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(一)

病名及病原

 1.病名：牛瘟 (Rinderpest)

2.病原：係由副黏液病毒科 (Paramyxoviridae) 之 Morbillivirus 感染引起的牛與水牛之傳染病。

  (二)

疾病簡介

 　　牛瘟係由病毒引起偶蹄類之急性、熱性、接觸傳染的疾病，主要感染牛與水牛，其次為綿羊、山羊及其他反芻獸動物，本病為牛隻疾病中傳染性最劇烈死亡率最高之疾病，感染牛隻以消化道及其他粘膜之發炎和壞死以及高熱為其特徵。歐洲及北美洲原產的豬感染後僅出現一過性的熱反應，往往為不顯性感染，成為帶毒的傳染源，遠東原產的豬種其感受性較高。本病毒僅有一種血清型，但不同分離株的毒力有強弱之差異，本病毒大小約 300 nm，免疫學上與麻疹及犬瘟熱病毒有相似的抗原性。本病毒遇強酸強鹼立即被破壞，對消毒藥之抵抗性弱。 　　

本病為亞洲及非洲的地方性疾病，18~19 世紀時歐洲曾全面嚴重流行，1920 年在比利時發現最後病例，目前歐洲及美洲已無本病的污染。非洲則仍屢見發生。本省在民國 38 年由海南島輸入豬而引起牛瘟，但於翌年即撲滅。 　　

本病的傳播係直接與病畜接觸或與病畜的排泄物分泌物接觸而感染。感染病畜在未出現症狀前，在血液及分泌液內即有病毒出現，因此屠宰場常是本病的污染地方。恢復的病畜獲得高度的免疫性，血清中出現高力價的抗體，恢復病畜是否帶毒尚不清楚。  

(三)典型之臨床症狀及病理變化 　　

一般潛伏期為 3 至 10 天，但在疫區則較長些，人工感染時的潛伏期最短為 40 小時。主要症狀為高熱 40~41.5 ℃，持續 3~4 日，然後急速下降至常溫以下，體溫急速下降後 1~2 日內斃死。發熱後經 1~2 日病牛高度倦怠，被毛逆立，流淚，水樣鼻液，結膜、鼻粘膜及口腔粘膜充血，繼之排粘液性或濃樣性鼻液，粘液性眼淚及眼膩、眼瞼腫脹，齒齦口腔粘膜瀰漫性潰瘍。食慾反芻廢絕，但一直飲水，糞便初硬，末期水瀉，混有粘液血液偽膜及惡臭等。 　　

解剖病變主要位於下嘴唇的內面、牙齦、舌及軟口蓋等處發現糜爛病變。淋巴節水腫，膽囊腫脹，腸管的集淋小結 (Peyer's Patches) 呈現急性炎症，糜爛，嚴重出血及壞死。皺胃黏膜出血，盲腸，迴盲瓣及直腸的黏膜常有出血及糜爛。直腸尾端的黏膜常有斑馬條紋的出血。 　　牛痘病毒喜歡侵犯脾、淋巴結及集淋小結等淋巴組織，其鏡下淋巴濾胞，尤其生發中心之淋巴球嚴重變性壞死；成熟淋巴球消失，有的被漿細胞，巨噬細胞或有時嗜中性球及纖維性基質所取代。消化道和上呼吸道之粘膜上皮細胞的變性、壞死及出血很顯著，病變處之感染細胞有細胞質內和核內嗜酸性包涵體。  (四)

應採病材

 　　以最終濃度 10IU/ml 之 Heparin 或 0.5mg/ml 之 EDTA 抗凝劑，採取病畜之抗凝血液。急性期病畜眼或鼻之分泌物。剖檢時應採取肩胛淋巴、腸間淋巴及脾臟供抗原檢測。急性期及二星期以後恢復期之配對血清供抗體分析。病材及血液等須冷藏輸送。  

(五)綜合診斷 　　

依據疫情即發病率及死亡率，臨床症狀及解剖病變可做初步的診斷，但最後確診應靠實驗室的診斷。

1.牛瘟病毒的分離與鑑定

 抗凝血以 2,500g 離心 15 分鐘，抽取白血球層，加入生理食鹽水混合清洗後再離心之，沉澱之白血球以 MEM 維持液倍數稀釋後，接種於已形成單層細胞之初代牛腎細胞或 VERO 細胞，觀察其產生細胞變性效應之情形，如有牛瘟病毒存在則感染細胞會融合而產生細胞變性效應。病畜淋巴及脾臟等病材製成十倍乳劑，3,000rpm 離心 30 分鍾去除雜質，上清液接種於已形成單層細胞之初代牛腎細胞或 VERO 細胞，觀察其產生細胞變性效應之情形。

(1)電子顯微鏡檢測： 

上述產生細胞變性效果之接種上清液或病材十倍乳劑，3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，再以氣動式離心機 90,000rpm 超高速離心 10 分鍾，取沉澱物經 PTA 負染色，以電子顯微鏡檢查有無副粘液病毒屬之牛瘟病毒顆粒。

(2)血清中和試驗檢測： 

將分離的病毒進行十倍序列稀釋後，加入牛瘟標準血清，施行中和試驗，以標準血清中和的病毒力價和未加血清的病毒力價比較，以瞭解病毒是否被標準血清中和，而判定分離的病毒是否為牛瘟病毒。

(3)免疫過氧化酵素染色： 

將接種病材或病毒的細胞以過氧化酵素 (immunoperoxidase) 染色，如被染色上則為牛瘟病毒陽性。(4)聚合鏈反應檢測： 病材乳劑或接種病毒的上清液，先萃取核酸，其方法為：取 100μl 病材乳劑或接種病毒的上清液置於 1.5ml 微量管中，如 0.6ml GTC 緩衝液，再加入 70μl 的 3M 醋酸鈉，0.6ml 水飽和酚及 0.2ml 的 Chloroform-isoamylalcohol 溶液，震盪 60 秒，隨即冰浴 15 分鐘，以 4℃ 14,000rpm 離心 20 分鐘，將水層轉置於另一微量管中，加入等量異丙醇，放入 -20℃ 冰櫃，冷凍 1 小時，再以上述條件離心，去上層液，加入 60% 酒精，以 4℃ 14,000rpm 雜心 15 分鐘後，抽去上層液，經抽氣乾燥，加入處理過之水再溶解，即完成核酸萃取。萃取好之核酸與牛瘟引動子、反轉錄先進行反轉錄作用，再加入聚合進行聚合鏈反應，其條件為：94℃ 變性 30 秒，40℃ 煉合 60 秒，72℃ 延展 60 秒，進行 30 個循環。聚合鏈反應產物再以膠體電泳分析，有無牛瘟病毒核酸。

2.免疫學的診斷

(1)凝膠沉降反應試驗 (AGID)：

 將牛痘病毒接種初代牛腎細胞或 VERO 細胞後，濃縮成 AGID 抗原。O.9%Agarose 溶於生理食鹽水 ( 含 0.85%NaCl 和 0.05%NaN₃ 的水溶液 pH=7.2)，經煮沸溶解成 AGID 試驗用凝膠。操作方法是以中央一孔置抗原 ( 直徑 4mm)，周圍 6 孔置待檢測之血清 ( 距中央孔 6mm)。在 37℃ 潮濕恆溫箱中作用 24 小時後判定之，若有抗原－抗體凝集反應發生，就會有白色沉降線在抗原孔與血清孔之間產生。

(2)中和試驗： 

中和試驗之前須準備一批檢測用牛瘟病毒，測定其病毒力價，然後分裝小瓶保存於 -80℃ 備用。待每次中和試驗時取出稀釋使用。被檢測的血清必須經 56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘非化，以去除非特異反應因子。取被檢血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM)0.05ml 混合在 96 孔培養盤上做兩倍序列稀釋，每一序列稀釋最少做二個重復，然後加入 0.05ml( 含 200TCID) 的病毒液，經震燙混合均勻後，產 37℃ 5% CO₂ 之恆溫箱進行感作 1 小時。經感作後加入 0.lml 含 3×l0⁵ 個細胞的牛初代腎細胞或 VERO 細胞之細胞懸浮液，震盪混合均勻，再以透明膠帶黏封置 37℃ 恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後，以形成單層細胞但未產生細胞變性效應的最高稀釋倍數，換算為血清中和抗體力價。其抗體力價大於或等於 2 倍為牛瘟抗體陽性。但是，經牛瘟疫苗免疫之牛隻其抗體也為陽性。

(3)病牛配對血清以牛瘟病毒進行中和抗體檢測，分析其是否產生牛瘟中和抗體，如為陽性則為牛瘟感染。

(4)酵素免疫吸附法： 目前世界上已有牛瘟的酵素免疫吸附法診斷套組供應，使用時依其說明書上的方法進行即可。

(六)確診依據 　　

依據疫情即發病率及死亡率，臨床症狀、解剖病變、病原的分離與鑑定是確診依據。  

(七)參考文獻 

1.獸醫實驗室檢查法手冊 (1977) 台灣省家畜衛生試驗所編印台北縣 pp.461-463。

2.林榮培 (1987) 外來惡性家畜傳染病診斷手冊. 台潛省政府農林廳印行. 南投縣 pp.7-8。

3.吳永惠 (1989) 牛病學藝軒書局 台北市 pp.1-5。

4.Rinderpest. OIE Manual(1992)Pp.228-38。

5.Rossiter P.B. and Jessett D.M.(1992)Mid Rossiter P.B. (1986) Manual on the assay of rinderpest virus and neutralizing antibody. Res. Vet﹒Sci.,32,253-256﹒

6.Scott G.R., Taylor W.P. and Rossiter P.B.(1986) Manual on the diagnosis of rinderpest. FAO Animal Production and Health Series, No. 23,pp.1-187.

7.Taylor W.P. and Rowe L.W.(1984)A microneutralisation test for detection of rinderpest virus antibodies. Res. Vet. SciSci., 37, 155-159.