跳到主要內容區塊 :::
::: :::

十四、家禽披衣菌症

作者
蔡向榮
建立日期
96年01月11日
更新日期
96年01月11日
內容
(一)

病名及病原：
 
1. 病名： 家禽披衣菌症又稱鸚鵡病 (psittacosis；在人及鸚鵡類 ) 或飼鳥病 (ornithosis；在其他家禽及鳥類 )，鸚鵡熱 (parrot fever) 等。
2. 病原： 係由家禽披菌 (Chlamydia psittaci) 所引起。在哺乳類 ( 包括人類 ) 雖有由與家禽不同之披衣菌菌株所引起的疾病，但家禽披衣菌亦可能感染人而引起疾病，甚至死亡。
   
(二)

疾病簡介：
  　　本菌可感染大部份的家禽、野禽和哺乳動物 ( 如狗、豬、山羊、牛、馬等 ) 本菌以內核限制脢分析可分為 5 型：家禽型 (avian)、流產型 (abortion)、多發性關節炎兼結膜炎型(polyarthritis-conjunctivitis)、麝香鼠型和天竺鼠之包涵體性結膜炎型 (inclusion conjunctivitis)。大部份禽類的披衣菌症是由「家禽型」引起。而利用單株抗體可確認出家禽型中至少有四種不同的血清型 (serovars)，這些血清型與所分離的家禽種系有關，包括了鸚鵡、鴿子、鴨及火雞四種血清型。
   
(三) 典型之臨床症狀及病理變化：
  　　本菌在鳥類引起全身性感染，導致肺炎、氣囊炎、心包炎、腸炎及結膜炎，有時可致死。臨床症狀之嚴重程度隨感染禽隻種類、年齡及披衣菌菌株而異。病禽有嗜眠、高熱、排泄異常、流鼻汁及眼淚、產蛋降低等症狀，死亡率可高達 30%。在玩賞鳥較常見之症狀為厭食、體重減輕、下痢、黃色糞便、鼻竇炎及呼吸緊迫。許多鳥類在臨床上並未有任何症狀，尤其是年紀較大的鸚鵡類。在鴨隻剖檢可見流淚、結膜炎、鼻炎、偶有全眼球炎、眼下竇炎、胸肌常見萎縮及多發性漿膜炎及／或漿液性或漿液纖維素性心包炎，肝腫大，肝包炎及脾腫大，有些鴨隻在肝及脾有灰色或黃色壞死灶。在鴿子則常見在增厚之氣囊上及腹膜漿膜面上有纖維素性滲出物，有時在心包囊上亦有，肝通常會腫大，變軟，脾亦會腫大、變軟、變暗色，如有卡他性腸炎發生，在泄殖腔會有多量尿酸鹽，較輕微者只在氣囊及肝有病變，有些大量感染之排菌鴿子反而沒有任何病變。但這種不顯性感染鳥類常會長時間排菌。
   
(四)

應採病材：
  　　應採病材視病情而異，由急性病例所採病材應包括有病變之臟器，或周圍之炎症性或纖維素性滲出物，眼鼻分泌物，全血，及腎、肝、肺、脾等組織檢體。在有下痢之病例，應培養結腸內容物或排泄物。對活鳥之採樣應包括全血、腸排泄物、氣管拭子、結膜拭子及膜腔滲出液。因為在所有病例中，不是只有一個病材就一定可分離出病原，所以各種檢體皆應收集。若發現同群的禽類中有不顯性感染時，應重複取樣以確定是否已感染。採樣必需無菌操作，因為細菌污染會干擾披衣菌之分離。病材之運送及污染之減少方法見附錄 1。
   
(五) 綜合診斷：
 
1. 病原分離與檢測：
(1) 安全防護：
　　人雖然亦可能經由與病貓或綿羊之接觸而感染披衣菌，但披衣菌中以家禽型最具感染性，因此處理潛在性感染的禽類及檢體必須小心。因為家禽型菌株可能會引起人類嚴重或致死性的感染。人類也可能經由暴露於空氣中，或接觸到禽隻乾燥的排泄物而感染。另外亦應防止在解剖或使用注射器、遠心機、組織研磨器、吸管或其他實驗室設備等機械處理微生物懸浮時，所產生的具感染性空氣 (aerosols)，及感染性的滲出液或物質污染到皮膚。處理任何潛在性傳染物質時應戴上手套，並在生物安全防護櫃 (class Ⅱ biohazard cabinet) 中操作。實驗室工作人員在參與披衣菌工作前及以後應每年一度採取血清檢測抗體。
(2) 雞胚胎：
　　披衣菌需在活細胞中才能增殖，因此本菌之分離需將病材接種實驗動物或細胞培養，再以細胞化學染色 ( 附錄 2) 或免疫組織化學染色法 ( 附錄 3) 檢查披衣菌菌體。通常家禽披衣菌係以 6~7 日齡雞胚胎卵黃囊內接種，再將死亡雞胚胎之卵黃囊製成捺壓塗抹片後，以細胞化學染色的方法檢查，或者再在細胞培養上繼代後，再以免疫螢光抗體法或免疫酵素標示抗體法檢查披衣菌包涵體。病材必需至少在雞胚胎盲目繼代 3 次後仍為陰性，才可判定為陰性。
(3) 細胞培養：
　　直接將病材接種在 Vero，McCoy，Hela，BHK，BGM 或 L-929 細胞等細胞培養上，並添加 5~10% 胎牛血清及不抑制披衣菌生長的抗生素是較佳的分離方法。在 37℃，5%CO2 環境下培養 3~7 天。細胞培養與雞胚胎在分離披衣菌之敏感性相同，而且可經由離心的方法 ( 在 37℃，2000g，30 分鐘 ) 將病材吸附在單層細胞上，及以添加細胞分裂之抑制物的方法來增進分離率 ( 附錄 4)。抑制細胞分裂的原因為可提供披衣菌複製所需的營養，並且因為非複製細胞能保持較長的時間以供觀察。部份細胞培養可以免疫螢光抗體或其它適當的方法染色直接檢查包涵體，另一部份細胞培養則以超音波 (70W，30 秒 ) 擊碎以釋出披衣菌基體 (elementary bodies) 後繼續盲目繼代，通常在細胞培養盲目繼代 1~2 次後，仍為陰性才可判定為陰性。應用單株抗體於免疫螢光抗體法，或免疫酵素標示抗體法可使特異性提高，目前國外已有商品化，針對披衣菌群特異性抗原 (group antigen) 之單株抗體出售。
(4) 小白鼠或天竺鼠：
　　小白鼠及天竺鼠曾用來分離披衣菌，但有些實驗鼠群會自然感染披衣菌；而有些種系的小白鼠則對披衣菌的感染，天生即具有高度抵抗能力。年幼的實驗白鼠可由腦內、鼻腔內或腹腔內等路徑接種。其臨床狀在 5~15 天內出現，發病白鼠的毛皮豎立、皺摺、厭食，偶而出現結膜炎，死亡發生在接種後 5~15 天。剖檢可見內部器官 ( 特別是肺及脾 ) 充血，肝臟腫大，腹腔及胸腔出現黏稠的纖維素性滲出液。有些菌株還會引起廣泛性的腹腔漿膜脈管傷害，而產生大量纖維性腹水。使用鼠類好處是在由禽類糞便或下痢檢體分離披衣菌時，可排除一些細菌的污染，但由於有些實驗鼠群會自然感染披衣菌，因此披衣菌之分離仍以在小心的去除檢體中的細菌污染後 ( 附錄 1)，再接種細胞或雞胚胎為佳。
(5) 以市售螢光標示單株抗體套組檢測披衣菌抗原：
　　目前市面上已有許多人之沙眼披衣菌病原 (C. trachomatis) 的檢測套組，其中使用 C. trachomati 特異性抗體之套組不能用於本病之診斷，但有部份套組係使用披衣菌之群特異性抗原 ( 脂多醣 ) 之抗體，則可用於本病之診斷，這些套組皆含有螢光標示之單株抗體。將檢體塗抹於玻片上以丙酮或甲醇固定以將披衣菌不活化後，與抗體在玻片上反應 (37℃ 濕盒內 15~30 分鐘 ) 後，玻片上如有披衣菌抗原抗會與之結合，經過數次之 PBS 浸洗後，以螢光顯微鏡鏡檢，披衣菌基體呈現點狀蘋果綠色螢光。本法較卵黃囊接種法及細胞培養法不敏感，但易操作，可在1小時內得到結果，( 細胞培養需 3~10 天 )，而且不必活的披衣菌，因此頗為安全與實用。
(6) 以酵素結合免疫吸附法偵測披衣菌抗原：
　　本法與螢光標示抗體法相似，只是以酵素標示抗體取代螢光標示抗體而已，目前已有多種市售套組可供使用，一般 ELISA 盤 (plate ELISA) 需以判讀機 (ELISA reader) 判讀，大約只需 4~6 小時就能得到結果，最近有發展固定相 ELISA (solid phase ELISA)，只需 30 分鐘即可完成，並可以肉眼直接判讀。
(7) 聚合脢鏈反應 (polymerase chain reaction)
　　在一些人的醫院或實驗室已用此法於例行披衣菌檢測，目前亦已有一商用套組供人的 C. trachomatis 檢測，但由於其目標核酸序列為 C. trachomatis 所特有，所以不能用於家禽披菌之檢測。以本法檢測 C. psittaci 已有應用於鳥類、無尾熊、綿羊、牛及貓等之報告，由於本法敏感性及特異性皆高，並且可在短時間內獲得結果，因此將來會更普遍應用於本病之診斷。
2. 血清學診斷
　　本病之標準血清學診斷方法為補體結合試驗 (complement fixation，CF)( 附錄 5)。CF 抗原係所有披衣菌都具有之群特異性脂多醣抗原，本法通常用於禽群之披衣菌感染的檢查，如果在一個有臨床症狀發生的禽群，大部份禽隻具有高 CF 抗體力價，則可做本病正在感染之初步診斷。如在各別鳥隻能證明抗體力價上升 4 倍或以上，則可做為本病正在感染之確診。
　　乳膠凝集試驗 (latex agglutnation；LA) 可測定披衣菌的抗體，且操作簡單又快速。乳膠分子用純化的披衣菌抗原包裝起來，然後於玻璃平盤中，徹底與血清混合，再振盪混合 2 分鐘以加強凝集效果，最好用黑色背景作對比來觀察凝集。陽性血清必須再以未包裝抗原的乳膠分子，來測定是否有非特異性凝集，此試驗具高度特異性，且可用來作為主動感染或剛感染的診斷，但其敏感性相當低。
　　其他血清學診斷方法包括酵素結合免疫吸附法 (ELISA)，微量免疫螢光法 (micro-immunfluorescence； micro-IF) 及瓊脂免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion；AGID) 等。這些試驗在將來可能會取代 CF 試驗，尤其是 ELISA 法大部份病例中可替代 CF 試驗，但這些試驗仍需以不同的革蘭氏陰性菌抗血清來評估，是否會因脂多醣抗原間的相似而造成交叉反應。總之，上述這些試驗的可靠性及可重覆性資料目前尚不充足。
3. 病理學診斷：
　　臨床上有氣囊炎及心包炎之感染禽類，如能在肝、脾、心包囊及心肌發現有壞死性及增殖性病變，則有助於與其他呼吸道疾病之區別診斷，如能進一步以細胞學檢查，證明巨噬細胞內披衣菌之包涵體，則具診斷價值。其染色方法見附錄 2 及 3。
   
(六) 確診依據：
  　　本病之確診需有披衣菌之分離與鑑定，或在組織內證明披衣菌之存在，或在有臨床症狀之禽隻證明有披衣菌特異性抗體之上升 4 倍及以上。如禽群中大部份禽隻具有 64 倍或更高 CF 抗體力價，則可做為初步診斷之依據。
   
(七) 參考文獻：
 
1. Andersen A. A, & Van Dusen, R. A.(1988). Production and partial characterization of monoclonal antibodies to four Chlamydia psittaci isolates. Infect. lmmun.,56,2075-2079.
2. Bevan B.J. & Bracewell,C.D. (1986). Chlamydiosis in birds in Great Britain 2. Isolations of Chlamydia psittaci from birds sampled between 1976 and 1984. J. Hyg.(Camb.)96,453-458.
3. Bracewell C.D.& Bevan B.J.(1986). Chlamydiosis in birds in Great Britain 1. Serological reactions to chlamydia in birds sampled between 1974 and 1983. J. Hyg.(Camb.),96,447-451.
4. Evans R. T., Chalmers W., Woolcock P. R., Farmer H. & Taylor-Robinson D.(1983). An enzyme-linked immunsosrbent assay (ELISA) for detection of chlamydial antibody in duck sera. Avian Pathol., 12,117-124.
5. Finlayson J., Buxton D., Andersen I.E. & Donald K.M.(1985). Technical method：Direct immunoperoxidase method for demonstrating Chlamydia psittaci in tissue sections. J. Clin. Pathol., 38, 712-714.
6. Grimes J.E.(1985). Direct complement fixation and isolation attempts for detecting Chlamydia psittaci infection of psittacine birds. Avian Dis.,29,387-877.
7. Grimes J.E.(1986). Chlamydia psittaci latex agglutination antigen for rapid detection of antibody activity in avian sera：Comparison with direct complement fixation and isolation results. Avian Dis., 30,60-66.
8. Mohan R.(1984). Epidemiologic and laboratory observations of Chlamydia psittaci infection in pet birds. J. Am. Vet. Med. Ass., 184,1372-1374.
9. Moore F.M.& Petrak M. L. (1985). Chlamydia immuno-reactivity in birds with psittacosis：Localisation of chlamydiae by the peroxidase-antiperoxidase method. Avian Dis., 29,1036-1042.
10. Ruppaner R., Behymer D.E., DeLong W.,J.III,Franti C.E. & Schultz T. E.(1984). Enzyme-immunoassay of chlamydia in birds. Avian Dis., 28,608-615.
   
  附錄 1. 病材之運送及污染之處理
 

　　病材必需要妥善裝運以防披衣菌感染力之喪失。如能在取材 24 小時內進行分離則可保存在 4℃，否則應立即凍結保存在 -70℃，存在組織檢體內或卵黃囊懸浮液內的披衣菌，於 -70℃ 可長期保存。若欲從冷凍組織培養液中收集披衣菌，需要特殊培養基。較好的方法是在冷凍之前將組織培養基換成 SPG(surcrose phosphate glutamate) 緩衝液，因為此時微生物極需要鈉離子。病原菌在嚴重感染的組織培養或含 SPG 輸送培養基中。在 4℃ 會於 30 天以內或以上，逐漸喪失感染力。SPG 緩衝液可用於披衣菌病材之運送，其成份如下：蔗糖 74.6g/1，KH2PO4 0.512g/1，K2HPO4 1.237g/1 及 L-glutamic acid 0.721/1)，此運送液可高壓蒸氣滅菌。其中添加胎牛血清 (10%)，汎可黴素 (vancomycin，100μg/ml)、Amphotericin B(2μg/ml) 及僅大黴素 (gentamicin，100μg/ml)。SPG 輸送液應調整 PH 到 7.2 並以過濾的方法滅菌後保存在 -20℃ 備用。即使是在室溫中運送，抗生素之添加亦可減少雜菌之污染。
　　污染之病材在接種動物或細胞培養時需預處理，其方法包括以抗生素處理，或以抗生素及過濾處理，添加抗生素需使用不會抑制披衣菌生長者。病材可在含鏈黴素 (1mg/ml)，泛可黴素 (1mg/ml) 及康黴素 (1mg/ml) 之磷酸鹽緩衝液 (PBS，pH7.2) 中均質化。亦有使用僅大黴素 (200μg/ml) 者。有必要時亦可添加 Amphotericin B 以控製酵母及真菌之生長。其他抗生素如青黴素、四環素及氯黴素 (Chloromycetin) 應避免使用，因為這些藥劑會抑制披衣菌之生長。
　　如果污染不嚴重，病材可在添加抗生素後均質化，接種雞胚胎、天竺鼠、小白鼠或細胞培養。病材通常在添加抗生素 24 小時才接種。濃厚污染之病材如糞便，應在抗生素溶液中均質化後。在 1000~2000g，30 分鐘 (4℃) 遠心將表層及底層物丟棄，收集上清液後遠心，將遠心所得上層液用於接種。如仍有污染之情形，則應將此病材通過 450~800μm 之過濾孔過濾以去除污染。
   
 
附錄 2. 組織化學染色
 
　　披衣菌可利用多種方法，在滲出液和糞便的塗抹片，或肝、脾的塗抹片上偵測出來。一般使用 Giemsa 及 Giminez(Gimenez) ，Giemsa，Castaneda 或 Macchiavello 染色法。改良式的 Giminez 染色法 ( 如表 1 所列 )，通常用來偵測塗抹片及石臘包埋的組織切片上的披衣菌包涵體。這些染色法的優點是可直接以光學顯微鏡檢查 (X100)。
 
表 1　修正之 Giminez 或 PVK (Pierce Van Der Kamp) 染色
組　　　　　　　成

量
第一液：
 
 蒸餾水
450.0ml
Phenol
5.0ml
加　上：
 
 
 Basic fuchsin
2.5 g
95% ethanol
50 ml
 
栓緊蓋子置於 37℃ 48 小時，過濾後貯存於室溫
第二液：
 
 
 Na2HPO4
11.65g
NaH2PO4H2O
2.47g
蒸餾水 (pH 7.5) 加至
1 　l
第三液：
 
 
 第一液
20.0ml
第二液
25.0ml
 
靜置十分鐘後，過濾使用
第四液：
 0.5% citric acid (aq.)
　
第五液：
 
 
 Fast green
0.2 g
蒸餾水
100.0ml
冰醋酸
0.2ml
第六液：
 
 第五液
20.0ml
蒸餾水
50.0ml
 
1. 塗抹片染色步驟如下：
(1) 以甲醇固定 5 分鐘
(2) 以第 3 液染色 10 分鐘
(3) 自來水水洗
(4) 以第 6 液複染 2 分鐘
(5) 自來水水洗
(6) 風乾
2. 石臘切片染色步驟如下：
(1) 去石臘並以蒸餾水水洗
(2) 以第 3 液染色 10 分鐘
(3) 用自來水水洗
(4) 浸洗在第 4 液中，直到切片中紅色不再流出
(5) 再以自來水水洗
(6) 以第六液複染 20 次 ( 浸染 )
(7) 交互以 2 盒 95% 酒精浸洗，每邊 5 次
(8) 脫水，擦拭乾淨並包埋
(9) 披衣菌可染成紅色，背景則染成綠色
 
附錄 3. 免疫組織化學染色
 
　　免疫組織化學法是以細胞學及組織學，偵測披衣菌的另一種方法。此方法比組織化學染色法更敏感，但須具備某些解析染色結果的經驗，因為有些細菌、黴茵及上皮細胞間的物質，常會在形態上及顏色反應上與該菌有交叉反應，作診斷時必須注意區別。
　　在細胞培養染色前，先去除培養液，以 PBS 洗滌細胞後以丙酮固定 2~10 分鐘。此固定時間因所使用之細胞培養瓶或盤之材質而異，因為丙酮會使大部份之塑膠軟化，因此以 50% 丙酮及甲基醇為宜。有數種方法可用以檢查披衣菌之包涵體，其中以直接免疫螢光法為佳。以抗披衣菌螢光標示抗體於感染細胞上在濕盒子內於 37℃ 感作 30 分鐘，再將蓋玻片以 PBS 洗滌 3 次後風乾，包埋及鏡檢。披衣菌包涵體呈淡綠色，螢光在細胞質內呈圓形或帽狀小體，具毒力的菌株包涵體會迅速解體，而披衣菌即散布在整個細胞質內。有市售單株標示抗體可供使用，並且具高度特異性。一般之抗血清 (polyclonal antisera) 亦可使用，但必需確保其為高力價之特異性抗血清，此抗血清可在兔子、天竺鼠、綿羊及山羊製備。山羊及綿羊是很好的抗血清來源，因為可得高力價及大量之抗血清。
　　披衣菌包涵體亦可以免疫酵素標示抗體法檢出。在此染色法中，具屬特異性 (genus-specific) 的單株抗體可用來當第一抗體。Biotinylated antimouse IgG 及 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC reagent) 可用來偵測石臘切片上的第一抗體。而 peroxidase-labelled antibody 可用來偵測細胞塗抹片的披衣菌抗原。
 

下列是石臘切片的染色步驟 ( 切片貼置在包有 poly-L-lysine 的玻片上 )：

1. 以二甲苯 (xylene) 脫石臘 3~4 分鐘。
2. 浸入絕對酒精 2 分鐘。
3. 浸入 95% 2 分鐘。
4. 浸入 70% 2 分鐘。
5. 浸入 蒸餾水 2 分鐘。
6. 用 3%H2O2 覆蓋切片 5 分鐘。
7. 用蒸餾水水洗。
8. 在 0.1% 胰蛋白酵素 (trypsin) 及 0.1% CaCl(pH7.8) 中，37℃ 感作 20 分鐘。
9. 以 50ml NH4Cl ( 溶於蒸餾水 ) 溶液，清洗 30 秒。
10. 蒸餾水水洗。
11. 以含 1% 牛血清白蛋白 PBS 溶液清洗。
12. 在正常兔血清 ( 以 PBS 1：50  稀釋 ) 內室溫感作 30 分鐘。
13. 加第一抗體及蓋玻片 (coverslisp) 在 5℃ 的溼盒 (humidity chamber) 感作一夜或於 37℃ 感作 2~3 小時。
14. 以 PBS 清洗。
15. 加 biotinylated horse antimouse 的第二抗體 (1：2000 稀釋 ) 在室溫感作 45~60 分鐘。
16. 以 Tris-saline (pH 7.6) 清洗 3 次 10 分鐘。
17. 加 ABC reagent 室溫感作 45 分鐘。
18. 以 Tris-saline (pH 7.6) 清洗 3 次 10 分鐘。
19. 加 2ml 0.02% H2O2 至 2ml 0.1% diaminobenzidine ( 溶於 pH 7.2 的 0.1M Tris 依 ABC kit 的指示泡製 ) 然後室溫感作 5 分鐘。
20. 蒸餾水水洗 3 次，10 分鐘。
21. 浸入 Harris hematoxylin 15 分鐘。
22. 蒸餾水水洗 5 分鐘。
23. 浸一下酸性酒精 (1%HCl 加 7% ethanol)。
24. 蒸餾水水洗 5 分鐘。
25. 浸入 1% NH4OH 中 10~20 次。
26. 蒸餾水水洗 5 分鐘。
27. 用下列溶液脫水：
(1) 95% ethanol 浸 5 下。
(2) 絕對 ethanol 浸 5 下。
(3) 絕對 ethanol 浸 5 下。
(4) 二甲苯浸 5 下。
(5) 二甲苯浸 5 下。
28. 加包埋液及蓋玻片。
　　披衣菌可染成暗棕色。它通常在發炎區的巨噬細胞內發現。抗原也能在感染後 50 天以上在側鼻腺內發現。發炎的氣囊及心包膜也常含抗原。要注意勿將血鐵素誤認為抗原。陽性抗原組織及用普通 H&E 染色切片可當作對照組。
   
 
附錄 4. 披衣菌在細胞培養之促進
 
　　披衣菌可由正常增殖之細胞分離到，但如果使用不增殖之細胞則效果較佳，因為此時可增加披衣菌生長所需養分之供應，此外抑制增殖之細胞亦可以有較長的觀察期間。宿主細胞之分裂可以放射線照射 (irridiation)，或細胞毒性物質之方法抑制。後者即細胞分裂抑制物，包括 5-iodo-2-deoxyiodine，cyto-cholasin B，cycloheximide 及 emetine hydrochloride 等。Cycloheximide 可以 0.5~2μg/ml 之劑量添加。Emetine 則在處理後需除去，再補充新的培養液，即單層細胞先以 0.5mg/ml emetine 處理 5 分鐘後，再更換培養液，此時單層細胞即可供使用，此藥劑對披衣菌之作用與菌株有關，大部份之菌株可因此藥劑之作用而促進生長，但某些菌株則毫無作用。
　　披衣菌對細胞培養感染率低，所以常採取加強感染率的方法，即披衣菌可因在 37℃ 時，將接種物在 1000~3000g 遠心 30~90 分鐘，經由促進披衣菌之吸附於細胞上，而促進對細胞培養之感染率。將接種物除去後，補充含有細胞分裂抑制物之培養液，在 37~39℃ 培養，並在適當的間隔，以適當之染色方法檢查披衣菌，通常係在感染後 2~3 天，及 5~6 天時檢查。如果在第 6 天仍為陰性，則可收集細胞液並繼代之。
   
 
附錄 5. 補體結合試驗 (CF 試驗 )
 
　　補體結合試驗是使用最廣泛的，檢查披衣菌抗體的血清學診斷試驗。CF 試驗的作法差異很大，因為來自許多家禽的血清，在標準 CF 試驗中都具抗補體性，因此必須加以修改。這些改進的方法，包括加入定量哺乳動物抗披衣菌抗體，及加入少量正常雞血清來幫助結合補體。近來，使用直接微量補體結合 (direct micro-CF) 試驗亦得到滿意的結果。
　　最簡單的 CF 抗原的製備方法，是將披衣菌於組織培養中培養。生產直接微量 CF 試驗使用的抗原方法如下：
(1)
 首先培養披衣菌於組織培養中，當細胞病變出現時，開始收集披衣菌及組織培養細胞的碎片。
(2)
 加石碳酸到最終濃度為 0.1%，於 37℃ 下 感作 2 小時，以將培養物不活化。
(3)
 以 1000g 離心 1 小時，以將其濃縮。
(4)
 沈澱物再用含 1.0% 石碳酸，及 1.0% 甘油的 veronal-buffer saline(pH 7.2) 溶液，調回原來量的 10%。
(5)
 沈澱物再用均質機以最高速度，將其均質化 3 次，每次 1 分鐘，此步驟要置冰水中冷卻時實施。
(6)
 均質物再以 100g 離心 15 分鐘，以除去碎片。
(7)
 上清液稀釋至想要的濃度後保存。
第二步驟是生產 CF 試驗用抗原。抗原由 L 細胞製備。去掉培養液：
(1)
 將細胞於 56℃，加熱 40 分鐘。
(2)
 置於蒸餾水中溶解。
(3)
 用超音波振盪擊破細胞。
(4)
 用 CF 試驗稀釋液作成等張液。
(5)
 抗原，應以恢復期的綿羊血清，利用直接微量 CF 試驗來測定。測定時血清應使用 2 單位。
　　如果實驗室無法進行上述的步驟，也可由卵黃囊來製備抗原。但與組織培養法的製備抗原方法比較，此製備法顯然較為困難。卵黃囊抗原用來作哺乳動物和鴿子血清的 CF 試驗效果很好。對其他家禽血清，此抗原也可使用來作間接 CF 試驗或直接 CF 試驗之變法。
　　所有供試血清應先在 56℃，30 分鐘非化。每個血清樣本應重覆測試 (duplicate)，每次測試應包括陽性及陰性抗原對照，以及陽性及陰性血清對照。
　　補體結合抗體通常於感染 7~10 天內出現。抗體力價 4 倍以上，CF 試驗就認為是陽性。禽類族群中若有典型的披衣菌症狀出現，且血清力價達 64 倍以上，則可初步診斷為披衣菌感染症。所以要這樣作是因為披衣菌在自然界普遍存在的緣故，許多野生禽類和哺乳動物都呈慢性感染。低毒力的披衣菌造成的不顯性腸道感染也很普遍。無症狀的火雞、鴿子、鸚鵡、牛或綿羊也有 50% 以上的比例在血清中會出現陽性抗體。

 

回上一頁 回列表