三十、馬立克病
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(一)病名及病原
1.病名：馬立克病，於 1907 年馬立克首次報告多發性神經炎，後為紀念他，而將本病命名為馬立克病。
2.病原：是由細胞依附性的疱疹病毒 (cell-assoc-iated herpervirus) 所引起有三種血清型，致癌性馬立克病毒 (onco-genic MDV) 為第一血清型，無致癌性馬立克病毒 (nononcogenic MDV) 為第二血清型，而火雞疱疹病毒 (HVT) 則為第三血清型。
(二)
疾病簡介
雞馬立克病為一種淋巴球無限制增殖的腫瘤，一旦有臨床症狀出現，雞隻色大多數只有死亡一途。本病的重要性在於它是藉空氣傳播，使感染率高，以及本病毒的持續感染，使得大部分的雞群幾乎隨時都可以分離到本病毒。不過，感染本病毒的雞不一定會發病。病毒由呼吸道進入體內，在肺部短暫發育後，即到淋巴臟器、諸如胸腺、脾、華氏囊等發育，造成部分傷害，隨後就有毒血症的產生，使病毒分部到全身，特別是皮膚的毛囊。從感染到病毒在毛囊出現，大致是十天左右，也就是說，雞感染馬立克病毒 (MDV) 後十天左右，就可再度由毛囊放出病毒，去傳播給其他的雞隻。雞隻經過如此病毒增殖期後，是否會進一步進入細胞增殖期，而致產生腫瘤發病死亡，則跟雞的品種，雞本身的抵抗力 ( 包括健康動況又免疫能力的強弱 ) 有關。抵抗力弱的雞，病毒增殖多，則會將雞體內的淋巴球改變成癌細胞，而進入細胞增殖期，而發病死亡，如雞的抵抗力強，則病毒在雞體內維持在低濃度，而不致於產生癌細胞，就不會有臨床症狀出現。
本省雞隻好發本病的雞齡有二階段，一在 10-15 週齡，另一階段在產蛋初期到產蛋高峰間，臨床上神經型、內臟型、皮膚型及眼型均有發生，其中以內臟型和神經型最常見。(三)典型之臨床症狀及病理變化
本病為病毒引起的淋巴腫瘤，在雞齡愈小感染病毒 (MDV) 則以後發病機率愈高，因腫瘤的形成需要好幾個禮拜，所以臨床症狀對出現都是漸進性的大致有所謂的神經型、內臟型、皮膚型及眼型等臨床表現，病雞可能出現其中一型或多型混合的症狀。
神經型初時有不對稱 ( 單側 ) 漸進性的痲痺，而最後致完全的痲痺，如翼下垂、腳一前一後站立不能，嗉囊脹大，頭頸扭曲等神經症動，因採食飲水的不方便，會致逐漸消瘦、精神不振、食慾減退、無毛雞冠肉垂等之蒼白萎縮、羽毛蓬鬆失去光澤，腳皮膚之皺縮失去光澤 ( 脫水 )，最後因為吃不到食物餓死或被其他健康的同伴踩死。 內臟型也是類似前述漸進行的症狀，可能神經症狀較不明顯，其餘臨床症狀表現大致似神經型，如肝和腸之淋巴腫瘤較嚴重，雞可能會有飼料便 ( 消化吸收不良 )。
皮膚型則有類似漸進性症狀之外，雞冠肉垂可能增厚變硬，全身皮膚觸摸時有大小不一的硬塊毛囊變大變硬。眼型則常是單眼瞎掉，以致常以正常的一邊向著接近的人。
病理變化
內眼病變神經腫大包括背部神經結、翼神經叢、坐骨神經叢，為較常見之部位，腫大的神經其橫紋消常顏色變灰黃色，有時看來水腫樣，腫大者有時可達正常神經之二、三個大，因其常見為單側性腫大，所以和另對側之相同神經比較，更易看出有無腫大。 內臟之淋巴腫瘤較常見到的臟器為腺骨、肝、脾、卵巢、心、肺、腎、睪丸、華氏囊、胸腺、胰、腸、毛囊、肌肉、眼球等，淋巴腫瘤可能為結節型 ( 肉眼可見腫瘤 ) 或為濔漫型 ( 顯微鏡下才看得到淋巴腫瘤細胞之聚集 )。腺胃的腫瘤觸感較正常堅硬，心臟有腫瘤則外觀變形，華氏囊往往萎縮如有腫瘤則會某單葉濔漫性腫大，皮膚上毛囊之淋巴腫瘤觸感也很堅硬。
病理切片下各臟器腫瘤細胞，以未成熟、成熟之淋巴，大小不一的淋巴同時存在為特色，也常可見到正分裂中之細胞，以及較大濃染的馬立克細胞 (Marek's disease cell, MD cell)，腦部組織可見血管周圍小淋巴球之圍管現象 (perivascular cuffing)。
(四)應採病材
(1)由血液分離：
雞隻一日齡感染馬立克病毒後體內在四週齡時毒上症，可由感染雞採取抗凝血液，1000xg，10 分鐘，離心後，取其 buffycoat 白血球層懸浮於組織培養液諸如 media 199 或 MEM，使細胞數為 10×106/ml，即為接種病材。
(2)由組織分離：
以無菌操作採取感染雞隻之內臟腫瘤、脾或腎，其中以腎較佳，經以 PBS 緩衝溶液清洗去除血球後，剪碎並以胰蛋白
(0.25%trypsin) 消作成小團細胞作為接種病材；或者消化好之腎臟細胞，調節細胞濃度為 2×107/ml 在含 10-15% Fetal Calf serum 之 M199 培養逼單層細胞。Buff-coat 之白血球細胞或消化好之組織細胞若沒立刻接種而要保存，則需以 2×107/ml 之細胞數懸浮於 10%DMSO 和 15% 胎牛血清的 MEM 或 M199 培養液內，分裝於玻璃安瓶 (glass ampules) 密封，將安瓶封於滿添棉紙之鐵罐內並置於 -70℃ 之冷凍櫃 24 小時，隨即將安瓶移入 -196℃ 之液態氮筒內長期保存，要接種時則由液態氮筒取出立即置於 37℃ 水浴，融解後立即開瓶使用。(3)由毛囊分離：
本法特別為作血清中和試驗製備無細胞依附病毒顆粒 (cell-feree virus)，由 MD 感染雞拔取羽毛剪取近毛囊端的羽端 ( 約 0.5 公分 ) 或直接剪取皮膚，置乳缽內剪碎研磨，以 SPGA-EDTA 緩衝液作成五倍或十倍乳劑，以超音波細胞擊碎器處理二分鐘，再以 650xg 離心十分鐘，其上清液即為 cell-free virus 的來源，可直接用作免疫擴散法的抗原，若要用於血清中首試驗則需將之再以 0.45μ 之濾紙 ( 事先浸於牛血清 ) 過濾之。本 cell-free virus 之保存亦可似前述方法分裝於玻璃安瓶，同樣處理保存。
(4)抗體測定之採樣：
抗凝血液或無抗凝血液採取後離心所得之血漿或血清，保存 -20℃ 以下供試。
(五)綜合診斷
1.分離培養：
組織培養：
(1)細胞依附性病毒之分離培養，較常用的細胞是 DEF( 鴨胚胎纖維芽細胞 ) 和初代雞腎細胞 (CK)，而 CEF( 雞胚胎纖維芽細胞 ) 在初代病毒分離較不適合，而是用於已組織培養馴化的馬立克病毒之增殖。24-48 小時之初代 CK 細胞或 24 小時之 DEF 細胞接種前述病毒材料，於 37-38℃ 培養 24 小時後，換新的培養液繼續培養，此後依培養液 pH 之變化適時換培養液，在 CK 細胞約在接種後 4-10 天，在DEF細胞在接種後 10-14 天，可出現圓形化之細胞變性區 (plaque 或 CPE foci)，需在光學顯微鏡下 x100 以上的倍數下觀察計數。(2)cell-free viurs 之分離培養，初代 CK 細胞比 DEF 細胞為敏感，前述毛囊採取之病材以 SPGA-EDTA 緩衝液稀釋，較以普通 PBS 緩衝液稀釋，更能增加病毒之分離率，24 小時之初代 CK 細胞在病材感作於 37℃ 半小時後即需添加組織培養液 (M199 或 MEM)，因稀釋液內含 EDTA 所以易導致組織培養細胞剝離故不能感作太久；培養於 37℃，每隔 48 小時換液一次，約於接種後 4-8 天可出現圓形化之 CPE。
雞胚胎接種分離：
(1)cell-associated virus( 細胞依附性病毒 )，病材以蛋黃內接種 (4 日齡雞胎 ) 或以靜脈內接種 (10-11 日齡雞胎 ) 之後照蛋，24 小時內死亡者棄之，接種後 24 小時以後死亡者置 4℃ 隔夜後開蛋檢查，在 CAM( 漿尿膜 ) 上會有白斑 (pock) 出現。唯此法作初代病毒分離有一缺點是正常的雞淋巴細胞也可在 CAM 上形成 pock，需區別之，另者在組織培養多代繼代後 MDV( 馬立克病毒 ) 會失去在 CAM 上形成 pock 的能力。
(2)cell-free virus 病材以 CAM 接種方式 (9-12 日齡雞胎 ) 接種以後如前述每日照蛋，於接種後 7 日檢查 CAM 上有無 pock 之形成。也可似前述以靜脈內接種方法行之。
小雞接種分離：
病材以腹腔內接種於一日齡小雞，因本病為高度空氣傳染的疾病，故小雞需養於隔離的裝置，如具有空氣過濾的正壓或負壓式 Horsfall-Bauer 隔離箱，以防外界病毒感染本試驗雞，於接種後 6-8 週，可解剖檢查肉眼或顯微鏡下馬立克病之病變。也可採血清作下列血清學檢查證明病毒感染，本法常用於病毒株之繼代保存。
2.病毒同定：
病材有無含有 MDV 之檢測，以前述一日齡小雞接種而後養於隔離箱 6-8 週，再檢查其 MDV 之肉眼或顯微病變，以及測 MDV 之特異抗體即可，如病材內可能有 MDV 和 HVT( 火雞
疹病毒 ) 同時存在，則可在病材接種小雞之隔離箱內同時放一些無接種雞，以測試其同居感染，只 HVT 存在之病材接種雞不會水平傳播 HVT，而含 MDV 之病材接種雞則會空氣傳播給居感染雞。 本病毒為 ether-sensitive( 對乙醚敏感 )，含 DNA 核酸有封套之疱疹病毒，其核酸蛋白衣 (Nucleocapsid) 之直徑為 90-100nm含 162 個 Capsomeres 以 20 面體排列 ( icosohedral symmetry) 其 DNA 之 buoyant den-sity 為 1.705g/ml，其 G/C 含量約 46%。
組織培養的 MDV 高度細胞依附性，感染活細胞的死亡往往就意味著病毒感染能力之喪失，組織培養 MDV之CPE 大約在接種後 3-5 天出現初為圓形化細胞團，繼續培養可見此圓形化細胞團繼續向外擴展，此細胞培養如以 Giemsa's 染色可在 CPE 附近的細胞核內看到 Cowdry's type A 的核內包涵體，以及多核巨大細胞 (polykaryocyte)。
3.血清學檢查：
1.Agar-gel precipitin test( 免疫擴散法 )：
以含 8%NaCl 之緩衝溶液加 1% agar 高壓蒸氣滅菌後，傾倒於直徑 9 公分之平皿 ( 每盤15ml) 或普通顯微鏡用之玻片 side)( 每片 3ml) 使冷卻凝固後，以定型具挖中間一孔週圍六孔，前者每孔且徑 0.5 公分，孔間距離 0.35 公分，而後者每孔直徑 0.3 分公分，孔間距離 0.35 公分。本試驗抗原可用毛囊無細胞依附病毒，也可用組織培養 MDV 在細胞滿佈 CPE 時刮取細胞，經以超音波細胞擊碎處理，650xg 離心十分鐘後上清液即為抗原。本試驗在每孔添加抗原或血清後，置含濕氣 ( 可以濕紗布墊底 ) 密封之盒內於 37℃ 中經 72 小時判定有無特異之沉降線出現，強陽性血清常於 24 小時內出現沉降線。
2.Immunofluorescent(IF)test：
螢光抗體直接染色取已感染法是取已感染 MDV 之雞血清，純化出其 r-globulin 再以 FITC(fluorescein isothiocyanate 色素 ) 標示之螢光抗體，對組織培養上之 CPE 進行染色確認其是否為 MVD。間接螢光抗體染色是抗雞免疫球蛋白之血清，純化出其 r-globulin，再以 FITC 標示之第二螢光抗體，染色時事覺製備已知 MDV 抗原，亦即 24 小時之 CK 組織培養細胞接種 MDV，經 37℃ 培養 4 天左右 CPE 很多時棄培養液以甲醇固定該組織培養 10 分鐘 ( 此抗原沒使用時可保存於 -70℃ 備用 ) 染色步驟為將欲測之雞血清滴於此已固定含 ＭＤ 之組織培養上置於含濕氣密封盒內於 37℃ 1 小時作用後，取出以 PBS 緩衝溶液浸洗三次，每次五分鐘，再滴以適當稀釋倍數之標示第二螢光抗體 ( 抗雞球蛋白螢光標示抗體 )，似前述置含濕氣密封盒內於 37℃ 作用 30-60 分鐘後取出似前述以 PBS 浸洗三次，即可在螢光顯微鏡下觀察，特異綠色螢光可在感染細胞的細胞核和細胞質出現。
3.Viurs-neutralization test：
由於前述毛囊來源 cell-free 之 MDV 病毒力價通常均很低而 cell-associated 之 MDV 又不能用於本血清中和試驗，因此中和試驗較少進行，欲知抗體力價常以前述 IF 間接染色法行之。 中和試驗，用約 1000PFU/ml 之 cell-free 病毒 4 份加 1 份血清(2 倍或 10 倍連續稀釋 ) 於 37℃ 作用 30 分鐘後，接種此病毒血清混合物於 24 小時之 CK 初代細胞 (24 孔培養盤 ) 每孔接種 0.2ml，每一血清稀釋接種二孔，而後於 37℃ 感作 30 分鐘再各孔添加 1 ml 組織培養液，於 37℃ 繼續培養，每 2-3 天換一次，於 6-8 天後初現 CPE 時在顯微鏡下計算每孔之 CPE foci 數目，血清中和力價是以能使 CPE foci 數減少 50% 以上之血清稀釋最高倍數計之。
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