八、豬黴漿菌肺炎
- 內容
(一)病名及病原：
1.病名：豬黴漿菌肺炎
2.病原：Mycoplasma hyopneumoniae
(二)病原簡介：
豬黴漿菌肺炎主要是由 Mycoplasma hyopneumoniae 所引起的慢性傳染性呼吸道疾病。 豬黴漿菌肺炎是一種慢性傳染性呼吸道疾病。由於感染率高達 30~80%，患者生長緩慢，飼料換肉率降低，造成嚴重的經濟損失。另外，感染本病的豬隻很容易誘發次發性病原，如巴斯德桿菌、鏈球菌等的混合感染，引起更嚴重的肺炎病變。台灣是亞熱帶海島型氣候，高溫潮濕，很適合微生物的發育繁殖，且本省養豬場密度高，每個養豬場內飼養的豬隻太密集，因此本病的發生相當嚴重。從屠宰場豬隻肺臟病變檢查發現有些豬場之屠宰豬，黴漿菌肺炎發生率高達百分之百，可見本病感染之嚴重程度。
(三)典型之臨床症狀及病理變化：
1.臨床症狀：
(1)發生率 80% 以上，死亡率極低。(2)慢性乾咳，可早自二週齡開始至上市。(3)易發生二次性感染而呈急性肺炎。
2.病理學變化：
(1)雙側性尖心葉腹側的不規則紫、灰硬肺炎病症，間葉橫膈葉前部亦會波及，切而有肉質感，支氣管及中膈淋巴結腫大。(2)少量中性球聚集在基底及氣道四週，淋巴球浸潤於血管及小支氣管周圍，量隨時間而增加，水腫液及單核細胞浸潤於肺泡中。
(四)應採病材：
肺臟 ( 尖葉與心葉 )
(五)綜合診斷：
1.病原分離及同定：
病原培養分離是一種很理想的診斷方法，但由於 M. hyopneumoniae 生長條件要求較嚴，因此早期對本病原的分離培養相當困難，經過許多學者的改進後，目前所用 Friis Medium 分離率相當高。
病原分離過程如下：
(1)將肺臟用燙板燙燒表面以去除污染的雜菌後，將表面組織去掉，然後無菌處理取肺組織約 0.5 公克，置於滅菌的玻璃乳缽內，加入 5ml 的 Friis medium，作成約 10 % 的肺組織乳劑，倒入試管中，先取出一白金耳的乳劑接種於血液瓊脂培養基以檢查細菌，將含乳劑的試管靜置於 4℃，30 分鐘後，用吸管吸取 0.2ml 接種於 1.8ml 的 Friis medium，並做 10 倍稀釋，稀釋到 10-8為止。(2)將稀釋的試管置於轉盤上，於 37℃ 轉動培養，並於第二天以後每天觀察。如果培養液變黃而不混濁的話，表示可能已經發育。再用 Giemsa Stain 染色檢查。培養液一般觀察到15天，如果沒有發育的話，就將此培養液棄掉。
(3)發育的黴漿菌之鑑定可用生長抑制試驗 (Growth inhibition test，GI) 或代謝抑制試驗 (Metabolism inhibition test，MI)，來加以鑑定。代謝抑制試驗步驟如下：
1.將要測定的分離株培養 24 小時後，用 Friis medium 稀釋到 10-3。
2.準備無菌過濾並非
化 (56℃，30 分鐘 ) 的各種黴漿菌抗血清 ( 如 M. hyopneumoniae，M. flocculare 及 M. hyorhinis) 等。3.用 96 wells 的 microtiter plate 進行試驗，在每一 well 首先各加入各種無菌處理過的抗血清 0.025ml，進行 2 倍稀釋，然後每一 well 各加入所要測定的抗原 0.05ml 及 Friis medium 0.125ml。抗原對照是加 0.05ml 抗原及 0.15ml 的 Friis medium，陰性對照則加 0.2ml 的 Friis medium，將 plate 加蓋密封後置於 4℃，過夜後置於 37℃ 培養，到抗原對照的顏色改變後，加以判定為何種菌株。
2.血清學診斷：
應用於豬黴漿菌肺炎診斷的血清學方法很多，如補體接合反應 (Complement fixation，CF)，間接血球凝集試驗 (Indirect haemaglutination test，IHA)，酵素連結免疫吸附試驗 (Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，免疫螢光技術 (Immuno fluorescence，IF) 以及試管凝集試驗 (Tube agglutination，TA) 等。ELISA 之操作過程如下：
抗原：以 Friis medium 培養之 M. hyopneumoniae 以 PBS 洗三次，用 13000xg 在 4℃ 離心 50 分鐘，沉澱物以 PBS 泡成濃縮 10 倍的菌液，分裝成小瓶，儲存於 －18℃ 的冷凍庫中備用。3.ELISA 操作程序：
(1)利用 coating buffer 將抗原連續稀釋，於 4℃ 下靜置，隔夜 (16~20hr)，使抗原吸附在 plate 之表面上。(2)以 PBS-Tweem 溶液洗三次，甩乾。
(3)添加遮蓋液 (1﹪BSA) 於每一 well 中 (100μl) 於 37℃ 下，靜置 1 小時。
(4)以 PBS-Tweem 溶液洗三次，甩乾。
(5)添加測試血清 ( 抗血清及陰性血清作對照 )，於 37℃ 下，靜置 1 小時。
(6)以 PBS-Tweem 溶液洗三次，甩乾。
(7)添加酵素標示抗體，於 37℃ 下，靜置 1 小時。
(8)以 PBS-Tweem 溶液洗三次，甩乾。
(9)添加 substrate(orxho-phenylene diamine)，室溫下，靜置 45min。
(10)每一 well 均添加 50μl之 2.5 M硫酸 (stopping solution)。(11)將 plate 放入 EIA Reade 內，以 490nm 之波長測其 O.D. 值。
4.病理學診斷：
(1)肉眼病變：左、右尖及心葉之末端最容易出現豬肝色或灰色之病變，病變區與正常部位之界線非常清楚，嚴重時，左右膈葉的前端及中間葉亦會出現病變。肺門淋巴結常腫大充血，若有其他細菌混合感染時，( 如巴斯德桿菌等 )，則病變區更為擴大，表面光亮，用刀切開，支氣管有白色膿樣的分泌液出現。
(2)組織病理變化：在感染初期 (10~15 天) 有少數多核球 (polymorphonuclear cells) 出現於小支氣管及肺泡內。在感染 15~20 天時，則有大量的淋巴球出現於小支氣管及血管周圍；同時大量的單核球及其他炎症細胞出現於肺泡在內。在感染後 21~40 天則在小支氣管及血管周圍的淋巴球圍管現象更為明顯。
(六)確診依據
綜合病原分離、血清學診斷、病理學診斷三要素均為 Mycoplasma hyopneumoniae 所引起之黴漿菌肺炎者，是為確診。
(七)參考文獻：
P. J. Quinn, M. E. Carter, B. Markey and G.R. Carter (1994) Clinical Veterinary Microbiology. PP320~326. Wolfe, London. England.