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(一)病名及病原

1.病名：傳染性華氏囊病 (infectious bursal diease) 又稱甘保羅病或康保羅病 (Gumboro disease)

2.病原：係由傳染性華氏囊病毒 (infectious bursal disease virus) 所引起。  

(二)疾病簡介

 　　傳染性華氏囊病係由一種二截雙股 RNA 傳染性華氏囊病毒 (birnavirus) 所引起的雞隻傳染病。2-3 週齡以內雞隻感染本病時，多為不顯性感染，但剖檢時可見華氏囊萎縮，華氏囊細胞到遭到破壞，引起雞隻永久性免疫機能抑制。當 3-4 週齡以上雞隻感染本病時，常爆發急性感染，臨床上以突然發生 ，傳播快速，高死亡率，嚴重下痢、脫水、啄肛及發熱為主徵。時至今日，因本病毒造成感染雛雞之永久性免疫機能仰制，致使雞隻容易二次性感染其他病毒而引起的經濟損失更受重視。  

(三)典型之臨床症狀及病理變化 　　

本病臨床表現有兩型，一為無臨床症狀但可造成永久性免疫機能抑制。有臨床症狀顯現的傳染性華氏囊病多發生在 3-7 週齡雞隻。病毒感染後 2-3 天可見羽毛蓬鬆、精神沉鬱、嚴重下痢造成脫水和糞便沾黏肛門周圍繼而有啄肛現象。 　　

剖檢時可見肌肉，尤以胸肌、腿肌及翼肌顯著出血。腎臟腫大，尿酸鹽沉積而蒼白。脾臟腫大，感染初期華氏囊炎症反應嚴重顯現腫大，水腫甚至出血;後期則呈現萎縮。組織切片檢查可見淋巴瀘泡中淋巴細胞變性、壞死。淋巴瀘泡間隔水腫液堆積而加大。另有異嗜球浸潤。粘膜上皮增生，且有囊泡 (cyst) 形成，出血等病變。  

(四)應採病材

 　　病材應採華氏囊及脾臟，冷凍送至檢驗室或以冷藏方式於 24 小時內送抵檢驗室。  

(五)綜合診斷 

1.病原分離及同定

 　　送檢華氏囊或脾臟，加入PBS緩衝液，經研磨製備 10 倍乳劑。低速離心 (1000-2000rpm)10 分鐘，取上清液供病毒分溝。若因細菌污染嚴重，可於上清液中加入抗生素 ( 青黴素 200IU/ml，鏈黴素 200μg/ml) 或先將上清液以 0.45μ 過濾膜過濾。

(1)病毒分離：

 雞胚胎接種：以上述上清液 0.1ml 接種到 9-11 日齡 APF 雞胚胎蛋絨毛漿尿膜 (CAM) 上。一般經 3-5 天，引起胚胎死亡，胚胎病變包括腹部水腫脹大。皮下水腫可見出血點尤其在翼部，偶而在腦部及腳趾亦可見相同病變。肝臟可見壞死點、出血點。心臟蒼白，腎臟充血及壞死點，肺極度充血。脾臟腫大且有壞死點。CAM可見出血斑。該項方法最敏感，適用於一般診斷室快速診斷。 細胞接種：病材乳劑 0.1ml 接種雞源 B 細胞來源之株化細胞或雞胚胎纖維芽細胞、雞胚胎肝、腎細包及哺乳動物來源細胞株如 Vero 細胞及 BGM-70 細胞。觀察細胞病變效應如細胞顆粒化、細胞脫落等變化，也可將病材接種於初代雞胚胎華氏囊 B 細胞。其步驟如下：取 18-20 日齡雞胚胎華氏囊，置於 PBS 緩衝液，以剪刀剪碎後，再用鋏子分離華氏囊組織，使B細胞游離。接著以 1000rpm 低速離心。去上清液後，將細胞懸浮於 RPM11640 培養液。分裝約 2ml 於試管中並接種病材乳劑 0.1ml，以懸浮培養方式在 37℃ 中培養 2-3 天。

(2)病毒鑑定： 

因為 IBD 病毒能在雞胚胎或 B 細胞中增值，但不一定會在纖維芽細胞中增值。所以病毒鑑定方法，一般需配合燭光標示抗體染色或使用電子顯微鏡直接鏡檢病毒。 直接螢光標示抗體染色法：將供檢華氏囊病材製作冷凍切片，或將病材接種後 2-3 天之含單層細胞之蓋玻片上，或將懸浮培養 2-3 天之華氏囊細胞離心再將細胞塗抹於蓋玻片上。待乾後。將上述不同來源之組織或細胞先以丙酮固定 10 分鐘。取出玻片。待乾後再滴上螢光標示抗體於 37℃ 染色 40 分鐘。取出玻片以 PBS 緩衝液洗滌三次。待乾後滴上含 50% 甘油之 PBS 液，並覆蓋在載玻片上。以螢光顯微鏡鏡檢。若病材有 IBD 病毒感染，通常可在細胞質內見特異性螢光。 電子顯微鏡鏡檢：將華氏囊病材或經接種之胚胎做成乳劑，或接種細胞液先以 10000-115000rpm 高速離心一小時取上清液，受以 30000-35000rpm 離心 2 小時。吸取管底沉澱物。行負染色後以電子顯微鏡直接鏡檢病毒顆粒。或將上述病材先以 2%formaldehyde 於 4℃ 固定至少 2 小時，製作超微切片以電子顯微鏡觀察。病毒顆粒大小約 70nm，無封套，正二十面體。

2.血清學診斷

(1)β- 病毒中和試驗 ( 病毒量固定-待測血清不同稀釋倍數 )：

a.待測血清在 56℃ 經 30 分鐘非動化。

b.血清 0.05ml( 或 0.025ml) 置於 96 孔微量組織培養盤，再以等量 PBS 緩衝液或不含血清之MEM連續 2 倍稀釋。c.於每孔洞中加入每 ml 含 100-200TCID50 之病毒液 0.05ml(0.025ml)37℃ 感作 1 小時。d.取出測定盤，於每孔洞中加入 0.1ml(0.5ml) 的雞胚胎纖維芽母細胞懸浮。以透明膠帶加封後，培養於 37℃。e.培養 3 日後取出，倒掉培養液。以 95% 酒精固定細胞一分鐘。去固定液後，再以 1% 結晶紫酒精溶液染色一分鐘。f.待測定盤乾燥後判讀。 供病毒中和試驗毒株須是做本試驗所使用之細胞馴化株。另須先測定病毒力價 (TCID50/ml)，再先稀釋到所須之力價。用結晶紫染色因有 CPE 已死亡之細胞無法捕捉染色劑而無法被染色。判讀時以能抑制 50% 病毒增殖之血清最高稀釋倍數來表示中和抗體力價。此外，尚須同時作病毒對照組。先將 100-200TCID50 病毒液連續 10 倍稀釋。每個稀釋倍數至少滴入測定盤 4 個孔洞中，並加入細胞培養。結 100-200TCID50 之病毒液於 4 孔洞中需全部有 CPE 出現，而大於或等於 10² 稀釋液應只一孔洞或全部沒有 CPE 出現。

(2)免疫擴散法： 

此法操作簡便，但敏感度低且不易定量。

a.抗原製備：以強毒 1000CID50 口腔接種4週齡 SPF 雞隻，經 2-3 天後撲殺並取華氏囊以 PBS 緩衝液做成 10 倍乳劑，和標準血清作用測定其反應適當濃度後，稀釋保存於冷凍櫃中。

b.測定方法：將待測血清及抗原滴入 Agarose 膠體孔洞中，置於室溫溫 18-36 小時。判讀。在上述抗體一抗原孔洞間有無沉澱線產生。此間可以吸水之濾紙置於含膠體之培養皿，以防膠體乾裂。

3.病理學檢查： 　　

剖檢時可見肌肉尤以胸肌、腿肌及翼肌顯著出血。腎臟腫大，尿酸鹽沉積而蒼但；脾臟腫大，感染初期華氏囊炎病反應嚴重顯現腫大，水腫甚至出血；後期則呈現萎縮。組織切片檢查可見淋巴濾泡中淋巴細胞變性、壞死。淋巴濾泡間隔水腫液堆積而加大。另有異嗜球浸潤。粘膜上皮增生，且有囊泡 (cyst) 形成，出血等病變。  

(六)確診依據 　　

本病臨床病狀及病理學檢查 ( 尤以華氏囊病變 ) 結果應進一步和血清學反應及病毒分離同定之結果相配合，以確實診斷本病。惟以細胞分離本病毒相當困難。因此，可利用聚合脢連鎖反應或核酸探針直接測定病材中的病毒核酸；另外，也可利用酵素接合免疫吸附法 (ELISA) 替代血清中和試驗，一次測定的量血清樣品，節省時間。  

(七)參考文獻  

1.Cosgrove, A.S. 1962. An apparently new disease of chickens-avian nephrosis. Avian Dis., 6：385-389.

2.Cullen, G. A., and Wyeth, P. J. 1975. Quantitation of antibodies to infectious bursal disease.Vet.Rec.,97：315.

3.Dobos, P., Hill, B. J., Hallett, R., Kells, D. T., Becht, H., and Teninges, D.1979. Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double-stranded RNA genomes.J.Virol.,32：593-605.

4.Helmboldt, C. F., and Garner, E.1964. Experimental induced Gumboro disease(IBD).Avian Dis.,8：561-575.

5.Hitchner,S.B.1970.Infectivity of infectious bursal disease virus for embryonating eggs.Poult.Sci.,49：511-516.

6.Jackwood, D. H., Saif, Y. M., and Hughes, J. H. 1987. Replication of Infectious bursal disease virus in continuous cell line.Avian Dis.,31：370-375.

7.Lee, L. H.1992. Characterization of nonradioactive hybridization probes for detection infectious bursal disease virus. J. Virological Methods,38：81-92.

8.Lee, L. H., and Lin, Y. P. 1992. A monoclonal antibody capture enzyme-linked mimunosorbent assay for detecting antibodies to infectious bursal disease virus.J.Virological Methods,36：12-23.

9.Lee, L. H., Ting, L. J., Shien, J. H., and Shieh, H K.1994. Single-tube, noninterupted reverse transcritption-PCR for detection of infectious bursal disease virus.J.Clin,Microbiol.,32：1268-1272.

10.Lee, L. H., Ting, L. J., Shien, J. H., and Shieh, H. K.1994. Singletube, noninterupted reverse transcritption-PCR for detection of infectious bursal disease virus. J. Clin,Microbiol., 32:1268-1272.

11.Marquardt, W., Johnson, R. B., Odenwald, W. F., and Schlotthober, B. A. 1980. An indirect enzyme-linkde immunosorbent assay for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus.Avian Dis.,24：375-385.

12.McFerran,J.B.,McNulty,M.S.,McKillop,E.R.,Conner,T.J.,McCracken,R.M.,Collins, D.S., and Allan, G. M.1980. Isolation and serological studies with infectious bursal disease viruses from fowl, turkey, and duck:demonstration of a second serotype.Avian Path.,9：395-404.

13.Skeel, J. K., and Lukert, P.D.1980.Studies with an attenuated cell-cultured-adapted infectious bursal disease virus:Replication sites and persistence of the virus in specific-pathogenic-free chickens. Avian Dis.,24：43-47.

14.Skeel, J. K., Lukert. P. D., De Buysscher, E. V., Fletcher,SO.J.,and Brown,J.1979.Infectious bursal disease virus infection:I Complement and Virus-neutralizing antibody response following infection of susceptible chickens.Avian Dis., 23：95-106.