(一)病名及病原

1.病名：牛傳染性鼻氣管炎 (Infectious bovine rhinotracheitis；IBR)

2.病原：本病係由第一型疱疹病毒所引起的急性熱性傳染病。  

(二)疾病簡介

 　　牛傳染性鼻氣管炎常引發牛上呼吸道疾病及氣管粘膜之炎症，以呼吸困難及流鼻汁等為主要症狀，再由於病毒之感染部位不同而發生腔炎、龜頭炎等性病或結膜炎、流產、乳房炎及小牛之非化膿性腦膜腦炎等多種症狀之疾病，因本病毒具有持續感染之特性，故為備受世界各國重視之疾病。 　　

台灣於 1967 年 Otte 報告有疑似病例之發生，嗣后 1975 年林敬覆等在竹南鎮發現聖達肉牛病例及分離到病毒，至 1985 年筆者等發現由本病毒引起之小牛非化腺性腦脊髓炎及潰瘍性口炎，至 1986 年在高雄縣初次爆發本病，10 個酪農戶 1383 頭乳牛共有 156 頭發病，發病率平均為 1.2%，乃 179 頭犢牛中發生本病者 l11 頭 (62.0%)、死亡 76 頭 (68.4%)，至 1987 年再因進口牛引發本病之全面性大流行，即台北、南投、雲林、台南、高雄、屏東、台東等地區共有 80 戶和 1,491 頭發生，死亡頭數為 121 頭 (8.12%)、流產 54 頭 (3.12%)。造成農戶重大的損失。 

 (三)典型之臨床症狀及病理變化 　　

呼吸症狀為最常見之病型，眼型次之。體溫升高至 40-41℃，然後無精神、食慾消退、流淚、鼻孔流出粘液樣，以後變成膿性之鼻液，鼻粘膜高度潮紅，散發灰黃色膿皰性顆粒，乾酪樣偽膜，剝離後呈潰瘍，重症牛因上呼吸道及氣管由於漿液性纖維素性滲出物蓄積，致呼吸被阻礙，發生呼吸困難，可聽見粗厲之喘鳴音及聞及惡臭氣味。這些病牛大部分引起結膜炎、眼臉腫脹、眼結膜高度充血並有多量的流淚，嚴重病例在眼結膜形成灰黃色針頭大之顆粒，眼球白濁: 　　

泌尿生殖器型病症以母牛發生者比較多，女陰粘膜呈現暗紅色，充血及腫脹，可見灰黃色粟粒大之膿皰，膣內分泌多量之粘液膿樣之滲出物，病重者膣粘膜覆蓋著偽膜，排尿困難及疼痛，且有頻尿，公牛在陰莖、包皮等也其母牛出現同樣病變。除了上述症狀以外泌乳牛之乳量減少，小牛多呈非化膿性腦膜腦炎及懷孕牛之死流產等也為常見之症狀。 　　

鼻粘膜呈現鬱血、充出血，有時形成膿皰性顆粒、鼻鏡乾燥有時痂皮形成後脫皮變成紅鼻子，在鼻腔以外，副鼻竇、咽喉及氣管呈水腫、點狀出血、漿液性或膿性滲出物增加，嚴重病例氣管粘膜上皮變性壞死、糜爛、乾酪樣偽膜之形成。 　　

肺病變:肺胸膜附著纖維素 ( 纖維素性胸膜炎 )、胸水貯留，肺退縮不全，偶有氣腫和支氣管性肺炎，在感染初期之呼吸道粘膜、流產胎兒之肝細胞可見核內包涵體。在中樞神經系統可見腦膜腦炎病變、神經膠質細胞內可見嗜酸性核內包涵體。  

(四)

應採病材

 　　在臨床上發現有流鼻汁與眼分泌物增加等類似 IBR 之病例，立即以無菌棉花棒採集鼻液及眼結膜分泌物，並且將棉花拭子 (Swabs) 保存於含 500IU/ml 青黴素，500mg/ml 鏈黴素及適量殺黴茵素 (Fungizone) 的細胞培養液中，在接近冰點的溫度下運送到實驗室。然後取出棉球擠乾製成乳劑，以 4℃ 3,000rpm 離心 30 分鐘，再取出上清液供病毒分離之用。對可能因 IBR 感染致死或流產之病例；則加採各臟器以前述之細胞培養液製成 10 倍乳劑，袖經離心取出上清液，然後進行病毒分離。  

(五)綜合診斷 

1.	牛傳染性鼻氣管炎病毒之分離及同定
	分離病毒用之感受性細胞可用胎牛睪丸初代細胞、胎牛腎臟細胞或是株化 MDBK 細胞及株化 BEK 細胞，以 24 孔組織培養盤先行培養形成單層細胞，於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞，然後接種 0.2ml 乳劑上清液，放在 37℃ 5% CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。再將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 3 次，然後加入含 2% 胎牛血清 ( 血清不含有抗 IBR 病毒抗體 ) 的細胞培養液 lml 再送入 37℃，5% CO2 的恆溫箱中培養，並觀察 2-7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生。必須再做 2-3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可供為它子頗微鏡檢測，或以標示抗體做診斷。
	(1) 電子顯微鏡檢測：   從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液，或是採集的鼻汁，先以 3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，然後再以超高速離心 10 分鐘 (90,000rpm 氣動式離心機 )。取出沉澱物經負染色後，以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。 (2) 標示抗體診斷法：   取經 IBR 病毒高度免疫過的抗血清，分離血清中免疫球蛋白 (IgG)，再和螢光色素 (FITC) 或過氧化酵素 (Horseradish Peroxidase) 結合，做成標示抗體，而和組織細胞進行螢光抗體染色法 (FA) 或是酵素結合反應。因為 IBR 病毒是雙股去氧核醣核酸 (ds DNA)，所以病毒核酸複製是在細胞核內。而進行標示抗體染色法時，含在核內有特異的標示抗體呈色或是有螢光產生。 (3) 血清中和試驗檢測：   將分離的病毒株進行 10 序列連續稀釋後，加入抗牛傳染性鼻氣管炎病毒的標準血清進行中和試驗，以血清中和的病毒力價和未加血清的病毒力價比較，以証實病毒是否受標準血清中和，而判定分離的痛毒是否為牛傳染性鼻氣管炎病毒。
2.	免疫學的診斷
	牛隻一旦受到 IBR 病毒感染後，其體內會產生抗病毒之特異性抗體，故檢測牛血清中是否有抗體就可以診斷牛隻是否已感染病毒。介紹下列三種方法供檢測 IBR 抗體
	(1) 凝膠沉降反應試驗 (Agar Gel Precipitation;AGP):   該抗原的製備，是先將 IBR 病毒以 MDBK 細胞增殖，在細胞病變達 80% 時將細胞刮下收集到離心管，經 3,000rpm，離心 10 分鐘後去除上清液，然後加入 5 倍體積量之Trypsin-Versene 液，先經超音波處理 2 分鐘 ( 在冰浴中 )，然後在 37℃ 水浴槽內攪拌 3 小時。將此懸浮液以 20,000rpm 離心 l 小時，取出上清液再加入 0.5% 福馬林液在 37℃ 作用 3 小時後，再經 3,000rpm 離心 10 分鐘的上清液即為 AGP 抗原，可小分裝保存於 -80℃ 冰箱中。 AGP 方法的進行是以 0.65% Agarose 溶於含 0.87% NaCl 和 0.05% NaN3 的 PH: 7.2 溶液中，經煮沸溶解製成 AGP 測試用的凝膠。操作方法是以中央一孔置抗原 ( 直徑 4mm)，周圍 6 孔置供檢血清 ( 距中央孔 6mm)。在 37℃ 潮濕恆溫箱作用 24 小時後判定，若有抗原－抗體凝集反應發生就會有白色沉降線在抗原孔和血清孔之間產生。 (2) 中和試驗：   測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，測試其病毒力價，然後小分裝保存於 -80℃ 冰箱中，待每次作中和試驗時取出稀釋使用。受測試約血清必須先經非動化 ( 在 56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘 )，以去除非特異反應因子。取血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM)0.05ml 混合在無菌平底培養盤上做兩倍序列連續稀釋，並對每一個稀釋倍數做 4 個重複，然後加入 0.05m1( 含 200TCID) 的病毒液，經震盪混合均勻後，再送入 37℃ 5% CO2 之恆溫箱進行感作 1 小時。經感作後加入 0.1m1 含 3×105 個細胞的細胞懸浮液，並震盪混合均勻，再以透明膠帶封住，置入恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後以形成單層細胞但未產生 CPE 的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 2 倍而判定為 lBR 抗體陽性。 (3) 血球凝集抑制法試驗 (Hemagglutination Inhibition test；HI)   IBR 病毒經證實可對 C57BL 株小黑鼠的紅血球有凝集性，因而可藉此特性進行血清學的 HI 力價測試，以證實有無抗 IBR 病毒的抗體，而可檢測出是否受 IBR 病毒感染。   該試驗所用之稀釋液是以 25%V/V 白陶土 (Kaolin) 泡製於 0.l5 NaCl(PH：9.0) 的溶液中，在 4℃ 經過夜攪拌後，再以 HCl 將 PH 值調到 PH：7.2，以此白陶土懸浮液和等量胎牛血清 (FCS) 混合在室溫下攪拌 20 分鐘，再以 3,000rpm 離心 30 分鐘，取出上清液以 0.45μm 濾膜過濾，即為 Kaolin 處理過的試驗用稀釋液 (KFCS)，將這 KFCS 以試管分裝後保存於 -2O℃ 冰箱。使用時將 KFCS 以 PBS 做 l00 倍稀釋，成為 l% PBS-KFCS，這溶液即為行 HA 和 HI 測試用的稀釋液，亦是配製老鼠紅血球懸浮液的溶液。   小老鼠紅血球懸浮液：以 Alsver 抗凝劑採血後，經過濾後以 PBS 洗 3 次，再以 l% PBS-KFCS 配製成 0.8% 紅血球懸浮液，以供 IBR 病毒的 HA 和 HI 測試用。IBR 病毒之 HA 測定是在 U 型底的微量滴定盤上先和稀釋液 (0.025ml) 做 2 倍序列連續稀釋，再加入 0.025ml 的 C57BL 老鼠紅血球懸浮液，經震盪混合均勻後靜置在室溫 2 小時後判定。以形成凝集現象的病毒最高稀釋倍數為 HA 力價。   牛血清在進行 HI 測試前除經過非化處理，尚須經等量的 0.lm l25% W/VKaolin-PBS 懸浮液在室溫連續震盪處理 l 小時，再以 3,000rpm 離心 20 分鐘。取出上清液 0.lml 再和以 l% PBS-KFCS 配製成的 50% 普通小白鼠紅血球懸浮液 0.1ml 以低迷震盪作用 l 小時 ( 避免紅血球破裂 )，再經 1,000rpm 離心 20 分鐘，所得到的上清液即為經過處理的 4 倍稀釋血清稀釋液。然後再取 0.025m1 做 2 倍序列連續稀釋，及加入含 4HA 單位的病毒液 0.025m1，經震燙均勻後在 37℃ 潮濕恆溫箱感作 1 小時之後才加入 0.8% C57BL 老鼠紅血球懸浮液 0.025ml，經震盪均勻靜置在室溫 2 小時後判定。以抑制病毒凝集血球的最高稀釋倍數足為 HI 力價。並以HI力價大於或等於 4 倍而判定為 IBR 抗體陽性。
3.	病理學診斷
	感染之牛隻病理學變化，在感染初期之呼吸道粘膜、肺臟的肺泡細胞及氣管粘膜上皮細胞的組織病理切片下，有時可以檢查到細胞核內的病毒包涵體。在中樞神經系統主要在腦有非化膿性腦膜腦炎病變、神經膠質細胞內可見嗜酸性校內包涵體。
	如果由於牛傳染性鼻氣管炎病毒造成母牛流產，檢查流產胎兒之肝細胞可見核內包涵體。

  (六)確診依據 　　

目前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主，尤其牛隻在呈現體溫上升及流鼻液時的病毒分離率較高。而發生牛群的中和抗體反應也可為診斷依據。 

 (七)參考文獻