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第六章 特殊病原微生物檢查法

建立日期
96年01月10日
更新日期
96年01月10日
內容
6.1. Mycoplasma
6.1. 1. Mycoplasma 概論
  　Mycoplasma 又稱 PPLO (Pleuropneumonia-like Organisms :牛肺疫菌類似微生物) 的一群細菌之分類學上之目 (order)。
  　Mycoplasma 介於一般細菌與病毒。
  　其特徵即：
1. 以光學顯微鏡能看見之多形性微生物。
2. 其最小再生單位約100-175μ。
3. 因此其最小者，無法在光學顯微鏡觀察，且能通過細菌過濾器。
4.

菌型呈纖維狀或球菌狀等多形性 (Polymorphism)，用一般細菌之染色法難染，但卻易以吉姆薩 (Giemsa) 染色液染色。
5. 無運動性，革蘭氏 (Gram) 染色陰性。
6. 人工合成之培養基中能發育，可形成極微小之菌落。常常其中心部呈乳頭狀，或反而凹陷等特徵性菌落。
7. 雜菌（非病原性）之營養要求簡單，但寄生性者(病原性)需要動物蛋白，一般要求血清成份之存在。
8. 有嗜氧性，通性厭氧性，厭氧性等對氧氣之要求不一。
9. 遇熱易死，易溶於膽汁。
10. 各菌株間有共通抗原之外，也具有特異抗原型。
11.

有時在感染細胞內形成封入體 (包涵體)，一般無。
12. 宿主域極明確。
13. 感染後有免疫。
14. 無細菌壁。
15. 對青黴素 (Penicillin ) 具有高度耐性。
  　　本菌群最初之研究，如 PPLO 其名所示，係由牛之傳染性胸膜肺炎（牛肺疫：Contagious Pleuropneumonia of Cattle）之原因菌開始，並命名牛肺疫菌 Bovine Pleuropneumonia Organism (PPO) ，嗣後多種類似之細菌，自人及動物之呼吸器，口腔，泌尿生殖器，消化器分離，此種細菌依據其性狀及共同之特徵，總括稱為類牛胸膜性肺炎菌 (Pleuropneumonia like Organism )，簡稱 PPLO。
6.1. 2 雞黴漿菌的分離
6.1. 2.1 由病雞分離 Mycoplasma gllisepticum 及其同定法
6.1. 2. Hofstad 變法培養基 (Modified Hofstad's Media)
6.1.
3 豬黴漿菌的分離 林文華
 

　　豬經常感染的黴漿菌有 Mycoplasma hyopneumoniae (M. suipneumoniae ) --> 引起慢性的肺炎，Mycoplasma hyorhinis --> 引起多發性漿膜炎和多發性關節炎，Mycoplasma hyosynoviae --> 引起多發性關節炎，Mycoplasma flocculare --> 常存在於呼吸道，未具有病原性。除此之外，尚可分離到其他不知病原性的黴漿菌，如 M. sualvi, M. arginini, M. buccale 和一些 Acholeplasma 種類等。表一所列是有關豬隻的各種黴漿菌經常發現的組織部位。

具有病原性的豬黴漿菌，一般在分離和確認的原則上可分為兩類：一類是 M. hyorhinis 和 M. hyosynoviae --> 在各種培養基內很容易發育，而且有典型的「荷包蛋」菌落形態。另一類是 M. hyopneumoniae 和 M. flocculare (未具病原性) --> 培養較困難，由檢體作初次分離時，必須使用液體培養基，然後再經繼代數代後，才能於固體培養基上發育，菌落小，呈顆粒狀的表面，沒有中凸的典型「荷包蛋」菌落形態。

 
 
   
6.1. 3.1. 分離培養基
6.1. 3.1.1. 液體培養基
  1. 適用於 M. hyopnenmoniae, M. flocculare, M. hyorhinis 分離之液體培養基。
 
(A) Friis 培養基：
 
Modified Hank's Balanced Salt Solution (1×)a 100ml
Distilled Water 150ml
Bacto Brain Heart Infusion(Difco) 1.64gm
Batco PPLO Broth w/o CV (Difco) 1.72gm
上列成分經 121℃， 15 1bs 壓力高壓滅菌五分鐘，冷卻後再加入下列成分：
25% yeast Extractb 12ml
Phenol Red (0.5%)c 0.9ml
Bacitracin 50mg
Methicillin 50mg
Porcine Serum (inactivated)d 98ml
pH 7.4
  經 0.2μm 濾膜過濾，並作無菌試驗後，存放於 -20℃ 或每支試管分裝 1.8 ml，存放於 4℃ 備用。
 

註：a. Modified Hanks' Balanced Salt Solution 之配製：
  　　　"A" Hanks' Solution (10×)：
 
NaCl 80gm
KCl 4gm
MgSO4．7H2O 1gm
MgCl2．6H2O 1gm
Distilled Water 400ml
CaCl 1.4gm
再加Distilled Water 至 500ml
  　　　"B" Hanks' Solution (10×)：
 
Na2HPO4．12H2O 1.5gm
Distilled Water 400ml
KH2PO4 0.6gm
再加Distilled Water 至 500ml
  　　使用時，Hanks' "A" 溶液取 25 ml，加於 400 ml 蒸餾水，再加 25 ml Hanks' "B" 溶液加入混合，然後加蒸餾水至 500 ml。
  　　b. 25% Yeast Extract (酵母抽出液)之製備：
用 5000ml 的燒杯，稱取市售的酵母顆粒500gm
↓
加入2000ml 蒸餾水
↓
沸水中煮15分鐘
↓　用玻璃棒攪拌（會冒泡，須注意）
冷卻，離心30分鐘（6000rpm）
↓
普通粗濾紙過濾
↓
濾液分成小瓶裝
↓
保存於－20℃
  　　c. 0.5% phenol red 之製備：
用小三角瓶稱取 0.25g phenol red
↓
加入 0.1N NaOH 10ml
↓
溶解後，再加入蒸餾水 40ml
↓
過濾
↓
高壓滅菌
  　　d. 豬血清之非慟化：
  　　　豬血清 --> 56℃ 水溶槽，３０分鐘 --> 7000 rpm 離心。
(B) BHL 培養基：
 
Brucella Broth 13.0gm
Lactalbumin Hydrolysate 5.0gm
Salt Solutiona 1250ml
Porcine Serum (inactivated) 500ml
25% Yeast Extract 125ml
Methicillin (10mg/ml) 25ml
Bacitracin 250mg
Distilled Water 600ml
pH 7.6
經 0.2μm 濾膜過濾，並作無菌試驗後，存放於 - 20℃ 或每支試管分裝 1.8 ml，存放於 4℃ 備用。
註：a. Salt Solution 之配製：
NaCl 10.0g
KCl 0.5g
Na2HPO4．12H2O 0.19g
KH2PO4 0.75g
Glucose 2.5g
Phenol Red (0.4%) 6.25ml
Distilled Water 1244ml
(C) 透析培養基：
 
Bacto Brain Heart Infusion 11.07gm
Bacto PPLO Broth w/o CV 11.7gm
Distilled water 150ml
煮沸溶解，冷卻後再加 80ml yeast extract，然後裝入透析膜內，置於透析液 (Hanks' solution (1×) 675ml + Distilled water 1020ml ) 內，於 4℃ 下透析 48 小時。
將所得之透析液再加入下列成分：
Porcine Serum (inactivated) 586ml
Methicillin 338mg
Bacitracin 338mg
Phenol Red (0.5%) 6ml
pH 7.4
經 0.2μm 濾膜過濾，並作無菌試驗後，存放於 -20℃ 或每支試管分裝 1.8 ml，存放於 4℃ 備用。
(D) 選擇性培養基＊：
  適用於 m. hyopneumoniae 和 M. flocculare 之分離，取上述（A）、（B）、（C）三種培養基，任一種的每 100ml 中加入抗 M. hyorhinis 的兔血清 5-10ml (須無菌)。
 
＊. 本培養基內今有 M. hyorhinis 抗血清，是為了提高 M. hyopneumoniae 之分離率。因為在許多肺炎病變的肺臟組織內，常會有很高力價的 M. hyorhinis 污染，於分離培養時會發育的較快而影響 M.hyopneumoniae 之發育，因此加入抗血清以抑制 M. hyorhinis 之發育。除此之外，提高 M. hyopneumoniae 之分離率尚有一些改進的方法。(1)在培養基內加入Cycloserine (0.5mg/ml) 或 Kanamycin sulfate ( 2u/ml)。(2) 提高培養基內的血清濃度 (25-27%)。(3)培養基內的酵母抽出液 (Yeast extract) 改用酸性的酵母抽出液＠，或每週繼代一次，經過 5~7 次後，就有利於 M. hyopneumoniae 之發育，因為 M. hyopneumoniae 比 M. hyorhinis 較能扺抗低的 pH 值。
@. 酸性酵母抽出液之製備：
40℃ 蒸餾水 500 ml + 250 gm 市售酵母顆粒
　　　　↓混合均勻
再加入500 ml 蒸餾水
↓
用濃 HCl 調 pH 值至 6.4
↓
置於 80℃ 水浴槽，維持 20 分鐘
↓
冷卻後，離心 30 分鐘（6000 rpm）
↓
用粗濾紙過濾
↓
分成小瓶裝
↓
保存於 -20℃ 備用
  2. 適用於 M. hyosynoviae 之分離
 
(E) Hayflick培養基：  
  Bacto PPLO Broth w/o CV 20.6gm
  Bacto Yeast-Extract 4gm
  Arginine Mucin Solution@ 15.6ml
  Distilled Water 850ml
  Porcine Serum (inactivated) 250ml
  Penicillin G 250mg
  Phenol Red (0.5%) 3.6ml
  pH 7.2
  經 0.2μm 濾膜過濾，並作無菌試驗後，存放於 -20℃ 或每支試管分裝 1.8ml，存放於 4℃ 備用。
 
@. Arginine mucin solution 是含有 8% arginine monochloride 和 0.8% Bacto-mucin (Difco) 的水溶液。此溶液經高壓蒸氣滅菌 5 分鐘會有助於溶解。
6.1. 3.1.2. 固體培養基：
 
(A) Friis 固體培養基：
  　以最終濃度的0.6%-0.8% Purified agar (Oxoid ) 加入液體培養基的基礎成分內，經 121℃, 20 分鐘高壓蒸氣滅菌後，冷卻至 45℃，再加入經 0.2μm 濾膜過濾的追加物：Yeast extract, Phenol red, Bacitracin, Methicillin, Porcine serum (inactivated)，混合均勻後分裝於 60 × 15 mm 培養皿內，存放於 4℃ 備用。
  (在最終濃度的培養基內，每 100ml 可以加入 10mg 之 DEAE dextrose，可以促進 M. hyopneumoniae 的發育)。
(B) Hayflick 固體培養基：
  　以最終濃度的 1％ Noble agar 加入液體培養基的基礎成分內，經 121℃, 20 分鐘高壓蒸氣滅菌後，冷卻至 45℃，再加入經 0.2μm 濾膜過濾的追加物：Porcine serum (inactivated), Penicillin G, Phenol red，混合均勻後分裝於 60 × 15mm 培養皿內，存放於 4℃ 備用。
6.1. 3.2. 分離步驟：
  (一) M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 之分離
  　　Mycoplasma hyopneumonia 是引起豬流行性肺炎或豬黴漿菌肺炎 (Enzootic pneumonia or Mycoplasmal pneumonia of swine) 的病因。在自然發生的流行性肺炎常是混合性的，會混雜其他微生物一種或多種的二次性感染，致使疾病更加嚴重。本菌可以由感染的肺臟、氣管、支氣管和鼻腔的分泌物中分離，尤其是在早期病變中幾乎都可以分離到，甚至於感染很久以後仍可分離到本菌。
  　　Mycoplasma flocculare 在豬群中分佈很廣。其在下呼吸道粘膜上面的增殖，如同在鼻腔內之增殖一樣好，雖然未具病原性，但經常在肺炎病變的組織內可以發現得到它的存在。
  　A.採材：
1. 收集無污染的病變肺臟，必須採取含有病變和正常組織相連的部位；或者如果肺臟的外表已經受到污染，必須盡可能採取含病變的區域大一點，然後將其放入沸水中煮 8~10 秒鐘，取出後，無菌切下一塊組織。或者以經火燒過的燙板，將選擇之部位的表面燙過後，無菌切下一塊組織 (約 10gm 重)。
2. 將切下之組織塊，加入非選擇性液體培養基內研磨，使成為懸浮液。
3. 取懸浮液 0.2ml，以非選擇性液體培養基或選擇性液體培養基作 10x 連續稀釋，直到 10-5或者更高。
  （另外如果使用液體培養基，以棉花棒取得的氣管和支氣管分泌物或洗滌呼吸道的洗滌液，作分離時亦同上述之稀釋）。
  　B. 培養和觀察：
1. 將各稀釋後的培養液置於 37℃ 培養（最好是置於組織培養的試管型旋轉圓盤上作培養）。
2. 每日觀察各試管內之培養基的 pH 變化（ pH 值下降時，會使紅色的培養基變成黃色）。
3. 重覆繼代，直到繼代後會在 24~48 小時內使 pH 值下降為止。
4. 此時，可以 M. hyopneumoniae, M. flocculare 和 M. hyorhinis 之抗血清，以代謝抑制試驗 (Metabolism Inhibition test) 作同定。如果結果不能確定，純化分離可以利用含有抗血清的選擇性培養基繼續繼代，或者使用固體培養基作純化同定。
5. 取經數代繼代後的培養液，接種於固體培養基上，培養於 37℃ 含 5~10% CO2 的大氣壓下。M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 的菌落會在 2~3 天後出現，大約 10 天後，菌落會發育到最大，而 M. hyorhinis 的菌落則會發育的較快且較大，有典型的「荷包蛋」菌落形態。
6. 如果需要，菌落還可以以生長抑制試驗 ( Growth Inhibition test) 或免疫螢光染色 (epi-immunofluorescence) 作同定。
  (二) Mycoplasma hyorhinis 之分離
  　　Mycoplasma hyorhinis 在豬的呼吸道內，是一種很普遍存在的黴漿菌，能引起胸膜炎、腹膜炎、心囊炎和關節炎；有些菌株甚至會造成小豬的肺炎。雖然在肥育豬自然發生的肺炎上，其並不是主要角色，但是由豬的流行性肺炎病變內經常可以分離到。另外在細胞培養也普遍性存在有本菌之污染。
  　A.採材：
1. 鼻腔和下呼吸道分泌物用無菌的棉花、tip 採取。
2. 採取肺臟組織作成均質化懸浮液（如同 M. hyopneumoniae 之分離）。
3. 漿膜和關節的滲出液利用無菌的棉花棒、tip 或玻璃注射筒採取。
  　B. 培養和觀察：
1. 將含有培養液的試管，置於 37℃ 培養。
2. 每天檢查各試管內之培養液的顏色變化。有發育時則培養基的顏色會變黃，上半部有微弱的乳蛋白色及很少的沉澱物。
3. 取一滴有感覺 M. hyorhinis 發育的培養液滴入固體培養基上，置於 37℃ 含有 5~10% CO2 下培養，並繼續繼代。
4. 經過 2~4 天後，固體培養基上就可以看見典型的「荷包蛋」菌落。
5. 依菌落之形態學特性作生物化學活性的測定和血清學的同定。
6. 分離同定可用生長抑制試驗、代謝抑制試驗或免疫螢光法的其中任何一種。
  (三) Mycoplasma hyosynoviae 之分離
  　　Mycoplasma hyosynoviae 是引起肥育期、肥育後期和剛成熟豬之急性多發性關節炎的病因。本菌存在於豬的扁桃和咽喉的分泌物內極為普遍，有時候也可以由肺炎的肺臟中分離到。其在關節炎的關節液內不會長期存在，只能在跛腳出現後的一週內才可以分離到。
  　　一般檢查本菌之存在，是採取鼻腔或下呼吸道分泌物、肺臟均質化的懸浮液、有膜病變的滲出液、或關節液作分離。最常分離到本菌的途徑是來自於哺乳豬、肥育期和肥育後期豬的鼻腔分泌物，但是在成熟豬的鼻腔分泌物內，其分離率會下降到 10% 以下。在漿膜和關節的病例上，於急性期和亞急性期之期間都可以很容分離到本菌。
  　A.採材：
1. 關節炎是經由打開的關節內，用無菌的棉花棒採取，或在腫脹關節的皮膚表面，經消毒無菌後，用含有針頭的玻璃注射筒採取。
2. 鼻腔分泌物用無菌之棉花棒採取。咽喉分泌物採取是併用開口器，以棉花棒在扁桃表面擦拭。
3. 採取扁桃、淋巴結、肺臟、或其他組織，以液體培養作均質化懸浮液並稀釋。
  　B. 培養和觀察：
1. 將各稀釋之培養液置於 37℃ 培養。
2. 每天檢查各試管內培養液的顏色變化。有發育時會產生微細的顆粒散佈於培養基內，並有顆粒沉澱物。。
3. 繼代後，一旦有發育會很明顯，其它的微生物則會死亡。
4. 取一滴液體培養液滴於固體培養基上，置於 37℃ 含 5~10% CO2 之厭氧培養，於 2~4 天後可見到典型的「荷包蛋」菌落。
5. 利用菌落形態，生物化學活性，和免疫螢光法，生長抑制試管或代謝抑制試驗作同定。
6.1. 3.3. 討論事項：
 
( 一 ) 利用於分離的培養基至今已經發展出很多，其中的成分大都變化不大，全視各研究者於實驗室內作分離培養時所採用的習慣而定。
( 二 ) 用非選擇性培養基分離時，如果有 M. hyorhinis 存在，在幾天內就會發育，而用選擇性液體培養基（或非選擇性培養基）分離 M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 時，則其發育會較慢。一般最快在培養後第三天才可看到培養液變成黃色，不然則須一直觀察至第 28 天。
( 三 ) 有顏色改變的培養液，初次繼代後，M. hyopneumoniae 在 24 小時內將不會看到有發育，而 M. hyorhinis 則就會。
( 四 ) M. hyoneumonuae 的初次繼代培養發育會較慢，必須經 3~10 次的繼代後，才會在 24 ~48 小時內使培養液顏色改變。
( 五 ) 用選擇性培養基分離 M. hyopneumoniae 時，稀釋倍數越高所分離出的 M. hyopneumoniae 就越純。
( 六 ) M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 在固體培養基上的菌落，不是典型的「荷包蛋」形態，且菌落不會滲入培養基內。
( 七 ) M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 用固體培養基培養，生長效率不是很好。在同樣的稀釋倍數接種下，其生長力價並不如液體培養基有那麼高的生長力價。
( 八 ) M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 以 glucose 作代謝性抑制試驗時，將會沒有結果。因為二種徽漿菌皆可在含有 glucose 的培養基內發育而產生酸。
( 九 ) 上述四種徽漿菌發育時需要固醇類，M. hyopneumoniae，M. flocculare，M. hyorhinis 不會水解精氨酸和尿素，而 M. hyosynoviae 則會水解精氨酸，不會水解尿素。
( 十 ) M. hyopneumoniae 和 M. flocculare 以 Giemsa 染色時，菌落呈細小而有兩極，戒指環狀等。
(十一) 新鮮的肺臟組織使用免疫螢光冷凍切片法檢測 M. hyopneumoniae 時，於呼吸道的上皮表面雖然可見到黴漿菌，而且快速，但是其敏感性比用培養的方法較不敏感。
6.1. 4. 各種徽漿菌的分離與同定
6.2.
端螺旋體菌（Leptospira）檢查法 蔡向榮
6.2. 1. 採取尿液直接在暗視野顯微鏡下檢查 ， 此診斷方法必需有相當的經驗才能鑑別菌種 ， 表1所列為端螺旋體與包柔氏疏螺體（Borrelia）及密螺旋體（Treponema）的一些鑑別方法 。由於本菌發生自體溶解很快，因此應在尿液標本中加入福馬林以保持菌體。
  表1 Borrelia，Treponema 及 Leptospira 之鑑別
特　徵 Borrelia Treponema Leptospira
長　度 8-16μm 5-18μm 6-20μm
寬　度 0.25-0.3μm 0.25-0.3μm 0.1-0.2μm
尾　端 有細端絲
(terminal filaments)		 圓形端，可能有端絲 一端或兩端呈半圓形狀
螺　旋 4-8 個，稀疏幅度 3μm 6-14 個，規律，有角度幅度 1μm 很多，細，緊密幅度 0.4-0.5μm
活動性 軟木塞起子狀 迴轉，波浪狀起伏 旋轉，波浪狀起伏
培　養 易，厭氣性 稍困難，嗜氧及兼性厭氣性 易，嗜氧
染色： Gram
  Giemsa
  鍍　銀
可
可
不可
不可
不佳
可
淡
不佳
可
6.2. 2. 血清學試驗：
 
1. 配對血清有抗體力價 4 倍之上升。
2. 平板篩選試驗，如陽性，進一步做平板稀釋試驗。
3. 平板稀釋試驗：如果為 64-128 倍判定為疑陽性，需再做顯微鏡凝集試驗（凝集性溶解 agglutination lysis），如果抗體為 300 倍及以上則認為有診斷意義，但最好還是有配對血清中抗體力價上升 4 倍及以上之証明。但並非所有端螺旋體症病例有高之血清抗體力價。
6.2. 3. 分離與培養及鑑定：
 
1. 病材：血液（僅限高熱期）、尿液、腦脊髓液、腎臟、流產胎兒之胃液或肝臟。
2. 培養基（液體）：Tryptose phosphate broth。
3. 抑制雜菌 ：常在培養基中添加 5-fluorouracil (100-300μq/mL) 或者以過濾的方法 (0.45 μm) 去除雜菌。
4. 接種上述培養基後在 30℃ 培養； 在半固體培養基如 Fletcher 氏培養基，(Difco) 菌體常會集中在液面下半公分處形成圓盤狀區域。
6.2. 4. 天竺鼠或田鼠之接種：病材如血，尿或組織，接種後動物產生菌血症，可以其血液在培養基上進行分離與培養。
6.2. 5. 組織病理學：在腎之切片以特殊染色可能可見到鉤端螺旋體菌。
6.2. 6.螢光抗體法：可以螢光抗體法在組織或尿液中証明菌體之存在。
   
6.3.
披衣菌（Chlamydia）檢查法 蔡向榮
6.3. 1.染色方法
 
1. 塗抹片製備
  下列病材之準備
(1) 體液或分泌物：以一滴直接塗抹在玻片上之小區域。
(2) 組織：切小塊後，以切面在玻片上做數個捺壓抹片。
(3) 卵黃囊：卵黃囊膜先以食鹽水洗去多餘之卵黃物質，在濾紙上吸乾後，剪下小塊後 以攝子夾取在玻片上做數個捺壓塗抹片。
2. 染色方法
 
(1) Gimenez 染色法
  a. 材料：
(a) 石碳酸鹼性復紅 (原液)
 
鹼性復紅 (Basic fuchsin) 溶於 95﹪酒精 100 ml
(10% w/v)    
水性石碳酸 (4% v/v) 250 ml
蒸餾水 650 ml
  　　　-------------
　　 　 　1 l
使用前 48 小時需置於 37℃
(b) 磷酸鈉緩衝液 (0.1M，pH 7.45)
 
NaH2PO4　　　　　　　0.2M 3.5 ml
Na2HPO4　　　　　　　0.2M 15.5 ml
蒸餾水 19.0 ml
  　　　-------------
　　 　38　ml
(c) 鹼性復紅液
 
鹼性復紅原液 (a) 4 ml
磷酸鈉緩衝液 (b) 10 ml
在使用前才混合並以濾紙過濾。
(d) 孔雀綠草酸鹽（Malachite green oxalate） 0.8﹪ w/v
  b. 方法
(a) 將組織在玻片上做薄薄的一層捺壓塗抹片。
(b) 乾燥，並稍加熱固定以不活化病原。
(c) 以鹼性復紅液侵蓋 5 分鐘。
(d) 以溫的蒸餾水浸洗。
(e) 以 0.8% 孔雀綠草酸鹽做複染色 20 秒。
(f) 洗滌及再複染色 20 秒
(g) 洗滌及以濾紙將玻片吸乾。
(h) 在油鏡下檢查，在細胞內及細胞外之披衣菌基體 (Chlamydial elementary bodies) 染為紅色，背景物質則染為綠色。
(2) 變法 Macchiavello 氏染色
  a. 染色液
 
鹼性復紅 0.5g 溶於 200ml 蒸餾水
檸檬酸 0.5g 溶於 200ml 蒸餾水
甲基藍 0.5g 溶於 200ml 蒸餾水
  b. 方法
(a) 塗抹片風乾後，稍加熱固定。
(b) 以濾紙濾過之鹼性復紅染色 5 分鐘。
(c) 水洗後以檸檬酸 15 秒鐘脫色。
(d) 水洗後以濾紙吸乾。
(e) 油鏡下檢查，單獨或成堆存在之基體染成紅色，如過度染色基體將呈為藍色。
(f) 洗滌及以濾紙將玻片吸乾。
(g) 在油鏡下檢查，在細胞內及細胞外之披衣菌基體（Chlamydial elementary bodies）染為紅色，背景物質則染為綠色。
(3) Castaneda 氏染色
  a. 染色液
(a) Weiss mordant 溶液
 
福馬林 100 ml
冰醋酸 7.5 ml
(b) Formol blue 液
M/15 磷酸鹽緩衝液，pH 7.0 180 ml
Azure II 或 Unna's blue 20 ml
(1﹪溶於甲醇)    
福馬林 10 ml
(c) 番紅 (Safranin) 0.25% 水溶液
  b. 方法
(a) 塗抹片風乾後，以 Weiss mordant 溶液固定 2 分鐘。
(b) 充分水洗。
(c) 以 formol blue 染色 10-70 分鐘。
(d) 充分水洗。
(e) 以番紅液複染色。
(f) 充分水洗。
(g) 油鏡下檢查，基體染成藍色，細胞物質則為紅色。
(4) Giemsa 染色
  a. 染色液
(a) 原液
  0.3g Giemsa 粉末添加 25ml 甘油，及 25ml 絕對甲醇（不含丙酮者）。
(b) 染色液
  原液如未全溶，需以濾紙過濾，使用時以蒸餾水 10 倍稀釋。
  b. 方法
(a) 塗抹片在甲醇固定 3-5 分鐘。
(b) 風乾。
(c) 以染色液浸蓋 20-30 分鐘，如有需要可延長至 1 小時或以上。
(d) 以蒸餾水洗滌。
(e) 豎起玻片，風乾。
(f) 油鏡檢查，基體呈紫色，但有時不易與細胞或背景染色區別。
6.3.2. 分離與培養
 
1. 病材種類
 
(1) 血液：將凝固之血塊以組織培養液或 Bovarnick 氏液在研缽內研磨。
(2) 其他體液及分泌物：不稀釋，分泌物粘稠時可如血液般處理。
(3) 糞便：以組織培養液或 Bovarnick 氏液製成 10% 懸浮液，研磨後在 2000 × g 遠心去除沈渣，取上層液。
(4) 組織：以剪刀剪碎，研磨後以充份之緩衝液製成 10% 懸浮液，2000 × g 遠心去除沈渣，取上層液。
2. 污染之去除方法
 
(1) 抗生素處理：500μg/ml 鏈黴素，75μg/ml Vancomyin，50μg/ml 僅大黴素，500μ/ml mycostatin。
(2) 選擇性濾過法。
(3) 分離式遠心法。
a. 在 2000 × g 遠心 15 至 30 分鐘。
b. 由液面吸取 5 ml上層液（小心勿擾動分層）
c. 反覆 a 及 b 步驟 2 次。
d.

第 3 次遠心後由液面吸取少許上層液，如要接種雞胚胎則再製成 10 倍稀釋液。