六、牛病毒性下痢、粘膜病
- 內容
(一)病名及病原
1.病名：牛病毒性下痢、粘膜病 (Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease ; BVD－MD)
2.病原：係由黃病毒科 (Flaviridae) 之瘟疫病毒屬 (Pestivirus)所引起的一種傳染病，取英文字頭簡稱 BVD－MD( 牛病毒性下痢、粘膜病 )。同樣的痛而有不同的症狀，在症狀輕微時稱牛病毒性下痢，而重症時稱粘膜病 ( 以粘膜病鏈為主徵 )，發生如此差異的原因主要是，由於牛隻受病毒之細胞病變株與無細胞病變株單獨或重複感染所致。
(二)疾病簡介
本病在各國均有發生，牛群有極高的抗體陽性率，感染極為普遍，在冬季至春季發生較多。1970 年代有許多有關之下痢，粘膜病，先天性異常仔牛及死流產之病例報告，並分離到細胞病變株 (CPE 株 ) 病毒，至 1980 年代發現免疫寬容 (Immunological tolerance) 牛隻之高陽性率存在，這些免疫寬容牛係在胎齡 90-150 天被細胞非病原性 (Non-CPE) 之 BVD－MD 病毒感染之後，變成免疫寬容仔牛，出生後仍會持續感染，如這持續感染牛在被細胞病原性 (CPE+) 之 BVD-MD 病毒再度感染即會發生粘膜病，1977 年在台灣調查本病之陽性率即有 38.4%；但真正粘膜病仍罕見，而以疑似下痢病例為多。
(三)典型之臨床症狀及病理變化
仔牛出生後感染大部份呈不顯性感染，但有些幼齡牛則病情較為嚴重，有發熱、精神及食慾不佳、流涎、流淚、白血球減少，約數日後就恢復，泌乳牛則乳量降低。有些牛會引起眼屎、流鼻液或引起糜爛性口炎。
懷孕胎牛在胎齡 100 日齡前感染到病毒會變成免疫寬容牛，病毒在體內持續感染，因此出生後可在仔牛臟器及血液中均能分離到病毒，仔牛之致死率約為 50%，有些仔牛會發育不良，有些會正常發育並排出多量的痛毒，這些牛如再由細胞病變性毒株 (CPE＋ 株 ) 感染就發生粘膜病，症狀有發熱、食慾不振、下痢、鼻漏、口內糜爛，引起肺炎及脫水等，病重者數日後就死亡，一般病程約 1-3 週甚至數個月之久。懷孕胎牛在 100-150 日胎於時被感染，會引起胎牛之小腦及視網膜形成不全，或是造成流產及木乃伊化。
粘膜病在口腔及消化道粘膜會引起糜爛、潰瘍，在組織病理學上有上皮之壞死並可見淋巴組織之嚴重破壞。先天性異常之仔牛可見幹細胞之破壞，小腦及網膜形成不佳。
(四)應採病材
病原分離可採集下痢牛隻發熱期的白血球層、糞便、鼻分泌液、或是剖檢牛隻的脾臟、腸管 Peyer's patches、淋巴結及流產胎兒之組織或胎液等病材。
(五)綜合診斷
1.牛病毒性下痢、粘膜病病毒之分離及同定
分離病毒用之感受性細胞可用胎牛睪丸初代細胞、胎牛腎臟細胞或是株化 MDBK 細胞，以 24 孔組織培養盤先行培養形成單局細胞，於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞，然後接種 0.2ml 乳劑上清液，放在 37℃ 5% CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。冉將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 3 次，然後加入含 2% 胎牛血清 ( 血清不含有抗牛病毒性下痢病毒抗體 ) 的細胞培養液 1ml 再送入 37℃ 5% CO2 的恆溫箱中培養，並觀察 2 至 7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生，必須再做 2 至 3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可供為它子頗微鏡檢測，或以標示抗體做診斷。
(1)電子頗微鏡檢測：
從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液，或是採集的糞便乳劑先以 3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，然後再以超高速離心 l0 分鐘 (90,000rpm 氣動式離心機 )。取出沉澱物經負染色後，以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。
(2)標示抗體診斷法：
取經牛病毒性下痢病毒高度免疫過的抗血清，分離血清中免疫球蛋白 (IgG)，再和螢光色素 (FITC) 或過氣化酵素 (Horseradish Peroxidase) 結合，做成標示抗體，而和組織細胞進行螢光抗體染色法 (FA) 或是酵素結合反應。 因為牛病毒性下痢病毒是單股核醣核酸 (ss RNA)，所以病毒核酸複製是在細胞質內。而進行標示抗體染色法時，會在質內有特異的標示抗體呈色或是有螢光產生。
(3)血清中和試驗檢測：
將分離的病毒株進行 10 倍序列連續稀釋後，加入抗牛病毒性下痢病毒的標準血清進行中和試驗，以血清中和的病毒力價和未加血清的病毒力價比較，以証實病毒是否受標準血清中和，而判定分離的痛毒是否為牛病毒性下痢病毒。
2.免疫學診斷方法
牛隻一旦受到牛病毒性下痢病毒感染後，其體內會產生抗病毒之特異性抗體，故檢測牛血清中是否有抗體可供診斷牛隻是否已感染病毒： 測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，測試其病毒力價，然後小分裝保存於 -80℃ 冰箱中，待每次作中和試驗時取出稀釋使用。受測試約血清必須先經非動化 ( 在 56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘 )，以去除非特異反應因子。取血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM) 0.05ml 混合在無菌平底培養接上做兩倍序列連續稀釋，並對每一個稀釋倍數做 4 個重覆，然後加入 0.05ml( 含 200TCID) 的病毒液，經震盪混合均勻後，再送入 37℃ 5% CO2 之恆溫箱進行感作 l 小時。經感作後加入 0.1ml 含 3×105 個細胞的細胞懸浮液，並震盪混合均勻，再以透明膠帶封住，置入恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後以形成單層細胞但未產生 CPE 的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 2 倍而判定為牛病毒性下痢抗體陽性。
3.病理學診斷
感染之牛隻病理學變化，在感染初期之牛隻有頗著的白血球缺乏症，然後牛隻在恢復階段的總白血球數才會回復到原來的水準。而死於牛病毒性下痢病毒感染的牛隻，通常其外觀呈瘦弱、被毛粗剛，嚴重下痢及脫水，且有貧血現象。 通常在剖檢病牛的口、食道及小腸內有潰瘍病灶，小腸內有出血壞死或是淋巴聚集的現象。食道的潰瘍呈典型的直線平行排列狀，此外在瘤胃或皺胃也可見到明顯的潰瘍病灶。 而冷凍切片的螢光抗體染色法或是過氧化酵素染色法作診斷時，必須採取新鮮病材予以急速冷凍，並予以切片後以標示抗體染色檢查有無特異的螢光或色質反應。所採取臟器可選擇脾臟、淋巴結、肺臟、肝臟、消化道上皮或是其它有病灶之處。
(六)確診依據
目前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主，尤其牛隻在呈現體溫上升及流鼻液或下痢時的病毒分離率較高。對於牛病毒性下痢的快速診斷，可用冷凍切片的螢光抗體染色法或是過氧化酵素染色法作診斷。而發病牛群的配對血清中和抗體反應也可為診斷依據。
(七)參考文獻
1.Baker J. C. (1987) Bovine viral diarrhea virus：A review. J Am. Vet. Med. Assoc., 190：1449-1458.
2.Bolin S.R., McClurkin A.W., Cutlip R.C. and Coria M.F. (1985) Severe clinical disease induced in cattle persistently infected with noncytopathic bovine viral diarrhea virus by superinfection with cytopathic bovine viral diarrhea virus. Am. J. Vet. Res., 39：241-244.
3.Donis R.O. and Dubovi E.J. (1987) Molecular specificity of the antibody responses of cattle naturally and experimentally infected with cytopathic and nocytopathic bovine viral diarrhea virus biotypes. Am. J. Vet. Res. 48：1549-1554.
4.Duffell S.J. and Harkness J.W. (1985) Bovine virus diarrhea-mucosal disease infection in cattle Vet. Rec., 117：240-245.
5.Perdrizet J.A., Rebhum W.C., Dubovi F.J. and Donis R.A. (1987) Bovine virus diarrhea-Clinival syndromes in dairy herds. Cornell Vet., 77：46-74.
6.Timoney J. F., Gillespie J. H., Fredic W. S. and Barlough J.E. (1988) Parainfluenza 3 virus infection in cattle. In：Hagan and Bruner's Microbiology and Infectious Disease of Domestic Animals, 8th Eds. pp. 818-822.