二、副結核病
- 內容
(一) 病名及病原
1. 病名： 副結核病 (Paratuberculosis) 又稱約尼氏病 (Johne's disease) 2. 病原： 係由副結核桿菌 (Mycobacterium paratuberculosis) 所引起。 (二) 疾病簡介
副結核病又稱約尼氏病，因最初是由 Johne 及 Forthingham 在 1895 年首先在下痢牛的腸管粘膜發現本病病原菌而命名，亦有因臨床疾病而稱之為慢性細菌性腸炎或慢性增殖性腸炎。本病係牛及羊等反芻獸的一種慢性致死性之肉芽腫性腸炎，以患畜之間歇性頑固下痢，漸進性體重滅輕與消瘦，腸管粘膜增厚和產生皺褶為特徵。本病為一經濟上重要之疾病，因除感染牛隻之臨床疾病所引起之損失外，牛隻亦可因不顯性感染副結核病，而使產乳量滅產達 7.8 至 20%，同時亦會引起受胎間隔的延長，乳房炎及繁殖障礙等而造大經濟損失。 (三) 典型之臨床症狀及病理變化 典型的副結核病病牛雖會食慾可能仍佳，但在臨床上會有頑固性間歇性下痢及漸進性消瘦，母牛在懷孕時可能會有改善，但在生產後又會復發。在疾病末期患牛常有赤痢及特徵性的下顎部之水腫 ( 瓶狀下顎 )。牛隻可能在開始下痢後一週內死亡，但大多數牛隻呈現反覆的疾病好轉然後再加劇的長期病程後死亡或被淘汰，亦有少數牛隻可完全痊癒。剛開始之下痢常為間歇性，然後逐漸嚴重，及至後期便成為經常性的下痢，糞便為黃褐色泥狀含氣泡。感染牛群之生育力降低，對乳房炎之感受性增加。 牛隻食入本菌後，菌體穿過迴腸及盲腸上皮細胞本被巨噬細胞所吞噬，本菌在牛隻巨噬細胞內可存活數週而不會被分解，由於本菌在腸道粘膜之增殖刺激了迴腸末端而形成肉芽腫反應。在感染後數個月在此處首先形成病灶，然後病灶逐漸擴大到盲腸及近端結腸，在病情較重的牛隻，整個腸管及鄰近之淋巴結可見到病變。腸管壁的腫脹可能十分顯著亦可能很輕微，此腫脹係由於粘膜之基部及粘膜下層有大量的類上皮細胞的增殖所致，但與結核病病灶不同的是副結核病並沒有在結核病可見核 (tubercles) 之形成及壞死的發生，腸管上皮仍然完整，但形成極深的皺摺，即使用力拉扯亦無法將之拉平。腸係膜淋巴結常稍腫大，但並不會極度腫大或有壞死。有時在腸管漿膜面的淋巴管因充滿類上皮胞，因此本來不顯著的淋巴管變成光滑扭曲的索狀管。本菌亦可被巨噬細胞帶到肝、脾、子宮、乳房及雄性生殖器官等部位，但在這些部位很少見到病變發生。 (四) 應採病材
病材應採糞便、直腸粘膜、腸係膜淋巴等部位，分離率以迴盲瓣前後各 3-4 公分及相關淋巴結部位為最高。病材 ( 腸粘膜或糞便 ) 應冷凍送至試驗室，如在室溫保存時應在 24-36 小時內送扺試驗室以滅少污染。 (五) 綜合診斷 1.副結核菌之分離及同定： 本法之缺點在對臨床病例之診斷而言實在太慢，並且敏感性不足以診斷出所有感染例。
副結核桿菌為抗酸性染色陽性及革蘭氏染色陽性菌，初代分離培養基一定要添加分枝桿菌素 (Mycobactin P 或 J) 才會發育，如將 M. phlei 添加於 Dorset 氏蛋培養基亦可供為分枝桿菌素之來源。本菌在添加有分枝桿菌素之賀氏蛋黃培養基 (Herrold's egg yolk medium)( 附錄 10)，Dubos 氏變法培養基 ( 附錄 2)，或 Middlebrood 7H11 培養基 (Difco) 等固形培養基於 37℃-39℃ 培養，但發育時間十分緩慢，尤其是初代培養時較其他分枝桿菌緩慢，往往超過 8-12 週以上。一般在 6-8 週後開始可見發育，菌落為小型、平滑、突起及無光澤白色，邊緣不規則，在 12 週時菌落直徑可達 1-2mm。在顯微鏡下副結核桿菌呈為短、厚桿狀，約 0.5X1μm，不形成芽胞，為無鞭毛，無莢膜之桿菌。本菌較其他分枝桿菌為小，並且在便中或組織中皆常呈集簇存在，此點有助於與其他分枝桿菌之鑑別。
診斷試驗室如同時收到大量病材或無法立即處理，可將之暫在 -70℃。由於病材中會有許多其他雜菌之污染需先處理去除之，一般取所採標本約 10 公克，製成乳劑後用沙布過濾，然後以 3,000rpm 遠心 30 分鐘，取其沉渣加 10 倍量 0.75%HPC(hexadecylpyridinium chloride；Sigma 公司)，在室溫 16-24 小時或過夜處理，亦有使用 0.5-1%cetylpyridinium chloride 或 0.1-0.3%benzalkonium chloride(Zephiran) 來去除雜菌之污染。病材並可進一步以蒸餾水或胰蛋白脢 (trypsin) 處理，亦便使巨噬細胞溶解而釋出副結核菌。同一病材應同時接種含分枝桿菌素及不含分枝桿菌素之培養基以確定其分枝桿菌素依賴性。另外由於有些菌株對 pyruvate 敏感，因此應同時接種未添加 pyruvate 之賀氏蛋黃培養基。由於副結核桿菌之發育非常緩慢，往往需數個月 (>10 週 ) 之久，因此病材培養後應觀察至 20 週。而副結核桿菌的鑑定，由於其生化活性差，因此往往以培養特性 ( 生長緩慢，Mycobactin 依賴性 ) 及形態 ( 短小抗酸性染色桿菌 ) 來鑑定。
2.免疫學診斷的方法：本病的血清學診斷往往因感染牛隻抗體反應常很低，另外副結核桿菌與許多其他分枝桿菌抗體有交叉反應，導至常有偽陽性反應及偽陰性反應的存在，因此這些診斷試驗雖然可以在短時間內完成，仍需靠副結核桿菌的分離來確診。
目前使用的血清學診斷方法有免疫酵素吸附法 (ELIAS)、補體結合試驗 (CF test)、免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion; AGID)、交叉免疫電泳法 (crossed immunoelectrophoresis, CIE) 、螢光抗體法、血球凝集試驗、血球凝集溶解試驗 (haemagglutination-lysis test) 等，及偵測細胞免疫反應之副結核菌素皮內試驗，伽瑪干擾素測定 (γ interferon ELISA test)，淋巴球轉型試驗 (lymphocyte transformation test) 巨噬細胞移行及抑制試驗等，其中以 CF 及 AGID 最為常用，而 ELISA 亦為最近開發之重要方法。至於淋巴球轉型試驗及巨噬細胞移行及抑制驗等因實施因難而不能作為例行檢驗之用。
(1)皮內試驗皮內試驗係以 0.1ml 副結核菌素 (0.5mg/ml) 皮內接種 ( 通常在頸部或尾根部皺襞 ) 測試動物，( 如使用鳥型結核菌素其每感性與特異性相仿 )，在 48 小時後檢查皮膚腫脹情形加予判定，一般以厚度增加 3mm 以上，並有增溫疼痛硬結壞死等情形判定為陽性反應，如果腫脹差在 3mm 以上，但無上述之硬結等反應則為疑陽性，需在 3 個月後一側頸部或尾根部皺襞進行皮內試驗。但此方法並不是很可靠，如在一些已排除感染，或曾經感染其他分枝桿菌的動物，尤其是 M. aviam complex 致敏動物在田間十分普遍。一般而言，皮內試驗在感染初期 3-9 月齡時反應較佳，但到了 15-24 月齡反應即差，大部份排菌牛都呈陰性反應，亦即許多牛隻在疾病末期呈為耐受性 (tolerant) 或無反應狀態 (anergin)，另外一些不顯性感染牛隻亦可能呈陰性反應，而在山羊往往在感染 1 年或以上時才會出現陽性反應，在鹿陽性反應常為擴散狀斑塊 (diffuse plaques) 而不是獨立的界限清楚的腫漲 (discrete circumscribed swellings)，因此在鹿有任何腫漲即應判定為陽性反應。 (2)補體結合 (CF) 試驗
本試驗為傳統的副結核病抗體測定方法，已使用多年，當用為臨床病例之確診試驗，敏感性及特異性可達 90% 左右，但本試驗用於潛伏感染病例時則效果不彰，尤其是應用於年輕的動物時 (1-2 歲齡 )。本試驗不及 ELISA 敏感，因為 CF 抗體常在感染長時間後才能測得，甚至還只能間歇性測得。補體結合試驗特異性亦不佳，此是因與其他分枝桿菌 (Mycobacterium)，奴卡氏菌 (Nocardia)，(Dermatophilus spp.) 有交叉反應之故。本試驗之實施方法見附錄 3。 (3)免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion;AGID)
用於牛副結核病之診斷敏感性不及 ELISA，但對綿羊及山羊之副結核病之診斷則頗敏感。使用之抗原為副結核菌之粗萃取物 (crude protoplasmic extract)，可能有非特異性沉降線，因此試驗必需包括適當的陽性對照。目前國外有市售商用套組可供使用。本方法雖然實施簡便，判讀容易，但由於此試驗敏感性低，仍必需與其他試驗如皮內試驗或細菌分離等協同使用。本試驗之實施見附錄 4。
(4)酵素結合免疫吸附法 (ELISA 法 )
本法是目前偵測副結核病抗體的最敏感方法，雖然特異性不及副結核菌之分離，但可很快的獲得結果，在副結核菌大量增殖期尤其有用。一般而言 ELISA 陽性反應較 CF 早出現及反應較強，在糞便中開始可分離到副結核菌之 6-9 個月，ELISA 抗體才會陽轉。以 M. phlei 吸附血清及使用副結核菌較特異之抗原可提高特異性，供試血清的吸附處理係以 50μ1 的血清與 950μ1 熱不活化 M. phlei 懸浮液 5mg 乾重 /ml 混合，在室溫一小時後於 4℃2,000rpm 離心 30 分鐘，如此可提高特異性，敏感性則稍為降低。目前國外有商用套組出售可供使用。本試驗之實施方法見附錄 5。 (5)伽瑪干擾素測定 (γ interferon test)
本試驗係發展應用於牛結核病之測定，隨後亦被於本病之診斷，目前國外有商用套組出售，此試驗包括 2 個步驟，首先採取牛隻之全血與副結核菌素 (PPD) 過夜感作，如牛隻感染過副結核菌則血中之 T 淋巴球會反應而釋出伽瑪干擾素，第二步驟中則將血液遠心分離出血漿三明治酵素標示抗體法 (sandwich EIA test) 測定伽瑪干擾素之存在與否。
3.病理學診斷：本病應檢查腸粘膜尤其是迴腸末端 ) 有無特微性的增厚及皺摺形成。腸系膜淋巴結可能腫大及水腫。採取腸管及腸系膜淋巴結固定於 10% 中性福馬林以製作組織切片，並以 haematoxylin and eosin 染色及 Ziehl-Neelsen 染色檢查，特徵性病變包括大淡染之類上皮細胞與多核朗罕氏巨大胞 (Langhans' giant cells) 浸潤於固有層，培耶氏斑 (Peyer's patches)，腸系膜淋巴結皮質部，在這二種細胞內可能有成堆或單獨存在之抗酸性細菌，朗罕氏巨大細胞不一定可發現。鹿的人型 (M. tuberculosis）及鳥型 (M. avium) 結核菌感染可能與副結核菌感染有同樣的病變。綿羊及山羊感染不易培養及不形成色素的結核菌菌株，亦會引起與人型及鳥型結核菌感染類似的乾酪樣壞死性腸系膜淋巴結病灶。
另可由糞便或腸粘膜或淋巴結切面等直接作塗抹片，或加 4-5 倍量的蒸餾水，經攪拌後，靜置 20-30 分鐘，取上層液以 3,000rpm 遠心 30 分鐘，沉渣加 0.5ml 蒸餾水懸浮後，作 4-5 張的塗抹標本，再以 Ziehl-Neelsen 抗酸性染色、乾燥、以 xylol 透徹封入、鏡檢。副結核菌菌體較小且常集簇存在 ( 3 個及以上 )，如一張標本能檢出數個以上 20-30 個抗酸性桿菌之團塊，則可懷疑為本病。但是此法檢出率及特異性並不佳。而在牛糞便中常有許多較大型腐生性抗酸菌存在，在形態不易與副結核桿菌區分。(六) 確診依據 目前本病斷所使用之細菌學或免疫學方法皆有其缺點，沒有一個可靠的實驗室診斷可檢出所有潛伏感染動物，尤其本病在潛伏感染期之唯一確診方法為副結核菌的分離。因此本病免疫與細菌學診斷方法臨床症狀及病理學診斷方法配合，以滅少偽陽或偽陰性反應結果。 (七) 參考文獻 1. Abbas P, Riemann HP, Lonnerdal B. 1983. Isolation of specific peptides from Mycobacterium paratuberculosis protoplasm and their use of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of paratuberculosis(Johne's disease) in cattle. Am J Vet Res 44：2229-2236. 2. Bech-Nielsen S, Jorgensen JB, Abrens P, Feld NC. 1992. Diagnostic accuracy of a Mycobacterium phlei-absorbed serum enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of bovine paratuberculosis in dairy cows. J Clini Microbiol 30：613-618. 3. Benedictus G, Dijkhuizen AA, Stelwagen DJ. 1987. Economic losses due to paratuberculosis in dairy cattle. Vet Rec 121：142-146. 4. Collins DM, Hilbink F, West DM, Hosie BD, Cooke MM, de Lisle Gw. 1993. Investigation of Mycobacterium parataberculosis in sheep by fecal culture, DNA characterisation and the polymerase chain reaction. Vet Rec 133：599-600. 5. Merkal R. S. 1984. Paratuberculosis. In: The Mycobacteria: A Sourcebook. G.P.Kubica & L.G. Wayne, eds. Marcel Dekker Inc., New York, pp.1237-1249. 6. Office International des Epizooties 1992. Paratuberculosis. in "Manual of Standards for diagnostic tests and vaccines ",pp.216-231. 7. Sherman D.M., Markham R.J.F. & Bates F. 1984. Agar gel immunodiffusion test for diagnosis of chinical paratuberculos is icattle .J Am Vet Med Assoc, 185：179-182. 8. Sherman DM, Gay JM, Bouley DS, Nelson GH. 1990.Comparison of the Complement-fixation and agar gel immunodiffusion tests for diagnosis of subclinical bovine paratuberculosis. J Vet Res 51：461-465. 9. Spangler E, Bech-Nielsen S, Heider LE.1992 Diagnostic performance of two serologic tests and fecal culture for subclinical paratuberculosis, and associations with production. Prev Vet Med 13：185-195. 10. Spangler E, Bech-Nielsen S, Heider LE, Dorn CR. 1992. Interpretation of an enzyme-linked immunosorbent test using different cut-offs between positive and negative samples for diagnosis of paratuberculosis. Prev Vet Med 13：197-204. 11. Stephens LR, 1987. Johne's Disease-Paratuberculosis. In "Australian Standard Diagnosic Techniques for Animal Diseases", pp.1-11. 12. Vary C. P. H. Anderson P. R., Green E., Hermon-Taylor J, & McFadden JJ. (1990). Use of highly specific DNA probes and the polymerase chain reaction to detect Mycobacterium paratub erculosis in Johne's disease. J. Chlin. Microbiol.,28,933-937. 13. Yokomizo Y., Merkal R.S. & Lyle P.A.S.1983. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine immunoglobulin Gantibody to a protoplasmic antigen of Mycobacterium paratuberculosis. Am J Vet Res,44：2205-2207. (八) 附錄 附錄 1：賀氏 (Herrold's) 蛋黃培養基 (1L)(一)配方：
(二)製法：protease peptone 9g 氯化鈉 (Sodium chloride) 4.5g 瓊脂 (agar) (Difco) 15.3g 甘油 (glycerol) 27ml Mycobaction(Allied Lab) 2mg 2%malachite green 水溶液 5.1mg 氯鰴素 (chloramphenicol) 50mg 青鰴素 100,000 U amphotercin B 50mg sodium pyruvate 4g 蒸餾水 870ml 蛋黃 6 個 Protease peptone，氯化鈉，瓊脂及甘油溶於蒸餾水後，加熱至 100℃，加入氯鰴素後在 115℃ 高壓蒸氣滅菌 15 分鐘，在水浴槽冷卻至 56℃ 時加入青鰴素，amphotercin B，sodium pyruvate，mycobactin 及滅菌之 malachite green 水溶後，6 個蛋黃，混合均勻，在 56℃ 攪拌及分裝。
附錄 2：Dubos 變法培養基 (1L)(一)配方：
(二)製法：Difco casamino acids 2.5g Asparagine 0.3g Disodium hydrogen phosphate 2.5g Potassium dihydrogen phosphate( 無水 ) 1.0g 檸檬酸鈉 (sodium citrate) 1.5g 硫酸鎂 (magnesium suplhate)( 結晶 ) 0.6g 甘油 25ml Tewwn 80(1%) 50ml 瓊脂 ( 加至終濃度 1.5%) 15g 將所有鹽類依序在可溶解之最低溫溶解於蒸餾水，最終容積應為 800ml，加入 mycobactin 使濃度為 2mg/1，加熱至 100℃，加入氯鰴素 (0.05g)，在 115℃ 高壓滅菌 15分鐘，在水浴中冷卻至 56℃ 時加入 200ml 已過濾及 56℃ 加熱非 
化之牛血清與青鰴素 (100,000) 及 amphotercin B(50mg)，混合均勻，一邊混合一邊分裝 5-6ml 於已滅菌有螺旋蓋之小瓶中，傾斜放置。在使用前 24 小時將凝結水倒掉，以棉花塞塞住瓶口，置於恒溫箱或溫暖之室內乾燥，此培養基之優點在於其為透明培養基，有利於早期發現菌落之形成。附錄 3.補體結合 (CF) 試驗之實施方法如下：1. 血清：供試血清及標準血清皆以 0.85% 食鹽水稀釋後，在 56℃，30 分鐘非 化。2. 抗原：係由副結核菌抽出之脂多醣成分，使用量為 4 個單位。 3. 補體及溶血性素：補體及溶血素分使用 2 單位及 3 單位，綿羊紅血球液則使用 3% 液。 4. 結果判定：供試血清在 5 倍稀釋時有 75% 以上的抑制溶血現象為疑陽性反應，如在 10 倍稀釋或 10 倍以上稀釋倍數時有 100% 溶血抑制現象則為陽性反應，即以 CF 抗體力價在 1：10 以及以上者判定為陽性。 附錄 4. 免疫擴散法 (AGID) 實施方法如下：將瓊脂 (agarose) 溶解於 8.5% 氯化鈉溶液，以 0.01M Tris(hydraxy-methyl)aminomethane 調整 pH 值至 9.0，再加入 0.02%NaN3，然後將此瓊脂懸浮液在沸水浴中加熱溶解後 25ml 分裝，在 4℃ 保存，使用時將瓊脂在沸水浴中加熱溶解後加在玻片上以形成 5mm 厚之凝固瓊脂，以打孔器在瓊魯上打出六角形分布之六個孔及中央一個孔，孔的直徑 4mm，中央孔與週圍六個孔的距離為 1 公分，抗原之製備係將副結核菌擊碎後在 40,000g，2 小時遠心所得之上清液，使用之濃度為 10mg/ml，AGID 法實施時將抗原加入中間孔，供試血清及陽性標準血清交叉加入於週圍六個孔內，將玻片置於濕盒內以防止瓊脂乾掉，在室溫 24~48 小時後檢查有無沉降線發生。 附錄 5. 酵素結合免疫吸附法 (ELISA) 之實施方法：1. 材料： a. ELISA 用抗原：係粗製原生質內抗原 (crude protoplasmic antigen)，使用時以 0.05M 炭酸緩衝液 (pH9.5) 稀釋成 5μ1/ml 之濃度。 b. 供試血清處理：供試血清進行 ELISA 試驗前皆先以 Mycobacterium phlei 吸附處理，即以 1ml M. phlei 菌液與 25μ1 供試血清在室溫混合振盪 30 分鐘後，置於 4℃ 過度感作後，所得之上清液即為已處理之 40 倍稀釋血清，供為 ELISA 試驗。 c. 兔抗牛 IgG 血清及綿羊抗兔子 IgG Fc 之免疫酵素標示抗體 (sheep anti-ra-bbit IgG Fc horseradish peroxidase conjugate globulin)。 2. 實施方法：
添加 100μ1 前述之 ELISA 用抗原於微量力價測定盤每個洞 (well) 後於 4℃ 過夜吸附，然後以含 0.05%Tewwn 80 及 0.2%W/V NaC1 之 0.5M NaH2PO4 溶液 (pH7.2) 洗滌 4 次。前述已處理供試牛血清以含 0.1% Tween 80，1M NaC1，0.25% gelatin 之 0.2M NaH2PO4 溶液 (pH7.2) 稀釋成最終濃度為 1：100 倍，陰性血清亦稀釋成 1：100 倍，陽性血清則自 1：100 倍起作 2 倍序列稀釋至 1：12,800 倍。取各稀釋之血清 100μ1 添加於已固定有 ELISA 抗原之洞中後，在室溫振盪 5 分鐘後再靜置 25 分鐘，再以前述之洗滌液洗滌 3 次。然後所有的洞皆加入 100μ1 兔抗牛 IgG 血清 (1：500 稀釋 )，在室溫振盪 5 分鐘後再靜置 25 分鐘然後再移入 4℃ 冷箱靜置 1 小時後以前述之洗滌液洗滌 3 次，再在所有的洞皆加入 100μ1 標示抗體 ( 以力價檢定時 OD 值 =1.0 之稀釋倍數 ) 後在室溫振盪 5 分鐘後再置 25 分鐘，再移入 4℃ 過夜感作。第二天以洗滌液洗滌 5 次後，每個洞添加 50μ1 受質溶液【每 50ml 含 20mg Ophenylendiamine 及 100μ1 3%H2O2 之枸椽緩衝液 (citrate buffer)(pH4.7)】，經在室溫於暗室中感作 20 分鐘後每洞加入 50μ1 3N H2SO4 中止酵素作用。然後以 ELISA 用判機 (Microplate Reader) 在 490nm 之波長判讀每個洞之 OD 值，供試血清之 OD 值如大於或等陰性血清之平均 OD 值的 3 倍值則判定為陽性。