九、藍舌病
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(一) 病名及病原
1. 病名： 藍舌病 (Bluetongue) 2. 病原： 係由里奧病毒科 (Reoviridae) 之環狀病毒 (Orbivirus) 中的 Blueton-guevirus 感染引起的牛隻傳染病。 (二) 疾病簡介
本病為家畜類和野生動物反芻類的節肢動物媒介性病毒性傳染病，家畜類反芻動物主要感染於綿羊，其次為牛和山羊。野生類反芻動物則以鹿感受性最高，羚羊、巨角野羊等亦會感染。因本病最早在綿羊發現，是引起舌頭發紺呈藍紫色，故稱本病為藍舌病。在牛本病通常呈不顯性感染而為長期間的帶毒者，約有 5% 顯性感染；而急性病例在口腔、蹄冠部位或是乳頭、陰道等處的皮膚呈現潰瘍病灶。故過去亦稱本病為假性口啼疫 (Pseudo-foot and mouth disease)。本病主要發生在中國大陸、非洲、澳洲、美洲、束南亞以及日本等地區。 廣義的藍舌病病毒群有 32 種血清型 ( 包括茨城病 )，一般認為是有 20 種血清型，這些病毒型在凝膠沉降反應試驗或螢光標示抗體法等血清反應均呈交叉反應。而任何一型病毒所產生的免疫力是無法提供足夠的保護來抵抗其它型的病毒感染。感染的動物會有出血、水腫和充血的特徵。 (三) 典型之臨床症狀及病理變化 在牛本病通常呈不顯性感染，有時顯性感染可達 5% 左右；但通常都呈輕症型而有長期的持續性病毒血症 ( 有數 10 天、2 至 4 個月或是達數月之久的報告 )，綿羊的病毒血症往往是 3 至 4 週以下，BIuetongue virus 主要存在紅血球內。另外，妊娠牛感染可引起流產、胎兒大腦缺損 ( 內水腦症 ) 或其它畸型 ( 如齒齦過多、體驅關節變形、無頷畸型頷凸畸型 )。輕症型有些僅暫時性的發熱和短暫的白血球減少在，有些則會併發暫時性食慾減退或是唇、口蓋和齒齦之輕微糜爛，而這些症狀往往容易被忽略。在罹病羊，會有典型的發熱、削瘦、口腔病變跛行與大量死亡，經常造成小羊的嚴重損失。 急性型發生時往往是短暫性高熱 (40 至 41℃)，淺速呼吸，四肢僵硬和跛行，流淚、流涎，唇、齒根、舌頭腫脹和潰瘍，鼻鏡乾燥、龜裂和剝皮。泌乳牛乳房和乳頭腫脹，有時乳頭有潰瘍。隨疾病的進行，蹄冠部和趾間皮膚充血、腫脹、潰瘍而跛行。病牛呈現沉鬱、離群和食慾不振，死亡率低。本病多發於初夏至晚秋，雨季，且地形上處於低窪多濕地區亦較易發生本病。病媒可能是某種牛糠蚊，如 Culicoides variipennis 或 C.oxystoma 等。發病動物的唇、齒齦、舌頭粘膜呈充出血、水腫、糜爛及潰瘍，。呼吸困難的痛牛其鼻粘膜或口粘膜呈充血、水腫。在中樞神經系統有時可發現非化腺性腦膜腦炎的痛灶。 (四) 應採病材
發現牛隻有發熱或是唇、齒齦、舌頭腫脹和潰瘍現象的牛隻可以採集加抗凝劑的血液供病毒分離。牛隻若解剖檢查時，應採集鼻粘膜、肺臟、脾臟、腦組織製成乳劑以供病毒分離。流產胎兒採集腦、腦液或是脾臟。 現場懷疑病例的牛隻採集加抗凝劑全血後，先經 2000rpm 離心 5 分鐘，分離出血球液及血漿，經分別收集血漿後，血球液部份再經滅菌過的 PBS 清洗 3 次後，以 PBS 還原為原來全血容積，再直入 -80℃ 冷凍保存供病毒分離用。 (五) 綜合診斷 1. 藍舌病病毒之分離與同定 分離藍舌病病毒的方法可以用老鼠腦內接種方式或是細胞接種方式進行：老鼠腦內接種方式是選取出生 3 日齡的哺乳鼠，以洗淨的紅血球懸浮液 0.02ml 進行老鼠腦內接種，然後觀察老鼠是否有症狀或死亡，而這腦內接種方式往往也須 1 至 2 代的增殖才會有明顯的症狀或死亡。將死亡老鼠的腦組織取出以培養液製成 10 乳劑進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。 病毒分離用細胞：主要使用 HmLu-l 及 BHK-21 繼代細胞。細胞培養用培養液是以 Eagle'sMEM，添加 8% 胎牛血清，並以 7.5% NaHCO3 調整 PH 為 7.0-7.2。以 24 孔組織培養盤先行培養形成單層細胞，於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞，然後接種 0.2m1 臟器的乳劑上清液或是血球液，在 37℃ 5% CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。再將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 l 次，然後加入含 2%Bovine Serum Albumin 及 l0%Tryptic Phosphate broth( 以 7.5% NaHCO3 調整 PH7.0-7.2) 的細胞培養液 1ml 再送入 37℃，5% CO2的恆溫箱中培養，並觀察 2-7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生，必須再做 2 至 3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可進行電子顯微鏡檢測，或是血清中和試驗作為診斷依據。 (1) 電子顯微鏡檢測： 從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液，先以 3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，然後再以超高速離心 10 分鐘 (90,000rpm 氣動式離心機 )。取出沉澱物經負染色後，以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。藍舌病病毒的型態為球型，病毒顆粒大小為 60-80nm。 (2) 血清中和試驗檢測： 將分離的病毒株進行 10 倍序列連續稀釋後，加入抗藍舌病病毒的標準血清進行中和試驗，以血清中和的病毒力價和未加血清的病毒力價比較，以証實病毒是否受標準血清中和，而判定分離的病毒是否為藍舌病病毒。 2. 免疫學診斷方法 牛隻一旦受到藍舌病病毒感染後，其體內會產生抗病毒之特異性抗體，故檢測牛血清中是否有抗體就可以診斷牛隻是否已感染病毒。介紹下列三種方法供檢測牛藍舌病抗體： (1) 中和試驗： 測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，測試其病毒力價，然後小分裝保存於 -80℃ 冰箱中，待每次作中和試驗時取出稀釋使用。受測試的血清必須先經非動化 ( 在56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘 )，以去除非特異反應因子。取血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM)0.05ml 混合在無菌平底培養盤上做兩倍序列連續稀釋，並對每一個稀釋倍數做 4 個重覆，然後加入 0.05m1( 含 200TCID) 的病毒液，經震盪混合均勻後，再送入 37℃5%CO2 之恆溫箱進行感作1小時。經感作後加入 0.1m1 含 5×105 個細胞的細胞懸浮液，並震盪混合均勻，再以透明膠帶封住，還入恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後以形成單層細胞但未產生細胞病變的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 2 倍而判定為牛藍舌病抗體陽性。 (2) 凝膠沉降反應試驗 (Agar Gel lmmunodiffusion；AGID) 該抗原的製備，是先將病毒以HmLu-l細胞增殖或是以哺乳鼠的腦內增殖病 毒後濃縮成 AGID 抗原。 AGID 方法的進行是以 0.9% Agarose 溶於生理鹽水 ( 含 0.85%NaCl 和 0.05%NaN3 的水溶液 pH=7.2)，經煮沸溶解製成 AGID 測試用的凝膠。操作方法是以中央一孔置抗原 ( 直徑 4mm)，周圍 6 孔置供檢血清 ( 距中央孔 6mm)。在 37℃ 潮濕恆溫箱作用 24 小時後判定，若有抗原－抗體凝集反應發生就會有白色沉降線在抗原孔和血清孔之間產生。 (3) 酵素免疫吸附法 目前已有藍舌病的酵素免疫吸附法診斷套組，使用可依說明書上的方法進行。 以凝膠沉降反應試驗或是酵素免疫吸附法檢查牛隻抗體只是證實牛隻有無感染本病，對於抗體的高低或是力價表示仍須以中和試驗進行。 3. 病理學診斷 發病動物的唇、齒齦、舌頭粘膜呈充出血、水腫、糜爛及潰瘍。呼吸困難的病牛其鼻粘膜或口粘膜呈充血、水腫。在中樞神經系統有時可發現非化膿性腦膜腦炎的病灶。病理學變化很難與口蹄疫、茨城病、惡性卡他熱及水 
性口炎等疾病區別，須有病毒分離和血清學檢查以供診斷。而冷凍切片的螢光抗體染色法或是過氧化酵素染色法作診斷時，必須採取新鮮病材予以急速冷凍，並予以切片後以標示抗體染色檢查有無特異的螢光或色質反應。所採取臟器可選擇唇、齒齦、舌頭粘膜、脾臟、淋巴節、鼻腔上皮或是其它有病灶之處。 (六) 確診依據 發病牛隻的病原分離以及病死牛隻的解剖病變是確診依據。 (七) 參考文獻 1. 吳永惠 (1989) 牛病學 藝軒書局 台北市 pp.93-95﹒ 2. AfsharA., Thomas F.C., Wright P.F., Shapiro J.L. and Anderson j.( 1990) Comparison of competitive ELISA, indiret ELISA and standard AGID tests for detecting bluetongue virus antibodies in cattle and sheep. Vet. Rec.，124：136-141. 3. CampbeIl C.H., Barber T.L﹒ and Jochim M.M. (1978) Antigenic reIationship of Ibaraki, Bluetongue and Epizootic hemorrhagic disease viruses. Vet. Microbiol., 3：15-22. 4. Cherrington J.M. Ghalib H.W., Sawyer M.M. and Osburn B.I.(1985)Detection of viral antigens on bluetongue virus-infected ovine tissues using the peroxidase- antiperoxidase technique. Am. J. Vet.Res., 46：2356-2359. 5. Bluetongue OIE Manual 1992. PP. 71-84.