賽動物，若特別需要針對牛瘟進 行保護時，也可使用此一相同疫苗。在以血清監控野外PPR病毒出現的區域之小反芻獸族群，為了避免牛瘟免疫的產生，如果需要對小反芻獸瘟疫進行保護，則必須使用同源性的小反芻獸瘟疫疫苗。
壹、診斷技術
牛瘟是由副黏液病毒科 (paramyxoviridae) 的痲疹病毒 (Morbillivirus) 所引起，造成 家用牛及水牛的一種致死性疾病，這個病毒也可以感染綿羊、山羊、亞洲豬 及偶蹄目內的野生種類之許多變種，而不一定出現明顯的臨床症狀。
在歷史上，此一病毒是廣泛的分佈在整個歐洲、非洲、亞洲及西亞，但是在美洲及澳洲／紐西蘭則尚無本病的發生。現在，非洲、西亞及印度次大陸， 都企圖要撲滅牛瘟，因此牛瘟的分佈就迅速的改變。在非洲，過去十年牛瘟是廣泛分佈在北緯 16 度以南，加彭、剛果及薩伊的森林帶以北，在肯亞與坦尚尼亞則進行控制策略，在埃及也是如此。經過泛非牛瘟防疫 (Pan African Rinderpest Campaign) 進行的工作結果，這個疾病在西非似乎減少了，而且現在已局限在南蘇丹及部份衣索匹亞所構成的殘餘點。在最近幾年，這個疾病已發生在阿拉伯半島的大部份國家，而且已向北延伸到伊拉克、以色列、黎巴嫩、土耳其和敘利亞。然而，在西亞牛瘟撲滅防疫 (West Asia Rinderpest Eradication Campaign) 的結果，這個疾病實際上在此區已減少。
在亞洲，這個病毒已成為巴基斯坦及可能包括斯里蘭卡在內的地方病。在印度，撲滅似乎 已是即將來臨。國際畜疫會 (O. I. E.) 已經起草確認程序來決定先前已感染過的國家是否已達到絕對無牛瘟的狀態，而這個程序在最近感染的任何國家，將徹底執行。在二週的潛伏期之後，隨著發生臨床疾病，其特徵是急性的發熱，在此期間前驅症狀與糜爛期者是可分別的。前驅期持續約三天，此期被感染動物會出現 40～41.5 ℃ 的熱病，伴有部份厭食、便秘、可視黏膜充血、漿液性眼鼻分泌物、精神抑鬱及口部乾燥。非特異性臨床症狀接著糜爛期及壞死性口腔病變的發生為牛瘟的特異性臨床診斷的依據。病毒持續在高燒中，在下唇及齒齦處會出現針點大隆起、白色、壞死上皮的斑點，而且迅速蔓延後也可出現在上齒齦與齒墊間的邊緣、舌頭內側、頰、頰部乳頭及硬顎。經由存在病變的擴大及新病灶的形成，在隨後的二至三天，口腔壞死的延伸會更引人 注目。
許多的壞死物質堡壘掉落而造成淺的、非出血性的黏膜糜爛。下痢是牛瘟的另一個特徵，發生在嘴部病變開始後的 1～2 天。起初下痢通常較多而且水樣，隨後可能含有黏液、血液及上皮屑，也可能伴隨裡急後重。在糜爛期時，鼻孔、陰戶及陰道、包皮鞘等處可見到壞死，已完全地厭食， 口部全然乾燥，動物呈現嚴重精神抑鬱，黏液膿性的眼鼻分泌物也產生，呼吸惡臭。在本病的末期，動物會躺著 24～48 小時，在這一期間典型的停止吸入及伴隨咕嚕咕嚕的呼氣聲，將經常可以見到。當出現嚴重的壞死病變、高燒及下痢或是當同樣的感染而其體溫急轉直下，降到正常值以下時，動物即會死亡。偶爾，熱病會輕微的停滯在糜爛期的中間，然後過了 2 ～ 3 天，又會迅速地回復正常，並伴有嘴巴病變消退、停止下痢及不複雜的恢復期。大部份在非洲或亞洲散播的病毒株產生了類似上述的疾病徵候。然而，在阿拉伯半島與輸入高度易感的牛隻時，會出現甚急性感染病例，病畜在前驅期後段即死亡。溫和的病毒株因為嘴部病變短暫且大大減少其病變數目，所 以在臨床上很難診斷，這種現象可能還存在非洲的一部份。
典型的牛瘟病死牛隻的特色是脫水、瘦弱、髒污及惡臭。鼻子和頰帶有黏液膿性分泌物的痕跡，眼睛凹陷及結膜充血。在口腔經常有廣大的壞死上皮脫落，而且與鄰近健康的黏膜區有很明顯的界限。病變通常延伸到軟顎，也可能包括咽部及食道上部。雖然壞死灶偶爾會在瘤胃脊 (pillars of the rumen) 見到，但瘤胃、蜂巢胃及重瓣胃通常不被感染。皺胃特別是幽門區會嚴重感染，並顯現充血、瘀斑及黏膜下層水腫。上皮壞死造成黏膜像石板樣的顏色。小腸平常病變不明顯，除了在派亞氏淋巴結 (Peyer's patches) 發生顯著的變化，類淋巴組織壞死、脫落使下層支持組織裸露或變黑。在大腸的變化，包括迴盲瓣、盲腸扁桃腺與盲腸、結腸及直腸黏膜的縱皺襞脊，在急性死亡之病例 出現高度充血。在久病的病例，皺襞則呈黑變色，這二種病例其病變就如斑馬條紋。
一、病原鑑定
有多種實驗室的測試法是可用來鑑定牛瘟，但瞭解舊的方法之限制及瞭解在同時發生牛瘟及小反芻獸瘟疫之國家，診斷其小反芻獸的牛瘟病例之複雜性是很重要的。
由現在的努力看來，已經直接趨向於世界性的撲滅牛瘟，任何爆發都具有高程度的流行病學重要性，甚至在一些被認為牛瘟是地方病的國家也是如此。同樣的，來自所有爆發的樣品，依臨床或病理學上的基礎，被診斷為牛瘟的案例，都必須做例行的實驗室確認。快速診斷程序將逐漸普及化，但是未來仍然需要病毒分離以作為流行病學的研究及致病性的試驗，因此在診斷過程中保留例行的病毒分離是絕對必須的。牛瘟病毒可以用以 10 國際單位 / 毫升的肝素或 0.5 毫克 / 毫升的 (EDTA) 等抗凝劑抗凝的全血中之白血球培養。樣品需完全混合不可以冷凍，以冰鎮傳送至實驗室，病毒也可以從死亡動物的脾臟、肩胛前淋巴結或腸繫膜淋巴結的樣品分離，這些樣品可以冷卻至零下溫度。 分離病毒時是將抗凝血以 2,500 g 離心十五分鐘使在血漿與紅血球之間產生血塊黃層 (buffy coat)。儘可能將此層取乾淨，與 20 ml 生理食鹽水混合後依據清洗步驟再離心，以洗去血漿中的任何中和抗體。得到的細胞沉澱物，以細胞培養維持液泡成懸浮液，取 2 ml 的細胞液注入已長滿單層的 B95a 小猿類淋巴胚細胞、初代小牛腎臟細胞或非洲綠猴腎臟 (VERO) 細胞的滾軸管中。這單層細胞需定期換液並以顯微鏡觀察細胞病變作用 (CPE) 的發生，CPE 其特徵為折射 (refractility)、細胞圓形化 (cell rounding)、細胞的延長細胞質橋（星狀細胞）回縮或形成融合細胞。病毒的分離可以在感染細胞碎片中存在麻疹病毒特異性沉澱抗原而得以做部份鑑定，也可以使用結合單株抗體 (MAb) 進行特異性免疫螢光抗體反應的証明而得以做完全的鑑定。另外，20 % 淋巴結或脾臟的懸浮液也可以供做病毒分離之用，進行病毒分離之前，這些臟器需先在無血清的培養維持液中，以標準的磨碎或剝取技術來軟化，然後再接種在前述的單層細胞中。若只檢查牛隻，則可以用瓊脂膠片免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion；AGID) 或對流免疫電泳法 (counter immunoelectrophoresis；CIEP) 作為快速診斷的技術，來証明感染動物的眼睛分泌物中存在牛瘟的沉澱抗原，這些分泌物需在前驅期或糜爛期時用綿花棒在靠近上下眼瞼處採樣收集。
瓊脂膠片免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion；AGID)：瓊脂膠片免疫擴散測試可在細菌培養皿或在顯微鏡玻片上進行。首先必須用 1 % 高 品質瓊脂或瓊脂醣 (agarose) 的水溶液覆蓋培養皿或玻片約 4 mm 深，等膠片硬了 之後，再以六邊形的打洞器切出周圍六孔環繞中央一孔的形態。使用玻片時， 每個孔的直徑為 3 mm，每孔間的距離是 2 mm；使用細菌培養皿時，每個孔的直徑為 4 mm，每孔間的距離是 3 mm。孔之間距愈短，反應之時間也就較少。使用巴斯德吸管將牛瘟高度免疫兔子血清滴在中央的孔洞中。同樣地，將牛瘟感染細胞的碎片或是從感染 Nakamura III 的兔化病毒株之兔子的腸繫膜淋 巴結乳劑製備的陽性對照抗原放在周圍的第一、三、五個孔中，陰性對照抗原則放在第四個孔中，測試的抗原是從受檢測的脾臟或是淋巴結的切面所得到的滲出液。如果無滲出液可得，則需將一小部份的樣品以最少的生理食鹽水磨碎後供試。眼睛分泌物可直接從棉花拭子搾出，或是用小的注射針筒擠壓出。檢測的樣品則加入第二及第六個孔中。反應最好是在 4 ℃ 或較低的室溫中進行，反應區須在二小時後開始檢查，直到出現清楚鮮明的沉澱線。只有在陽性抗原對照也出現沉澱反應時，其檢測結果才可被接受。
對流免疫電泳法 (counter immunoelectrophoresis；CIEP)：對流免疫電泳測試比 AGIP 測試稍微較能產生陽性反應。反應是在顯微鏡玻片上進行，該玻片先用 1 % 瓊脂或瓊脂醣 agarose 覆蓋約 2 mm 深，然後在 pH 8.6 的 0.025 % 巴比妥醋酸緩衝液 (veronal acetate buffer) 中進行。孔洞是成對的，二個 孔洞周圍內的距離為 6 ㎜。左手邊是陽極，孔內充滿牛瘟高度免疫血清；右手邊是陰極，孔內則是充滿檢測的樣品或是製備的陽性及陰性抗原。樣品是 以每玻片 10 微安培的定電流或以每公分 6 伏特的定電壓跑 40～60 分鐘，之後，在反應區檢查沉澱的生成。
牛瘟及小反芻獸瘟疫的區別：
一、 差別的免疫捕捉： 臨床的觀察與沉澱原檢測試驗無法區別牛瘟及小反芻獸疫，在有此二種疾 病存在的國家，對於綿羊或山羊的所有類牛瘟的暴發，都需強迫施行區別這二種疾病的檢測。雖然這樣的區別可以用實驗動物進行接種試驗，但也可以使用差別的免疫捕捉試驗，進行更快速及有效的區別試驗。 這個試驗使用直接對抗此二種病毒的 N 蛋白的單株抗體，一種可以與此二種病毒反應的單株抗體，是作為捕捉抗體 (capture antibody)，而第二種標有生物素 (biotin) 對非重疊抗原性的 N 蛋白位特異之單株抗體，分別對牛瘟病毒或小反芻獸瘟疫病毒特異，則用來決定是捕捉到那一種 N 蛋白。微量滴定酵素結合免疫吸附法 (ELISA) 盤或條，每孔以 100 ul 的捕捉抗體覆被 (coating)，洗三次之後，每孔加入 50ul 的測試樣品（先以溶解緩衝液作十倍稀釋）、25 ul 的指示劑單株抗體稀釋液（小反芻獸疫稀釋一千倍；牛瘟稀釋五百倍）及 25 ul 的鏈狀抗生物素、過氧化氫酶 (streptavidin-peroxidase)（最後稀釋成 三千倍），然後將這些盤子放在 37 ℃ 定軌搖擺器 (orbital shaker) 上一小時，之後經過洗滌，再加入 100 ul 的正-酚基二氨 (ortho-phenylenediamine)，在室溫十分鐘後加入 100 ul 的 1 N 硫酸終止反應，再以 ELISA 自動判讀機以 492 nm 波長所讀取的吸光值，判讀結果。這個測試可用來確定野外樣品或生長在組織培養中的病毒是牛瘟或是小反芻獸疫病毒。 二、 聚合酶鏈反應： 已開發一種反轉錄聚合酶鏈反應方法可檢測及區別牛瘟與小反芻獸疫病毒，這個技術是以 RNA 製造 cDNA，以供後來的 PCR 增幅。 在這個測試中所用的 RNA 可從硬組織、週邊血液淋巴球 (PBLs)、眼睛或是嘴巴病變拭液來純化。RNA 的萃取是依據 Chomcyznski 及 Sacchi 的酸性 guanidinium thiocyanate 酚─氯仿之方法。硬組織（0.5～1 克）經剁碎，再以 4 毫升的變性溶液將其均質化。眼睛或是嘴巴病變拭液取 1 毫升，從 5～10 毫升全血純化的 PBLs 則取 0.4 毫升依照發表文獻上的步驟來處理，得到的 RNA 先以酒精沉澱，再以 70 % 酒精洗後，溶解在滅菌水並保存在 －70 ℃ 或 －20 ℃ 直到使用。cDNA 合成是使用任意六寡核甘酸引子 (random hexanucleotide primers) 來進行，至少有三對引子產生的 cDNA 可以在 PCR 增幅步驟中被增幅，而且可以檢測及區別這二種麻疹病毒。這些引子包括一對依據高度穩定區的磷酸蛋白基因所設計的「通性」引子，可以檢測所有的麻疹病毒；還包括牛瘟病毒特異性及小反芻獸疫病毒特異性的引子，這些引子是依據各病毒特異性的融合蛋白基因之核酸序列所設計的。PCR 產物是以 1.5 % 瓊脂膠體分析，並以合適的 DNA 標記來鑑定特異性的 DNA 產物。 在每一個 RT－PCR 反應中必須包括陽性對照，諸如麻疹或犬瘟熱病毒 RNA 及以滅菌水取代 RNA 的陰性對照。陽性反應必須經由依據融合蛋白基因序列設計的巢式引子做進一步測試或是將 DNA 產物進行核酸序列分析，以作為進一步的確認。當測試 RNA 病毒的存在與否，在 PCR 步驟中使用一對以上的引子是非常重要的。因為他們的核酸序列很容易改變，而且在引子序列的 3' 端只要改變一個，將使此一引子無法增幅該 DNA。在英國的世界參考實驗室，也是 O. I. E. 牛瘟參考實驗室之一，能夠對野外樣品分析的使用技術提供指導。 三、 血清學檢測：（為世界貿易規定的測試方法） 競爭性酵素結合免疫吸附法可用來檢測任何先前曝露在牛瘟病毒中的動物在其體內的牛瘟抗體。這個測試是依據陽性測試血清與牛瘟抗 H 蛋白 Mab 對牛瘟抗原競爭的能力，在測試血清中出現這種抗體將會阻斷 Mab 的鍵結，造成隨後加入的酵素標示抗老鼠 IgG 結合體與受質／呈色質溶液的呈色反應減 低。因為這是固相的方法，所以清洗時必須確定將所有未反應的試劑移除。牛瘟抗原是從感染馴化的牛瘟 Kabete O 病毒株之 Mardin-Darby 牛腎臟細胞製備而來。抗原是從感染細胞的上清液，以硫酸銨沉澱而得。單源抗體則是將高度免疫過的老鼠脾臟細胞與 NSO 骨髓瘤細胞株融合後而得到，且表現出牛瘟特異性。此 Mab 現在已被稱為 C1。C1 及標準牛瘟抗原都可以直接從位於英國的 O. I. E. 牛瘟參考實驗室取得。 （一）檢測步驟：
1. 將冷凍乾燥的牛瘟抗原以 1 ml 的蒸餾水溶解，並以 pH 7.4 的 0.01 M 磷酸緩衝生理食鹽水 (PBS) 稀釋成說明書上所建議的測試用濃度。 2. 立即分裝 50 ul 的稀釋抗原至平底盤的適量孔洞中，在高度蛋白鍵結的 ELISA 微量盤 (microplate)，每個檢測血清用二個孔洞。輕輕敲打微量盤的邊緣，以確定抗原均完全的分佈在每個孔洞的底部。將盤子密封之後，再將其放入 37 ℃ 定軌搖擺器上作用 1 小時，之後再以 pH 7.4 的 0.002 M PBS 清洗每個孔洞三次。 3. 加入 40 ul 的阻斷緩衝液（含 0.01 M PBS，0.1 % v / vTween 20 及 0.3 % 正常牛血清）至每個檢測的孔洞中，隨後再加入 10 ul 體積的所有測試血清。 4. 依說明書上的建議，以阻斷緩衝液 (blocking buffer) 配製 Mab 的作用溶液，並在每個測試的孔洞中加入此溶液 50 ul，將盤子密封之後，再放入 37 ℃ 定軌搖擺器上作用 1 小時。 5. 依說明書上的建議，以阻斷緩衝液配製兔子抗老鼠免疫球蛋白馬－蘿蔔過氧化氫酶(rabbit anti-mouse horse-radish peroxidase) 結合體的作用溶液，並在每個測試的孔洞中加入此溶液 50 ul，將盤子密封之後，再放 入 37 ℃ 定軌搖擺器上作用 1 小時。 6. 在此時期終了，再依前述方法清洗盤子，並立即加入 50 ul 體積的受質 / 呈色質混合液〔1 份 3 % 過氧化氫對 250 份正酚基二氨 (ortho-phenylene diamine)〕，置於室溫不需搖擺。作用 10 分鐘，再加入由 1 M 硫酸所組 成的終止溶液 (stopping solution) 50 ul。 7. 此測試必須包括已知的牛瘟陽性及陰性血清樣品、Mab 對照及結合體對照 (conjugate control)。 8. 以 ELISA 自動判讀機讀取樣品在 492 nm 波長的吸光值，測試結果與 Mab 對照所得的值比較後，以百分比抑制值來表示，抑制值達 50 % 則為陽性。抑制值小於 50 % 則為陰性。 （二）病毒中和作用試驗
標準的病毒中和試驗是在培養小牛腎臟或非洲綠猴腎細胞 (VERO) 的滾軸管 (roller-tube) 中進行。檢測時，非動化（inactivated）的血清由純血清開始，而後以二倍稀釋或是以十倍稀釋，再與每毫升約含有 103.0 50 % 組織培養感染劑量 (TCID50) 的疫苗株病毒混合，混合液中含有等體積的病毒及血清，置於 4 ℃ 中過夜，之後再取其 0.2 ml 的體積，接種在五支滾軸管的每一管中，並立即加 入 1 ml 懸浮在生長培養基的分散指示劑細胞，其比例是每毫升 2×105，這些管子均斜放在 37 ℃ 三天，之後那些出現病毒特異性的細胞病變的管子則被 拋棄；剩下管子中的培養基，改成維持的成份，然後反覆檢視至十天。 若要計算終點 (end-points)，病毒劑量則要落在每管 101.8 至 102.8 TCID50 之間；血清在與病毒劑量混合之後，則被認為是作二倍稀釋。
這個測試可以用來測 量單一血清中出現的抗體力價或是檢定易感牛隻之疫苗測試或供輸出的牛隻 檢測用。在這些狀況下，在血清的最後稀釋倍數是二倍若出現任何可檢測的 抗體，則被認為是陽性。 微量盤的方法已被描述，其是用 50 ul 的血清與 50 ul 含 101.8 至 102.8 細胞培養 感染劑量 (TCID50) 的病毒稀釋液作用。在作用 45 分鐘或是過夜作用後，再加 入 1 至 2×105 小牛腎臟、小羊腎臟或 VERO 細胞當作指示劑。此測試在 6 或 7 天後結束。本項檢測可以提供在高血清濃度時產生的非特異性中和作用的指 標。
貳、疫苗與診斷用生物製劑 (Requirements for vaccines and diagnostic biologicals) 有關規定
易感性動物可用馴化的組織培養牛瘟活毒疫苗來免疫 (TCRV)，其可產生 終身的免疫力。TCRV 是在從前的東非獸醫研究機構 (East African Veterinary Research Organisation) 開發出來的，它是用牛的牛瘟強毒株 Kabete O (RBOK) 經 連續繼代後所得到。此疫苗用在各種年齡的家用牛、水牛、綿羊及山羊，以 及其他動物都是安全的。
一、種毒管理 (Seed management)
(一) 種毒的特性 (Characteristics of the seed) ：大量用來製造 TCRV 的種毒，必須能產生安全的細胞培養疫苗，且在牛可 以持續至少五年的免疫力，在牛進行至少五次的回歸繼代後仍然保有其馴化 的特性，並且缺乏接觸傳播的能力。用來製造 TCRV 的 RBOK 亞株必須可以 由已寫下的歷史紀錄（包含毒株來源及其後來的操作等資料）所確認。 (二) 培養方法 (Method of culture) 疫苗種毒必須保存在 90 代至 120 代之間的種毒群系統。種毒群病毒必須 以冷凍乾燥方式保存在零下 20 ℃ 的溫度或更低。此病毒必須培養在來自正常 胎牛或非常年輕的小牛之初代或連續培養的腎臟細胞，而連續培養的細胞若 是源自初代培養，則不可以超過十次繼代。 三) 疫苗的妥適性 (Validation as a vaccine) 種毒群必須表現出： 1. 純度：沒有外來的病毒及沒有細菌、黴菌與黴漿菌的污染。 2. 安全：接種到牛瘟易感性牛隻不會誘發不正常的臨床反應。 3. 有效的：在牛瘟易感性牛隻可以誘發其免疫力。 二、製造方法 (Method of manufacture)
每批疫苗均以感染培養的細胞來製造，經過適當的培養期，再收取含有大量活病毒顆粒的培養基。為了能夠長期保存及冷藏分送，這些液體先加入含有 5 % 乳白蛋白水解物及 10 % 蔗糖的抗凍劑後，再冷凍乾燥。病毒可以在胎牛或小牛的初代腎臟細胞生長，也可以在經連續繼代不超過十次的同源腎臟細胞生長。此外，疫苗也可以在被認可的連續細胞株製造，但此細胞株必須是不適於牛病毒性下痢 (BVD) 病毒增殖且能維持在種毒群系統，VERO 細胞即是一種。在組成一批疫苗時，感染培養必須接種相同的種毒且一起培養與收取病毒。二次同套培養的病毒收取液，是可以混合在一起形成大的懸浮液。寫書面紀錄必須包括疫苗製造的每一時期。
三、過程控制 (In-process control)
細胞：初代細胞、連續培養初代細胞或連續培養的細胞株，都必須從外觀正常的動物或胚胎衍生而來，而且在培養期間必須保留正常形態，也必須沒有外來病毒的污染，特別是牛病毒性下痢病毒。當細胞被用來生產疫苗時，沒有感染的對照培養，必須與牛瘟感染細胞使用相同的培養基及培養條件，隨後也須用顯微鏡觀察。在收取疫苗之後，對照培養需洗除牛血清，且再以 含有牛血清取代物的培養基再培養十天，然後再以顯微鏡檢查細胞病變變化。同時，培養的樣品也需用免疫螢光、免疫過氧化氫酶或 ELISA 方法來檢測是否有無細胞病變的牛病毒性下痢病毒存在。培養液中的血清需來自牛瘟易感性動物。
病毒：病毒力價測定是針對種毒在微量盤或滾軸管系統以十倍稀釋來進 行，每個稀釋則使用十個重覆，在最後混合的病毒收取液，也是要做同樣的 測試。來自滾軸瓶培養的病毒，收取的時間不可超過培養感染日十天，病毒 收取液在與抗凍劑混合之前須先以低速離心將其澄清，在冷凍乾燥之前放在 4 ℃ 中不可超過五天，但若放在 －20 ℃ 至 －60 ℃ 之間則可久一點。製造者操作過程 或使用污染的培養基均可造成外來病毒的污染，兔子高度免疫血清可用來中 和混合病毒液樣品中的牛瘟，病毒混合液也要用來感染小牛腎臟或 VERO 細 胞，操作方法如前述。最後的病毒混合液必須測試是否有細菌、黴菌及黴漿 菌的污染。
四、每批控制 (Batch control)
(一) 同一性 (Identity)：從各組混在同一個容器的病毒液，須用兔子牛瘟抗血清中和並接種在牛腎臟細胞，如果沒有發生牛瘟特異性細胞病理作用，則產物的一致性即已建立。
(二) 無菌 (sterility)：無菌及沒有其他生物物質污染的測試，可在第 1.4 章找到。 (三) 安全 (Safety)：隨機選取五支病毒瓶，將其病毒液混合後以接種牛瘟易感性牛隻：一頭接種相當於 100 頭牛野外劑量的體積，另一頭則接種 1 / 10 野外劑量的體積，這些接種動物與未接種的牛隻養在一起三週。在這期間，每天檢測並紀錄這些動物的體溫，同時也做臨床檢查。三週後，這些動物都進行牛瘟中和抗體的檢測，並以可引起熱病的牛瘟病毒株攻擊，如果沒有不正常的臨床反應，二頭施打疫苗的動物均被保護，如果沒有証明疫苗病毒會傳播，則這些疫苗就被認定是安全且有效。這個測試並不是效力測試。每批疫苗也要經測試對小動物無害。 (四) 效力 (Potency) 由於免疫效力與感染度之間的關係很密切，所以感染度常被用作效力測試的基礎。三個感染度力價測定是以被認定的連續細胞株或是從三隻不同的小牛或胎牛的腎臟細胞來進行。在第一次力價測定，可以用安全測試用的病毒混合液。第二及第三次測試則需另外混合病毒，每次均將三個容器之病毒液混合。每次測試所用的細胞之敏感性，必須使用標準實驗室所製備的牛瘟病毒加以測試。最後的力價是取三次測試的幾何平均值，每次測試均以十倍稀釋，而每個稀釋都使用十個重覆來進行。在野外的使用，疫苗的最低劑量是定義為 102.5 TCID50。 (五) 免疫保護期 (Duration of immunity)： 對 TCRV 並不需要例行的測試其免疫保護期。依據研究報告指出，對於沒有移行抗體存在的牛隻，經成功的免疫之後，可預期具有終身的免疫力。 (六) 穩定性 (Stability) ：TCRV 經正確的冷凍乾燥後，是非常穩定。在 4 ℃ 或 －20 ℃ 真空下，產品 可以保存長時期。最近的証據指出冷凍乾燥的 TCRV 之變質速率會因穩定劑的選擇與在乾燥循週期的變動而改變。最有利的結果是使用 5 % 乳白蛋白水解物 / 10 % 蔗糖當作穩定劑。降壓下（100 毫托耳 milliTorr）72～74 小時的乾燥週期， 剛開始時在 －30 ℃ 乾燥 16 小時，最後貯存架的溫度則為 35 ℃。具有高力價的疫苗，可以在田間使用 30 天不需要冷藏。疫苗病毒在以正常生理食鹽水或 1 M 硫酸鎂溶解後，對溫度變得較不安定。經溶解後的疫苗在田間分送的時間不可超過其半衰期，但是半衰期這個變數是因溫度而異。在 4 ℃ 至 37 ℃ 之間， 其半衰期為 8 至 24 小時，必須用常識來限制。這可以由國家管理單位來決定，但是一般建議的期間是 4 小時。 (七) 防腐劑 (Preservatives) ：TCRV 含有乳白蛋白水解物及蔗糖，加入這些是當作抗凍劑，否則它並不含有其他化學的防腐劑。 (八) 預防措施（Precautions; hazards）：在製造或田間使用 TCRV 時，並未有已知的危險存在。