雞胚胎

將受精蛋置於溼度保溫箱內(37 ~ 38℃)，並且每天翻轉兩次，在10 ~ 11天之後照蛋檢查胚胎，選取含活胚胎的雞蛋備用。用酒精將氣室的部位洗淨，並將蛋殼鑽一小孔。每個樣品接種三個雞蛋，分別各接種0.1毫升的樣本到羊膜腔(amniotic cavity)，將針頭退出大約1公分時再接種另一0.1毫升到尿囊腔(allantoic cavity)。另外，樣本也可單獨注入到尿囊腔。最後再用石臘或膠帶將洞口封往，再將蛋培養在34 ~ 35℃下2 ~ 3天。

收集上述蛋在4℃下放置隔夜以殺死胚胎，並減少收集病毒時雞胚胎的出血量。將蛋殼外部消毒好之後，用吸管收集羊膜腔和尿囊腔的液體，每次收集的液體都分開放置。這些收集好的液體用PBS配成0.5%雞紅血球(RBC's)或0.4%天竺鼠紅血球懸浮液，進行血球凝集(HA)試驗，沒有產生凝集反應的紅血球當試管或玻璃盤傾斜時會往下流。如果沒有凝集反應發生時，再這些採集液體混合後再重新在雞蛋裡繼代；所有凝集反應陽性的樣本，則將其分成等份貯存在 -70℃，取其中一份用血球凝集試驗來測力價。如果它的力價在1/16以上的話，再用抗血清做亞型1 和亞型2 的病毒分型。如果力價不高的話，將凝集反應陽性的樣本再繼代。為了避免產生缺損干擾病毒顆粒（defective interfering particles），可先將其稀釋至1/10、1/100、1/1,000等不同濃度再接種增殖。選擇陽性反應最高的樣本留下並貯存起來。繼代次數可能需要高達五次以上，特別是從接受過疫苗免疫的馬所取得的樣本。

細胞培養

如果無法取得雞胚胎的話，可以用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞株(MDCK, ATCC CCL34)的細胞培養方法來分離馬流行性感冒病毒。細胞在試管裡長滿後再接種樣品，每個樣品做三重覆，分別取0.25 ~ 0.5毫升如前述方法處理後的樣品接種於試管內。培養基內不含血清，但含有2μg/毫升的胰蛋白酵素(trypsin)，並每天檢查其細胞有無細胞病變作用(CPE)。如果發現呈陽性反應，或是無細胞病變作用的樣品培養七天之後，取其上清液做血球凝集試驗。力價如果大於 1/16 時，立即做分型試驗；如果呈陰性反應或是力價小於 1/16 的樣本，則再繼代。

另外，也可以用血球吸附試驗來篩檢培養細胞。這個方法是用來檢測細胞表面有否病毒抗原。吸出培養液之後，用磷酸緩衝溶液洗試管後，加入一或二滴雞或天竺鼠紅血球懸浮液。小心轉動試管然後置於22℃(±2℃)下30分鐘。以磷酸緩衝溶液洗掉未結合的紅血球，然後在顯微鏡底下檢查是否有血球吸附的現象。

血球凝集酵素

剛分離的馬流行性感冒病毒之分型，最好是用特異性抗血清來做血球凝集抑制試驗。不同動物所產生的抗血清會有交叉反應（cross-reactivity），惟雪豹（ferrects）所產生的抗體最具特異性(10)。最初分離之物質可以用Tween 80/乙醚來處理以除去病毒的感染力，並減少交叉感染的機會。特別是對 A/馬 / 2 病毒株來說，用這方法處理之後，可以增加血球凝集試驗的效果(7)。

可以用巨量(macro-)和微量的試驗(microtests)方法來進行血球凝集抑制試驗。將抗原稀釋成1/4或1/8血球凝集反應的力價。經處理（減少其非特異性）的抗血清，以磷酸緩衝溶液連續稀釋，在加入抗原之後，將這混合物在22℃(±2℃)下作用30分鐘。再加入紅血球(0.5%雞或0.4%天竺鼠紅血球)，輕緩混合之後在22℃(±2℃)下作用30分鐘。微量試驗的磷酸緩衝溶液、血清和抗原都是使用0.025毫升，然後再加0.05毫升的紅血球懸浮液。而在巨量試驗裡，全部都用0.5毫升。力價即完全抑制凝血的最高血清稀釋倍數，所謂抑制凝血是當試驗盤傾斜時血球會朝下流的狀態，抑制情況不完全亦視為有凝集反應發生。所採集的樣本必須以最快的速度送至世界參考實驗室(國際畜疫會和世界衛生組織)，以便做病毒株的抗原變異監控計畫和新毒株的收集等。

必須同時做標準抗原以確認病毒，包括：亞型1（例如，A/equine/Prague/56及 A/equine/Newmarket/77）和亞型 2 (例如，A / equine / Miami / 63 、A / equine /Fontaine-bleau / 79、A / equine / 2 / Newmarket / 93 及 A/equine / Kentucky / 94) 。另外，如果有同一地理區域內的新近分離病毒株也應一併加入。標準抗原必須以 Tween 80/ 乙醚處理以避免互相感染。待測試抗原和標準抗原必須用反稀釋（back-titrated）的方法來確定它們的抗原含量。

神經醯胺酵素

分類神經醯胺酵素(neuraminidase)必須用特殊的抗血清並且無例行可遵循的技術可供參考，所以這分類的操作最好是在參考實驗室裡進行。

用酵素結合免疫吸附試驗來檢測病毒抗原

在無法進行分離病毒的實驗室，欲由鼻分泌物檢測有否流行性感冒病毒抗原存在，可以用單株抗體(Mab)對病毒核蛋白(nucleoprotein)進行抗原捕捉酵素結合免疫吸附試驗(antigen capture ELISA) (1，2，8)（已有商業化之產品)。

ELISA可以給提供一個很迅速的試驗結果，但不能用來取代病毒的分離，因為送到分離實驗室來分類病毒以便做整個防疫的監控以及取得新病毒的變異株才是最重要的。在資源有限的情況下，先以酵素結合免疫吸附試驗篩得陽性反應樣本，再採集該樣本來做病毒的分離。

˙ 試驗步驟

試劑可洽世界畜疫會參考實驗室(Newmarket，[參考第707 ~ 721頁的表])。

血球凝集抑制試驗

使用之前所述的標準抗原，如果可能的話，也使用最近發生病例的抗原。為了增加本試驗抗原的敏感度，所以先用Tween 80/乙醚來處理抗原，特別是針對A/馬/2病毒抗原更需如此。經過親水處理過的抗原可以自國際畜疫會參考實驗室取得(德國，慕尼黑)。抗最近分離A/馬/2病毒之冷凍乾燥抗血清可以自國際畜疫會參考實驗室取得（Newmarket）。試驗最好是用適合的稀釋設備在微滴定盤內操作。血清先做預處理以便去除非特異性的血球凝集試驗，並且在56℃下30分鐘加以不活化。預處理包括以下之一：(a) 白陶土和紅血球吸附，(b) 高碘酸鉀(potassium periodate)，或 (c) V. cholerae受器-破壞酵素(receptor-destroying enzyme)。以上述三種方法之一處理，都可以得到相同的結果。處理過的血清用磷酸緩衝溶液稀釋，加入1/4力價的抗原，溫和攪拌後於22℃(±2℃)作用30分鐘。再加入紅血球30分鐘後判讀結果。凝集抑制試驗的力價是能完全抑制血球凝集試驗的最高稀釋倍數的血清。成對的血清力價如果增加4倍以上時，表示最近有受過病毒的感染(17)。

˙ 血球凝集抑制試驗微量法

必須準備下列的材料：以Alsever's溶液配成的雞紅血球(1%[體積/體積]濃縮細胞)、U-型底的微滴定盤、磷酸緩衝溶液(PBS)、流行性感冒病毒(全病毒或是經過Tween 80/乙醚處理的病毒)、高碘酸鉀(KIO4)和甘油等。

˙ Tween 80/乙醚處理病毒

˙ 血球凝集力價測定

˙ 血清的預處理

˙ 試驗步驟

單一輻射溶血(SRH)試驗

本試驗用的瓊膠中，含有病毒抗原、定量的紅血球及天竺鼠補體。瓊脂打小孔並放入待測血清。流行性感冒病毒抗體和補體會使被覆抗原的紅血球溶解，而形成一圍繞小孔的明顯溶血環，可以量出這溶血環的大小(9，15，16)。

這試驗可以用特製的免疫擴散盤(Hyland, Miles Scientific)來操作，但也可以用培養皿。綿羊紅血球以 Alsever's 溶液洗三次。補體可以由市場上購買或是用健康天竺鼠的血清。抗原是用尿囊液或是純化的製備物，使用血球凝集抑制試驗裡相同的病毒株。以高碘酸鉀或氯化鉻(chromiium chloride)使病毒附在紅血球上，將附有抗原的紅血球和補體混合，並加於含上1%的瓊脂(低熔點)的磷酸緩衝溶液。必須注意在任何時候溫度都不能超過42℃，將上述混合液適量分注於試驗盤，於4℃靜置隔夜。在瓊脂上打直徑2 ~ 3毫米和距離12毫米的小孔，小孔距離試驗盤的邊緣是6毫米。製備好的試驗盤在4℃下可以保存1 ~ 2週之久。每一個抗原製備而成的試驗盤都必須先經過已知的陽性和陰性抗血清的測試。

血清用56℃作用30分鐘使之不活化，但不需要再做進一步的處理。成對血清需於同一試驗盤上做二重覆之檢測，且所有血清均需在對照試驗盤同時檢測，對照試驗盤含除了病毒之外的所有成份做測試。或許，另外一種不相關的病毒，例如 H1N1 病毒可以用於對照的試驗盤內。對羊紅血球有溶血性的血清必須先用羊紅血球預先吸附。溶血區應該是清楚不模糊或半透明。溶血區域可以由溶血範圍的大小測量出來。

˙ 材料

氯化鈉、氯化鉀、HEPES(N-2-羥乙基對二氮己環，N-2-乙磺酸)、病毒抗原、牛血清白蛋白 (BSA)、NaHPO4、KH2PO4、瓊脂、對照抗血清、NaOH、氯化鉻(chromium chloride)、作為補體的天竺鼠血清、3毫米的瓊脂打孔器、塑膠盒、測量溶血區域的工具、透明塑膠免疫試驗盤(6 x 11公分)、打孔器的模板、水浴器、保溫箱和鈉疊氮化物(sodium azide)。

˙ 反應劑的製備

˙ 試驗步驟

在致敏化的過程中，用高壓鍋將瓊脂熔化。在使用之前，吸取7.8毫升的量到環球瓶(universal bottle)並保持在42℃的溫度。在作用前，檢查看瓊脂是否已冷卻到42℃。

˙ 試驗盤的準備

最適當的抗原量是以可造成最大最明顯的溶血區域為標準。

對照血清：每一試驗盤需有一小孔為亞型 - 特異性抗血清。

˙ 結果的判讀

有效的結果是陽性和陰性對照血清所得的結果必須和以前的測試結果相符合。對照血清的溶血區必須清楚並且變化不能超過原先預估值的10%。結果可以用平方毫米來表示，也可以和對照血清值按比例計算。對照盤裡陽性結果的血清必須用羊紅血球吸附。為了達到正確診斷的目的，急性感染和在恢復期的馬血清必須在同一試驗盤上做二重覆的測試，如果恢復期比急性期馬血清的溶血區域還大的話，即顯示感染了馬流行性感冒。若恢復期血清中的抗體含量在急性期血清的二倍以上，則其溶血區的增加會很明顯。增加的區域可以用連續稀釋的標準抗血清所繪出的標準曲線圖計算出來。

種病毒的特性

國際畜疫會和世界衛生組織的參考實驗室（Newmarket）進行的疾病監控計畫可提供作為疫苗之合適病毒株的資料(13)。推薦的疫苗病毒株每年六月發表在國際畜疫會的公報上。 疫苗必須含有亞型 1 和亞型2 病毒的代表病毒株。

亞型 1：屬於亞型 1 的病毒株，例如：A/equine/Prague/1/56 或可以用更新近分離的流行病毒株(5)。

亞型 2 ：混合的亞型 2 病毒抗原變異株(3)。所使用的疫苗中包括最近分離流行的病毒株是相當重要的。典型的歐洲病毒株，包括：A/equine/Suffolk/89、A/equine/Borlange/91，及A/equine/Newmarket/2/93等。典型的美國代表病毒株，則為 A/equine/Kentucky/94。偶爾在歐洲可發現似美國株的病毒，反之亦然。在那些大陸相連的許多地區之馬群所用的疫苗必須包含一種以上的亞型 2 病毒。基於偶有分離出類似邁阿密病毒的報告（4），有些疫苗也會包含最初的原型(original prototype)病毒株A/equine/Miami/63，。但如果祗用類似 Miami/63 作為疫苗的話，無法對目前流行的大部份病毒提供足夠的保護作用。

培養方法

病毒株可以來自國際畜疫會參考實驗室(參考第707 ~ 721頁之表)。被選擇作為疫苗的病毒株必須記錄它的來源和繼代的歷史。病毒株是在10日齡的雞胚胎之尿囊腔內或是細胞培養，例如 Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細胞中增殖。每一個病毒株必須分開操作，病毒生長情形的監控是用血球凝集試驗，每一次繼代的病毒在血清學試驗上必須有相同的結果，血清學的方法例如血球凝集抑制試驗或是單一輻射溶血試驗。假如是以細胞培養的方式增殖病毒中的話，必須以雪貂血清和單株抗體來確認其抗體性，以避免在種毒株和實用種毒株（working seed virus）的繼代過程中混雜入變異株病毒。種毒株和實用種毒株在檢查過外源性抗原之後，將其小量分裝以冷凍乾燥的方式貯存在 -20℃ 或在 -70℃ 之下，並且詳細做好貯存狀況的記錄。

每一批作為疫苗的種毒株必須同時處理，以確保它們能有相同的組成、測定有否外源性物質，並完全定性。作為抗原性時，血球凝集抑制(HI)反應的抗血清或單株抗體(Mabs)可以取自國際畜疫會和世界衛生組織的參考實驗室。

每一批實用種病毒株必須源自種毒株，並且要有相同的組成份、沒有外源性抗原，以及完整的定性。小量分裝實用種病毒株以作為疫苗生產之用。

每一批的種病毒株和實用種病毒株必須來自無特定病原(SPF)的雞胚胎或是至少要來自健康雞群的雞胚胎。

假如是使用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞作為增殖疫苗病毒之用的話，必須先建立種細胞株(master cell lines)，並且要貯存在液態氮裡以及根據國家防疫當局指導(National Control Authority Guidelines)來測定沒有外源性抗原的污染。

種毒株之外源性抗原之檢查，包括黴漿菌(mycoplasmas)和其它可能感染馬之病毒。必須以適當的技術來操作，包括以有感受性組織細胞培養並觀察有否細胞病變作用(CPE)或運用螢光抗體來做抗原的檢查等。

一般常見的馬呼吸道病原，如馬泡疹病毒(herpesviruses)1，4，2、馬微小核醣核酸病毒(picornaviruses)、馬病毒性動脈炎(viral arteritis)和馬腺病毒(adenoviruses)等都不能存在於疫苗之中。

必須做標準無菌試驗(standard sterility test)以確定疫苗中無雜菌污染，並以小動物進行毒性試驗（Toxicity test）。

每個選定的疫苗毒可先製造一批原形（prototype）疫苗，用檢定標準測試其純度、安全性等，以確認該疫苗是否適用。種毒株必須是經增殖可產生高力價，以便產生足夠的抗原量，使標的動物免疫後可產生良好的抗體反應。

另外，用Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞來繁殖的種毒株必須在培養過程中沒有抗原變異株(antigenic variants)的產生，因為它已無法代表這原始的種毒株來作為疫苗的製造了。

無菌

防止其它生物物質污染和無菌的測試方法，請看第1.4章。

安全性

力價

當病毒抗原和佐劑混合之後，必須取少量的疫苗在生體內用馬和天竺鼠來測定其力價。雖然紅血球凝集單位和單一輻射溶血等的方法被用來作為測定疫苗產品病毒株的抗原定性試驗，但在試管內做疫苗的定量測試時，佐劑則會產生干擾的現象。在國家防疫當局的同意下，每批次的再檢測（repeated batch tests）可以用天竺鼠來進行。

歐洲葯典(European Pharmacopoeia)也可以用來作為控制馬流行性感冒病毒疫苗的參考。

免疫有效時間

疫苗產品所附資料宣稱的免疫有效時間必須在按照推薦的防疫計畫之下，要和能維持有效抗體量的時間一致。所宣稱的抗體量必須能通過攻擊試驗(看第B.4.c.2節)，或是以現有已出版的比較報告為根據。

穩定性

疫苗必須貯在5±3℃之下，並且避免光照。疫苗產品所宣稱的有效期限(shelf life)必須和在天竺鼠體內，按照特定時間所做的力價測定相符合(看第B.4.c.3節)。

保存劑

一般均不含保存劑。

注意事項(可能的危險)

疫苗在打開後一小時內，必須使用完畢。但接種疫苗時，必須注意儘量做到無污染，並且祗有健康的馬匹才可接受疫苗注射。偶爾可能會發生短暫的局部性和全身性的反應，所以接種後，應該有24 ~ 48小時的休息。

安全性

如第B.4.b.1節所述，一旦原始種病毒株做好完備的安全性試驗之後，以後批次懷孕母馬的例行安全性試驗，則可以省略。

力價

看第B.4.c.3節。最低限度每批生產的疫苗必須用天竺鼠做血清學試驗。