一、牛結核病(獸醫科技資訊網)

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一、牛結核病

內容

(一)

病名及病原

1.	病名：	牛結核病 (Tuberculosis)
2.	病原：	主要之病原菌為牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)，但其他之分枝桿菌如結核分枝桿菌 (M.tuberculosis)，鳥型分枝桿菌 (M.avium) 和其他所謂非典型分枝桿菌 (atypical mycobacterium) 亦可引起本病。但鳥型及非典型分枝桿菌對牛之毒力較弱，一般僅引起局部性病變或不呈肉眼病變。

(二)

疾病簡介

　　結核病廣泛地流行於人類及動物之間，是一種重要之人畜共同傳染病。由於牛感結核病後，其病原菌可經空氣、昆蟲及其乳肉產品而感染人類，因此牛結核病撲滅成為世界各國公共衛生努力之目標，在我國牛結核病為法定家畜傳染病之一，每年所有乳牛必需檢查 2 次，檢查結果若判定為陽性反應牛，則該牛必需撲殺焚燬。

(三)

典型之臨床症狀及病理變化

　　本病為一種慢性病，輕症牛與感染初期牛無臨床症狀，重症牛則呈咳嗽、體表淋巴結腫大、食慾滅退、消瘦及泌乳量滅少等症狀。

　　肉眼病變主要為呈乾酪性壞死之結核結節，最常發生於各淋巴結，本省結核病牛剖檢結果，結核結節發現率以咽背淋巴結 (38.5%) 及腸繫淋巴結 (25%) 最高，其次為肺臟、支氣管淋巴結、深頸淋巴結、縱膈淋巴結及肝臟等。

　　結核結節之中心部為乾酪化壞死區，有時可見鈣化及少數嗜中性球；中間層為上皮樣細胞組成之肉芽腫組織，可發現 Langhan 氏巨細胞之存在；最外層則為淋巴球與纖維芽細胞所包被。

(四)

應採病材

　　結核結節病灶區組織，部份浸 10% 福馬林以供病理切片，另採集無切開之結節組，凍結送檢，供病原菌分離。

(五)

綜合診斷

1.病原分離及同定
　　組織樣品立即浸於 1：1000 次氯酸鈉 (Sodium hypochlorite)，小心剪去脂肪及結締組織，再換浸於新鮮次氯酸液 1：1000 中 1 夜，隔天取出病材再於新鮮次氯酸液中洗一次，病材無菌操作剪或切細，檢查切面有否病灶並記錄之。病材加含 0.4%phenolred 之 Nutrient broth 15ml，放入乳化器中乳化，取 5ml 接種以下培養基 ( 註 1)

Stonebrink's
Middlebrook 7H-10(with OADC & Sod. pyruvate)
Herrold's(with glycerine，malachite green，without mycobactin)
Lowenstein-Jensen(with glycerine)

　　取 5ml 凍結於 -20℃ 保存，最後剩餘之 5ml 加 0.5N NaOH 5ml，混合，室溫放置 10 分鐘，滴加 6N HC1 到色變黃，滴加 1N NaOH 到色變粉紅，放室溫 5 分鐘測其色未變，放 15 分鐘後，離心 1650g(2500rpm)30 分鐘，去上液到剩約 1ml 接種以下培養基 ( 註 1)：

Stonebrink's
Herrold's(with glycerine，malachite green，without mycobactin)
Herrold's(without glycerine，malachite green，and mycobactin)
Lowenstein-Jensen(with glycerine)

　　接種剩物保存 4℃24 小時，必要時可再接種。若接種者均污染，可取出凍存乳劑，改以 2%NaOH 處理 20 分鐘。
分枝桿菌菌種之同定方法如下：
(1)初代菌落之檢查

a.	牛型分枝桿菌：於 Middlebrook's 7H-10 培養基呈無色、扁平、不規則、於透光下呈粗鈍狀。於 Lowenstein-Jensen 培養基呈無色乳頭狀菌落。於 Stonebrook 培養基呈白色濕性凸起菌落，與 M. avium 之菌落相近。Glycerine 對 M. bovis 之初代發育有礙，應使用無添加甘油者。
b.	結核分枝桿菌：於 Lowenstein-Jensen 培養基呈乾粗、凸起、白色到黃色，週緣不規則狀之菌落。
c.	鳥型分枝桿菌：於四種培養基均呈濕白凸起菌落，有時呈透明、無光澤粗圓之變異型。尤其常見於 Middlebrook's 7H-10 培養基。
d.	RunyonⅠ、Ⅱ、Ⅲ 及 Ⅳ 群非典型分枝桿菌：於 Lowenstein-Jensen 培養基呈平滑光亮略凸之菌落。在 P&B 培養基，Ⅱ 群菌落會產色，Ⅰ群於有光下亦會產色。

(2)培養特性及生化試驗
　　可疑菌落塗抹片，Ziehl-Neelsen 抗酸染色檢查 ( 註 3)，並接種含 Tween80 及 Albumin 之 Dubos 氏培養基，37℃ 培養一週。新發育菌再作塗抹片及抗酸染色檢查，若無發育應持續觀察一週。發育菌接種 Proskauer and Beck(P&B) 培養基及含各種化學藥劑之 Dubos 氏培養基。

a.	在 P&B 培養基中，M. bovis 與 M. tuberculosis 發育呈顆粒狀，其他分枝桿菌則呈均勻菌液。但 M. avium 及 Runyon 群之粗型株有時亦會產生粗菌團。
b.	菌索 (Cording) 之形成：在 P&B 培養基中，M. bovis 與 M. tuberculosis 會發育形成菌索，其他分枝桿菌則否。
c.	細菌形狀：細桿菌，M. bovis 與 M. tuberculosis 長 10.-3.0μ，其他種分及桿菌長 0.5-1.0μ或不定。
d.	Niacin test：M. tuberculosis 培養在 P&B 培養基中會產生大量之 Niacin，此可在培養液中加含 4%aniline 之 ethanol 1ml 後，加溴化氰 CNBr 1ml，於 5 分鐘內呈黃色而測出。其他分枝桿菌除 M. fortuitum 產生少量外均不會產生。
e.	對各種化學藥劑之敏感性：Dubos 培養液中分別添加 10μg/ml isonicotinic acid hydrazid(INH)，10μg/ml thiophen-2-carboxylic acid hydrazid(TCH)，1：40,000 neotetrazolium chloride(neotet)，2 μg/ml Streptomycin(SM)，0.25μg/ml Rifampin(RIF) 等後，再與一支無添加藥劑之 Dubos 為對照，分別接種待鑑別之分枝桿菌分離株。培養經數週後，對照培養基中，接種菌發育豐盛，但 M. bovis 在五種藥劑中之發育均被抑制，M.tuberculosis 僅被 INH 抑制，其他四種藥劑不受影響，M.avium 及 Runyon groups 之發育均不受五種藥劑之影響。
f.	觸媒酵素試驗：於含甘油之 Lowenstein-Jensen 培養基 4 週之培養，添加 2ml 之 Catalase 試劑 (10%Tween80 與 30%H₂O₂ 等量混合 )，5 分鐘後呈氣泡者為陽性。M. bovis，M.tuberculosis 及 M. avium complex 均產生微量之 catalase，Runyon 群則產生較強之反應。
g.	Tellurite 試驗：接種培養 Middlebrook's 7H-9 培養基培養 7 天後，滴加 2 滴 0.2% 碲酸鉀 (Potassium tellurite，再放入培養 3 天，大部份之 M.avium complex 及 Runyon Ⅳ 群會把碲酸鹽還原成金屬碲而呈黑色。
h.	血清凝集試驗：本法可應用於 M. avium complex 之分類。抗原：於液體培養之菌接種含 0.41%Sodium pyruvate 之 Middlebrook's 7H-10 Oleic albumin agar，經 37℃ 培養二週，以 PPBS(Phenol 0.5%，Na₂HPO₄ 0.14%，NaCl 0.8%，pH6.5) 洗下菌體，放室溫中 5 天以不活化後，離心去上液，再 PPBS 調整濃度為 OD 0.4(525nm)。抗血清：以上述之死菌液免疫兔子，以得高免疫血清。試驗操作：抗原及抗血清各 0.5ml 放於試管中混合後，放 37℃ 經 3 小時與 18 小時各檢查一次。依其凝集塊大小及懸液之清澈度而評估其凝集程度為；4+、3+、2+、1+、及 0。每種分離菌至少需有 2 支同型血清均產生凝集反應。

2.血清學診斷

(1)

血清反應：包括凝集試驗、被動血球凝集試驗、溶血試驗、白陶土凝集試驗、補體結合試驗、酵素免疫吸附試驗 (ELISA)、干擾素產生測定法等。由於牛型及結核分枝桿菌之發育呈顆粒狀，不易作成均質之抗原液，此二種菌之感染畜似不產生持續之血清抗體，因此迄今均未有實用之血清學診斷方法。但凝集試驗可用於 M. avium complex 之分類。

(2)

結核菌素試驗：有皮內注射法、皮下注射法、眼瞼注射法、點眼法、鼻反應法、肛門反應法、併比接種試驗等多種方法。
　　我國之結核菌素早期使用本省自製之熱濃縮結核菌素，該種結核菌素係以人型及牛核結核菌培養於不含蛋白質 Sauton 氏人工合成培養基，經 20 週後，滅菌及過濾掉菌體，濾液加熱濃縮約 100 倍而成。使用時，以 0.1ml 皮內注射牛尾根皺襞，接種前及接種後 72 小時，測定接部位皮膚腫脹厚度差，其差額在 5.0mm 以上而有硬結者為陽性，差額未滿 3.0mm 而無硬結者為陰性，差額在 3.0mm 以上而未滿 5.0mm 者為疑陽性。疑陽性牛經 14 天至 60 天間再複驗一次，若呈疑陽性或轉為陽性者，均判為陽性牛。自民國 74 年，本省結核菌素改用牛型純蛋白結核菌素 (PPD 結核菌素 )，其使用方法及判定標準仍依前法，但複驗時接種頸側部皮膚。

3.病理學診斷
　　肉眼病變為乾酪性壞死結核結節，常見於各淋巴結，其次為肺臟及肝臟等。
　　結核結節之中心為乾酪化壞死區，有時可見鈣化：壞死區外圍為上皮樣細胞組成之肉芽腫組織，可發現 Langhan 氏巨細胞之存在；最外層為淋巴球與纖維芽細胞所包被；病變組織以抗酸性染色 ( 註 4) 可見紅色短桿狀之抗酸菌。

(六)

確診依據

　　病畜組織或器官有乾酪性壞死之結核結節，壞死區之四週可見 Langhan 氏巨胞及抗酸性染色紅色短桿菌之存在；牛型或結核分枝桿菌之分離及鑑定。

(七)

參考文獻

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(八)

附錄

表 2. 三種型分枝桿菌及四種未分類群之有關性狀

特　　性	M. bovis	M. tuberculosis	M. avium	Runyon I	Runyon II	Runyon III	Runyou IV
培養時間(日)　37℃	13-20	13-20	13-20	13-20	13-20	13-20	<= 6
45℃	不發育	不發育	6-13	不發育	不發育	+-	不定
色素產生　有光下	-	-	-	+	+	-	不定
無光下	-	-	-	-	+	-	不定
Cording	+	+	-	-	-	-	不定
在 P&B 培地發育特性	顆粒	均勻-顆粒	顆粒	均勻	均勻	均勻-顆粒	均勻-顆粒
在 P&B 培地菌長 (μ)	1-3	1-3	0.5-1.0	不定	不定	0.5-1.0	不定
在 L-J 菌落形態	乳房狀	乾粗堆積	平滑凸出	平滑-粗	平滑-粗	平滑	不定
	不規則	不規則	濕潤	全凸濕	全凸濕	全凸濕
在 INH 發育	-	-	+	+	+	+	+
在 TCH 發育	-	+	+	+	+	+	+
在 Neotetrazolium 發育	-	-	+	+	+	+	+
在 Streptomycin 發育	-	-	+	+	+	+	+
在 Rifampin 發育	-	-	+	+	+	+	+
Niacin test	-	+	-	-	-	-	-
Catalase 活性	稀	稀	少	中度	中度	少	強
Tellurite 還原	-	-	+	-	-	+	+
動物病原性：天竺鼠	+++	+++	-	-	-	-	-
兔　子	+++	-	Yersin	-	-	-	-
雞	-	-	+++	-	-	-	-
血清型數	無	無	20	2	3		2

表 3. 分枝桿菌之血清型

早　期　名　稱		目　前　名　稱
分枝桿菌菌種	血清型	分枝桿菌菌種	血清型
M. bovis	NA	M. bovis	NA
M. tuberculosis	NA	M. tuberculosis	NA
M. avium	1	M. avium complex	1
	2		2
	3		3
M. intracellulare	IV		4
	V		5
	VI		6
	VII		7
	Davis		8
	Watson		9
	IIIa		10
	IIIb		11
	Howell		12
	Chance		13
	Boone		14
	Dent		15
	Yandle		16
	Wilson		17
	Altman		18
	Darden		19
	Arnold		20
Runyon group I	M. kansasii	M. Kansasii	only one
	M. marinum	M. marinum
Runyon group II	Scrofulaceum	M. marianum	41
(M. scrofulaceum)	Lunning		42
	Gause		43
Runyon group IV	M. fortuitumI	M. peregrinum	only one
	M. fortuitumII	M. fortuitum	only one

註 1.各種分枝桿菌培養基之成份與配製方法：
Dubos broth with Tween 80 and Dubos Oleic albumin complex and INH

成份：	Dubos broth base (Difco 0385)　　　　　　　　 6.5g DW　　　　　　　　　　　　　　　　　　 890ml 0.1%INH 液 (Isoniazid)(hydrazid)　　　　　　　10ml Dubos Oleic albumin complex (Difco 0375) 　　 100ml
配製：	前3種成份混合溶解後，高壓滅菌，放涼 56℃，加入 Dubos Oleic albumin complex，混合後分裝

Dubos broth with Tween 80 and Dubos Oleic albumin complex and TCH

成份：	Dubos broth base (Difco 0385)　　　　　　　　　　　　　　6.5g DW　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 900 ml Dubos Oleic albumin complex(Difco 0375)　　　　　　　　100 ml 0.1%TCH(Thiophen-2-Carboxylic acid hydrazid( 過濾滅菌 ) 　1.5 ml
配製：	前 2 種成份混合溶解後，高壓滅菌，放涼 56℃，加入 0.1%TCH 液及 Dubos Oleic albumin complex，混合後分裝

Dubos Tween albumin broth with neotetrazolium chloride

成份：	Dubos broth base without Tween 80(Difco 0435) DW Tween 80 50% glucose( 過濾滅菌 ) Dubos Oleic albumin complex (Difco 0375) 1% neotetrazolium chloride	6.5g 900 ml 0.5ml 10ml 100 ml 2.5 ml
配製：	前 3 種成份混合加溫溶解後，高壓滅菌，放涼 56℃，加入 glucose，Dubos Oleic albumin complex，及 neotetrazolium chloride 混合後分裝

Dubos broth with Tween80 and Dubos Oleic aibumin complex and Strptomycin

成份：	Dubos broth base (Difco 0385) DW 1% Streptomycin solution( 過濾滅菌 ) Dubos Oleic albumin complex (Difco 3750)	6.5g 890 ml 2.0 ml 100 ml
配製：	前 2 種成份混合溶解後，高壓滅菌，放涼 56℃，加入 streptomycin Dubos Oleic albumin complex ，混合後分裝。

Dubos broth with Tween 80 and Dubos Oleic albumin complex and Rifampin

成份：	Dubos broth base (Difco 0385) DW Rifampin stock solution Dubos Oleic albumin complex(Difco 0375)	6.5g 890 ml 0.5ml 100 ml
配製：	Rifampin stock solution---500 ug/ml Rifampin 10mg 溶後 1.0ml DMSO(Dimethyl sulfoxide) 取 0.5ml 加 butterfield's buffer 9.5ml 即成。前 2 種成份混合溶解後，高壓滅菌，放涼 56℃，加入Rifampin stock solution Dubos Oleic albumin complex，混合後分裝

Herrold's egg yolk medium

成份：	Peptone(Difco 0118) NaCl Agar(Difco noble 01420) Beef extract(Difco 0126) Glycerol DW Egg yolks 2% Malachite green (oxalate form)( 無菌 )	9.0g 4.5g 15.3gl 2.7g 27ml 870ml 6個 5.0ml
配製：	除蛋黃及色素外之成份加溫溶解後，放涼到 60℃，以 1 N NaOH 調 pH7.5 高壓滅菌，放涼到約 56℃，加入蛋黃液及 ( 或 ) 色素液分裝作成斜面放涼。

Herrold's egg yolk medium with mycobactin

成份：	Peptone(Difco 0118) NaCl Agar(Difco noble 01420) Beef extract(Difco 0126) Glycerol DW NaOH(4%) Mycobactin 2mg 溶於 4ml ethyl alcohol egg yolks 2%Malachite green (oxalate form, 無菌 )	9.0g 4.5g 15.3gl 2.7g 27ml 870ml 約 4.1ml 6 個 5.1ml
配製：	1-6 種成份加熱使之溶解後，放涼到約 60℃，加入 NaOH 調 pH7.5 緩緩加入 mycobactin 於液中，高壓滅菌後放涼到 56℃，加入蛋黃液及色素液，分裝試管，作成斜面。

Lowenstein-Jensen medium

成份：	Lowenstein medium base(Difco 0444) Glycerol DW Whole eggs( 無菌製備 ) 約 24 個	37.2g 12.0ml 600ml 1000ml
配製：	Lowenstein medium 加入含甘油之水中，加溫攪拌，121℃ 高壓滅菌後放涼，新鮮雞蛋以水洗淨後，浸於 75%alcohol 中 30 分鐘以滅菌毛巾擦乾，敲破放入角瓶，攪拌 ( 注意勿使產生氣泡 ) 後以滅菌紗布過濾蛋液加入上液後分裝滅菌試管，做成斜面放 80℃40 分鐘使硬化。

Middlebrook's 7H-9 broth－本品可購自 Difco

成份：	Ammonium sulfate 1-glutamic acid(Na salt) Sodium citrate Pyridoxine Biotin Disodium phosphate Mono potassium phosphate Ferric ammonium citrate Magnesium sulfate Calcium chloride Zinc sulfate Copper sulfate DW ( 含 0.5g Tween80)	0.5g 0.5g 0.1g 0.001g 0.0005g 2.5g 1.0g 0.04g 0.05g 0.0005g 0.001g 0.001g 900ml
配製：	以上成份溶於含 Tween80 之 DW 900ml 中，高壓滅菌，放涼後每 180ml 加 Middlebrook ADC enrichment 20ml，混合後分裝。

Middlebrook's 7H10 agar with Middlebrook OADC enrichment

成份：	Middlebrook's 7H-10 agar base (Difco 0627) Sodium pyruvate glycerol DW Middlebrook OADC enrichment(Difco0722)	40g 4.1g 5ml 895ml 100ml
配製：	前 4 種成份加熱溶解後，高壓滅菌放涼到 56℃ 後，加入 OADC 添加劑，分裝作成斜面

Modified P&B medium with 5% horse serum

成份：	L-Asparagine Potassium phosphate monobasic Potassium sulfate glycerol DW Manesium citrate Horse serum( 滅菌 )	5.0g 5.0g 5.0g 20ml 930ml 1.5g 50ml
配製：	取部份 DW 加熱以溶解 L-Asparagine 後，再加入其次之 2 種成份，再加入甘油及其餘之 DW，混合後以 1 N NaOH 調 pH 7.0，再加 Magnesium citrate 混合後高壓滅菌，放涼到 50℃，添加馬血清，混合後分裝。

Stonebrink's medium

成份：	A.鹽類	Sodium pyruvate( 或 Pyruvic acid 之鈉鹽) KH₂PO₄ DW 以NH₂HPO₄ 調 pH6.5( 約 0.943g)	5.0g 2.0g 300ml
	B.色素	Crystal violet Malachite green(oxalate form) DW	100mg 800mg 100ml
	C.蛋液	無菌全蛋液 ( 約 20 個 )	800ml
配製：	A 及 B 混合溶解及高壓滅菌後放涼 A 攪拌中加入 B，最後加入 C，分裝後，做成斜面放 80℃40 分鐘使硬化

註 2.結核病病原菌分離及同定用各種試劑：
Benzalkonium chloride(Zephiran)

0.2% working sol.：17.0%Zephiran 1.2 ml 加 DW 98.8ml
0.3% working sol.：17.0%Zephiran 1.8m l加 DW 98.2ml

Butterfield Buffer

Stock solution

	KH₂PO₄	34g
	DW	500ml
	1 N NaOH 約	180ml
	再加 DW 到	1000ml

稀釋液：每 1.25ml 稀釋為 1000ml

Niacin test reagents

Cyanogen bromide solution：Cyanogen bromide 10g，DW 90ml
Ethyl aniline sol.：Anilline 4ml in 95%ethanol 96ml
注意：CNBr 毒性非常高，二種液均需儲放有色瓶中，效期 4 週
Papain-cysteine hydrochloride solution
Papain　　　　　　　　　　　　　　　50g
Cysteine hydrochloride　　　　　　　　0.6g
DW　　　　　　　　　　　　　　1000ml
加熱溶解混合，過濾滅菌，分裝成 100ml 凍結保存
Phosphate buffer(M/15)pH7.0
Na₂HPO₄ 9.47g in 1000ml DW　　　61.1ml
NaH₂PO₄ 9.07g in 1000ml DW　　　38.9ml

2.5%Trypsin 液：trypsin 25g 溶於 1000DW 中，過濾滅菌，分裝保存。

註 3.結核病原桿菌之抗酸性染色方法 (Ziehl-Neelsen acid fast stain
試劑：Stock saturated alcohol Fuchsin solution
　　　　95% ethyl alcohol　　　　　　100ml
　　　　Basic Fuchsin　　　　　　　　3.0g
　　　Working solution basic fuchsin
　　　　Saturated alcohol basic fuchsin　10ml
　　　　5% phenol　　　　　　　　　90ml
　　　Acid alcohol
　　　　HCI(conc.)　　　　　　　　　3.2ml
　　　　95% ethyl alcohol　　　　　　 97ml
　　　Brilliant green counterstain
　　　　Brilliant green　　　　　　　　1.0g
　　　　0.01% NaOH　　　　　　　 100ml

步驟：1.	細菌抹片微熱固定。
2.	抹片上覆一片濾紙，加上 Ziehl's basic fuchsin 液，沸熱 3 分鐘。
3.	水洗，再以 acid alcohol 洗 2-3 分鐘，到只剩微粉紅色。
4.	水洗，再以 Brilliant green counterstain 染 3 分鐘。
5.	水洗，乾後以油鐘觀察。

註 4.組織切片中之抗酸菌染色
試劑：Carbofuchsin 液

Phenol	2.5ml
95% alcohol	5.0ml
Basic fuchsin	0.5g
D.W.	50.0ml

　　　3% Acid-alcohol

Hydrochloride(conc.)	3.0ml
70% Alcohol	99.0ml

　　　Methylene blue 染色液

Methylene blue chloride	0.5g
Glacial acetic acid	0.5ml
D.W.	100.0ml

步驟：1.	厚 4-6μm 之組織切片，經 Xylene 脫蠟 2 次，95% 酒精及蒸餾水洗過。
2.	以新鮮濾過之 Carbofuchsin 液染色 10 分鐘。
3.	水洗後，以 3% Acid-alcohol 脫色至淡粉紅色，水洗 8 分鐘。
4.	以 Methylene blue 染色液染色 15-30 秒。
5.	水洗，以 95% 及絕對酒精各脫水 2 次，浸 Xylene2-3 次。
6.	加蓋玻片後檢查。

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