十三、家禽黴漿菌症(獸醫科技資訊網)

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十三、家禽黴漿菌症

內容

(一)

病名及病原：

　　黴漿菌是一種缺乏細胞壁，能獨立生存的最小原核微生物。多種家禽黴漿菌已被描述和定性。表 1，是由 Jordan(13) 根據其它資料來源 (4.5.6.8.19) 改寫而成，列出它們的生化反應和一般寄生宿主。

表 1 家禽黴漿菌的性狀

黴漿菌種	通常宿主	葡萄糖醱酵	Arginine 水解	Phosphatase activity 活性
A. laidlawii M. anatis M. anseris M. cloacale M. columbinasale M. olumbinum M. columborale M. galliarum M. gallinaceum M. gallispticum M. gallopavonis M. glycophilum M. iners M. iowae M. lipofaciens M. meleagridis M. pullorum M. synoviae M. gallorale	多種鴨鵝火雞鴿子鴿子鴿子雞雞雞和火雞火雞雞雞火雞雞火雞雞雞和火雞雞和火雞	+ + - - - - + - + + + + - + + - + + -	- - + + + + - + - - - - + + + + - - -	+or- + - - + - - - - - - +or- - - - + - - ?

　1.Acholeplasma 不需 cholesterol 就可生長。
　2.Ureaplasma 可分解尿素。

(二)

疾病簡介：

　　三種家禽黴漿菌一般被認為是對家禽具有病原性：Mycoplasma gallisepticum(MG)、M. synoviae(MS) 和 M.meleagridis(MM)。MG 可引起雞、火雞和其它禽類的呼吸器疾病和產蛋率下降，是家禽黴漿菌中造成最嚴重經濟損失者 (26)。在肉雞和火雞可見嚴重氣囊炎、咳嗽、濕性水泡呼吸音和生長遲緩，而且可由於嚴重氣囊炎的惡化而造成死亡。在火雞常可見眼窩下竇腫大。MS 可引起雞、火雞和其它禽類的關節炎，並與呼吸器疾病有所關聯 (18)。MM 僅限於感染火雞，主要引起幼齡火雞的呼吸疾病，並有生長遲緩、羽毛豎立和腿部疾病 (25)。另外，M. iowae 和火雞的胚胎晚期死亡和孵化率降低有關 (3)。MG、MS、MM、M. iowae 可以介卵傳染，也可經由直接或間接方式接觸而感染傳播。MM 介卵傳染的模式是由性交而得，它會存在於雄性的陰莖，因而污染精液，繼而污染雌性的輸卵管。

(三)

典型之臨床症狀及病理變化：

1.慢性呼吸器病：

蛋雞：
　　雞冠蒼白、消瘦、輕微之呼吸症狀。飼料攝食量和產蛋率下降，尤其產蛋率下降後，就難以恢復而一直持續著低的產蛋率。被感染之蛋雞的死亡率雖不高，但會有相當多精神萎靡之雞出現。
肉雞：( 三至八週齡 )
　　低日齡肉雞之症狀較成雞明顯和嚴重，飼料攝取量和生長速率都會降低。死亡率一般均甚高，但亦有低者，視其情況而定，倘在管理不良之雞場或有其它緊迫之情形，則會使死亡率增高。
火雞：
　　除了單側或雙側眼窩下竇之腫脹外，被感染之火雞尚有鼻液之分泌，故常可在翅膀上看到鼻液。如果火雞被感染後，其氣囊和肺受到嚴重侵犯的話，其所造成之死亡率則相當高。
病變：
　　病雞之生理狀況差和體重減輕是常見之症狀，這些症狀之出現可視為是慢性之病例。病雞之呼吸道、腔竇、氣管和支氣管等會有明顯之卡他炎症反應。氣囊常肥厚、不透明且囊壁上可能有林巴濾泡之浸潤，氣囊中亦常含有乳酪狀分泌物。其他病因如新城雞瘟或傳染性支氣炎之疫苗接種，尤其是噴霧接種，也會做氣囊膜增生變厚而成為不透明之現象。
　　火雞傳染性眼窩下竇炎之病變可能局限在眼窩下竇之腫脹，相反地，鼻竇炎可能不會出現，反而有鼻炎、支氣管炎和氣囊炎或纖維素性肺炎等病變。此外，心囊炎、肝包膜炎等亦會隨病情之惡化而接著發生。

2.傳染性滑膜炎：

臨床症狀：
　　本病發生初期之家禽有蹲在地板 ( 墊料 ) 上之傾向，接著發現有跛腳之病雞。在這些病雞中常有雞冠轉蒼白，膝、踝關或腳趾部位關節之腫脹等症狀。急性感染之病禽之頭部常呈暗綠色。本病侵襲雞場時，其發生率多呈低至中等程度，但在寒冷、潮濕之季節或墊料潮濕之情況下會增高很多。死亡率一般而言都為百分之十左右，但如有其化疾病併發或管理、衛生不良之雞場則會提高。
　　由於病雞不良於行，所以很多病雞會變成消瘦、脫水而死，這是造成死亡率或淘汰率增高之主要原因。
病變：
　　於發病初期，病雞之滑膜組織 ( 如關節、腱鞘 ) 內會含有粘稠、灰色至黃色之分泌物。這些分泌物增多之結果導致腳部、翼部關節之腫脹而不良於行。病雞之實質臟器亦會腫脹，肝臟更有膽汁染色之情形而呈綠色。不等程度之腸炎亦為常見之病變。
　　末期之病雞多呈消瘦，內臟器官多不見病變。關節和腱鞘內之分泌物呈濃縮狀，同時關節面可能會被染成黃色或澄黃色；胸部之水腫或創傷則是由於長期和地板接觸、摩擦之必然結果。
　　有些產生氣囊炎和鼻竇炎之病雞亦可分離到本菌，此種病雞則可能不會出現如上述關節炎之典型病變。

3.火雞黴漿菌病：

臨床症狀：
本病所引起之症狀大都是輕微或不明顯，其主要之症狀如下：
　　被感染之火雞呈不顯性感染，且不會造成孵化率之降低，但是雞胚死亡率最高之期間是當蛋送至孵卵器內和破殼等二個階段。自被感染之種火雞所生之蛋所孵化之雛火雞可能會有高比率之餓死雞和每日增重很差之情形。被感染之幼火雞可能會呈現輕度之呼吸器症狀且偶而會有腔竇炎，少數之幼齡火雞亦可能會因頸稚等脊椎之變形而有斜頸、隆背之現象，亦可能有弱腳之現象。
　　經由生殖道或呼吸道感染之成熟火雞通常不會呈現症狀。
病變：
　　被感染而尚未孵化或剛出生之雛火雞可能有不等程度之氣囊炎 ( 氣囊肥厚，氣囊中亦可能有少量之黃色滲出物 )。單純之本病，其病變會隨日齡之增加而減輕，到了二十週齡時，其病變可能會消失。
　　雛火雞有頸椎形成不良者可能有頸部氣囊炎和頸椎骨髓炎。頸椎骨髓炎可用鏡檢方法檢出。
　　被感染成雞之生殖器不會有肉眼變化，但是純粹由本菌感染成熟火雞和半成熟火雞後所形成之氣囊炎、傳染性滑膜炎和竇炎等亦可能會發生。

(四)

應採病材：

　　在急性感染期感染後 (60~90 天內 )，此黴菌數量在上呼吸道和感染雞群中非常高。從這些病例的氣管或食道裂溝採取 10~15 個病材通常是足夠的。然而，在慢性病例或感染低病原性黴漿菌時，要從 30~100 個個體分離。而有氣囊炎或關節炎時，則要從病灶部位分離。經過數週後病原會從病灶處消失，但一直存在於呼吸道。當欲分離胚內的 MG、MS 或 MM 時，卵黃的病材應包含一部份的卵黃囊膜。M. iowae 可由胚或一日齡雞的食道中分離而得。MM 可由產蛋期火雞的陰道中分離。對於某些病例，其它組織如輸卵管、共泄腔或腦也值得培養。
　　檢體要保存或送至實驗室時，在農場採集的最好用黴漿菌液體培養基，並且盡速送至實驗室。用液體培養基分離，雖然也應儘速培養，但仍可在室溫存活數天。另一方面，氣管黏液或組織可以收集後用乾冰冰凍然後運送之。而檢體以乾冰保存，送達實驗室時最好仍呈冰凍狀態，就可成功地分離出家禽黴漿菌。在某些病例有必要以濕冰運送時，檢體需儘可能在 24 小時內培養。
　　血清學試驗的血清收集並不需要特別的步驟。然而，冰凍過的血清會造成非特異性的凝集，因此血清平板凝集必需用新鮮血清。但新鮮或冰凍的血清仍適合其它血清學檢驗。

(五)

綜合診斷：

1.黴漿菌分離及同定：

　　目前尚無一種培養基配方可適用於所有黴漿菌的生長。黴漿菌是屬於高挑剔性的微生物，要用蛋白質基的培養基，並添加 10~15% 血清或血清因。葡萄糖可被 MG、MS、 M. iowae 和其它幾種黴漿菌醱酵，且是一共通的添加物。一種源自酵母之因子對黴漿菌是有助益的，它通常由商品化的酵母菌自溶產物或新鮮酵母抽出物來供應。MS 需要nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 和半胱氨酸 ( 當作 NAD 的還原劑 )。黴漿菌對青黴素有抗性 ( 因缺乏細胞壁 )，且對醋酸鉈 (Thallium acetate) 有相當抗性;大部份的培養基都含有這些成份，以避免細菌和黴菌的污染。一般而言，馬血清常添加於培養基以培養 MM，豬血清用於培養 MS，馬、牛或豬血清之一用於培養 MG。而血清必需在 56℃，30 分鐘予以非

化。由於每一批血清支持生長的能力不一，因此每批血清在使用前要先試用。
　　表 2 對所有家禽黴漿菌和 Acholeplasma 提供生長發育的成份。這些是經 Frey 等和 Jordan 改良的培養基 (9.13)。
　　用棉花棒由氣管、氣囊或其它組織或從腫大的竇腔沾取 0.1ml 的液體，接種至 3~5ml 液體培養基中，然後將棉花棒丟棄。氣囊、氣管或其它組織碎片也可直接放入液體培養基中，但病材必須小量；因為組織的酵素會分解葡萄糖而造成 pH 值下降，或產生組織抑制素。因此，太大量的組織碎片將抑制其生長。有些實驗室是將病材放液培養基中做連續稀釋，就是為了避免太大量的病材產生抑制效應。有時可用瓊脂培養基和液培養基同時接種，但通常以液體培養基較為敏感。培養基通常放在 37℃ 培養就可；然而有些實驗室喜歡用蠟燭箱培養。MS、MG 和其它葡萄糖醱酵菌之培養時，是直到酚紅指示劑由紅色變橙色或黃色時，再接種至固體培養基和新的液體培養液中，不要讓液體培養基在酚紅指示劑變黃後很久仍不繼代，因為黴漿菌 ( 特別是 MS) 對低的 pH 敏感。對不醱酵者，培養 5~10 天後接種於固體培養基，並再次培養 10~14 天。瓊脂固體培養基平板可劃分區域，如此可在一個培養皿內同時培養 6~8 個病材。棉花棒或巴斯德滴管可用來接種瓊脂平板，已接種平板培養基須放置於一密閉容器中，以防止脫水。對 MM 和 M. iowae 而言，用瓊脂培養基分離比用液體培養基更容易成功。
　　瓊脂培養基用於黴漿菌菌落的檢查是用低倍 ( 約 35x) 的普通光學顯微鏡或解剖顯微鏡檢查之，多種無病原性黴漿菌如 Acholeplasma laidlawii、M. gallinarum 或 M. gallinaceum 之菌落在接種後的 24 小時便可見到，然而有病原僅 M. synoviae 須要還原型的 NAD，通常在 1 公斤培養基中添加 1% 的 NAD 和半胱氨酸各 10ml。
　　嚴重污染之檢體要分離時，每公升可添加 5ml 至 7ml 的 10% 醋酸鉈 (thallium acetate)。調配培養基時應先放醋酸鉈入蒸餾水中，以免造成蛋白質的沉澱或變質 ( 變黑 )。在嚴重污染之檢體每公升可添加 2×10⁶ 單位的青黴素和 / 或 200ml 至 1 克的 ampicillin。
　　除半胱氨酸、NAD、血清、青黴素和酵母浸液需過濾除菌外，其它培養基組成物質均可用 121℃、15 分鐘高壓滅菌製成，但根據一般經驗，上述液體培養基還是以過濾除菌之培養基，較容易增殖家禽黴漿菌。
　　新鮮的酵母浸液 ( 可購得 ) 是用 250g 的麵包用酵母粉，於一公升的蒸餾水中浸泡一小時，煮沸、放冷、以 3000g 離心 20 分鐘，取上清液以 0.1N NaOH 調整 pH 至 8.0，再以粗濾紙過濾和細濾紙除菌，然後分裝貯存於 -20℃。
　　瓊脂固體培養基可添加 1% 純瓊脂 (Ionagar #2，Noble agar 或 Difco 純瓊脂 )。部份培養基可高壓滅菌或過濾除菌，固體培養基的厚度約在 5mm。性者如 MG、MS 和 MM 在 37℃ 經 4~5 天的培養仍看不見菌落生長，但有些可在三天後出現菌落。普通由野外分離的黴漿菌菌液中大多含有多種血清型之黴漿菌存在，特別是來自商用蛋雞之檢體。大部份分離得的無病原性黴漿菌為 M.gallinarum 和 M.gallinaceum。　　

表 2 兩種常用來分離或增殖家黴漿菌培養基之組成

培養基	組成	含量
Frey's medium	Mycoplasma broth base(BBL,Cockeysville,MD) Glucose Swine serum Cysteine hydrochloride Nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) Phenol red (1%) Thallium acetate (10%) Penicillin G potassium Distilled water q.s. Ajust pH to 7.8 with 20% NaOH and filter sterilize; 4,5 PPLO broth PPLO broth without crystal violet (Difco) Glucose Swine serum Fresh yeast extract Cysteine hydrochloride Nicotinamide adenine dinucleotide(NAD) Phenol red (1%) Thallium acetate(10%) Penicillin G potassium： Distilled water q.s. Ajust pH to 7.8 with 20% NaOH and filter sterilize	22.5g 3g 120ml 0.1g 0.1g 2.5ml 2.5to5ml 10⁶units 1000ml 14.7g 10g 150ml 100ml 0.1g 0.1g 2.5ml 2.5to5ml 10⁶ units 1000ml

病原鑑定
　　菌落細小、平滑、緻密直徑 0.1 至 1mm，中央突起。雖然生化反應 ( 表 1) 有時侯是可用的，但分離鑑定通常是用血清學方法，( 用由兔製備而來的高度免疫血清 )(22)。對大部份試驗而言，確定抗血清中不含抗黴漿菌增殖用的血清的抗體是很重要的。這可藉由製備免疫用抗原時在其培養液中含有免疫動物血清的抗原來完成。然而，大部份的情形是在抗原生產的培養基中添加另一種非培養液中一般添加於黴漿菌培養基的血清來達成。例如，用含牛血清的培養基生長的抗原，可用於免疫兔子，而一般培養基中則含豬血清。
　　或許大部份用來鑑定黴漿菌的方法是生長抑制法。瓊脂培養基表面通常劃上適量的病材(通常液體培養液 1：10~1：1000 稀釋；而太多量的病材會導至假陰性 )，並且將特異性高度免疫血法的濾紙片放在表面。經過在 37℃ 數天的培養，若形成一抑制圈包圍在濾紙片的周圍者之陽性之示。其它常用的方法是免疫擴散法 (20)。在液體培養基生長的未知分離的純培養物，以遠心採收，並以冷凍解凍或超音波盪處理。將未知抗原放於已知高度免疫兔血清的對面孔洞中。呈陽性反應時，抗原與抗體內會形成一條或更多的沉澱帶。生長抑制免疫擴散的方法皆需純菌落以得到最高準確性。菌落可用巴斯德滴管，從固體培養基吸取並分離單獨菌落至液體培養基而純化之。在液體培養基充足生長後，液體培養基須經 0.45μm 濾紙過濾，剔除其它的菌塊並重新接種於瓊脂培養基。菌落須經三次的單株化 (cloned) 純化才能確定為純粹菌種。
　　在許多實驗室，以直接免疫螢光抗體法為對家禽黴漿菌的鑑定分離中較喜歡用的方法(10.23)；。然而亦有實驗室則比較喜歡用間接螢光法。螢光色素和特異性高力價的兔血清結合成為標示抗體。滴 2 ~3 滴稀釋的螢光標示抗體於塑膠圓環內有可疑菌落的瓊脂培養基上，在 37℃ 培養 30 分鐘。接著在圓環內添滿磷酸緩衝液 (PBS pH 7.2)，再吸出 PBS，經染色的瓊脂圓柱 ( 含菌落 ) 可放在玻璃載玻片上，並以 30~100x 螢光顯微鏡檢查，顯微鏡裝備有紫外線光源，可穿過一暗視野聚光器，以產生螢光；含菌落之瓊脂圓柱面必須朝向 UV 光源。螢光顯微鏡應裝備有白熱光線，容易尋找焦點和找出菌落之所在，然後將光源轉至 UV，以檢查菌落的發螢光性。Epi-fluorescense 也可以操作良好；須注意菌落要朝上。免疫螢光法的優點為正確、快速性 ( 分離物可在 1~2 小時檢查出來 )，也可有效的用於混合菌落。
　　各株 MG 間在毒力和抗原性的方面差異很大。各菌株間的差異性可藉由黴漿菌蛋白聚乙醯胺膠體電泳 (PAGE)，DNA 限制內核 (16) 的分析和 Southern 墨點雜交 (blot hybridization) 方式 ( 用由黴漿菌的核醣核酸基因製備的 DNA 探針 (probe)(27) 來鑑定 )。這些技術或許可應用於流行病學上做各株的鑑別。對於 MS、MM 和其他家禽黴漿菌也有相同菌株的變異性。MG 已有株的特異性及種的特異性的 DNA 探針，所以未來用於臨床材黴漿菌 DNA 的快速偵測，將是可行的。

血清學診斷
　　血清學檢查是自每州自願控制計畫和部份美國全國家禽改進計畫 (24)。禽類是否感染病原性黴漿菌的篩選一般是用血清平板凝集 (SPA) 試驗 (24)。通常，雞在產蛋前，檢測 10% ( 或至少 300 隻雞 )，在受檢後的每 60~90 天，每一雞群再檢測 30 隻。血清學檢驗通常作為實驗室輔助診斷用。SPA 試驗是快速、經濟及高敏感性的試驗。雞隻在感染後的 7~10 天可被檢測出陽性反應。本試驗使用經特殊染色的抗原：MG、MS 和 MM，抗原可用商品化的 (Salsbury Laboratories、charles city、IA 和 Intervet America、Millsboro、DE)。大約 0.02ml 的血清和 0.03ml 的抗原在玻璃平板混合。經過 2~3 分鐘的搖盪，便可檢查出有無肉眼可見的凝集塊 (24)。通常，Intervet 的抗原比 Salsbury 的較具特異性 (2)，但每批抗原都有不同的敏感性和特異性。有時侯，凝集試驗在檢測火雞 MS 的抗體上較不敏感。
　　 SPA 試驗最大的缺點是特異性低 ( 假陽性反應 )。儘管假陽性反應有時侯不能解釋，但與培養基的成份，主要是和用來製備抗原的附著於黴漿菌表面的血清成份有關 (2)。假陽性反應通常發生在雞或火雞接種非活化油質疫苗時，特別是疫苗中殘留有血清 (11)。而這種假陽性反應在接種後將持續 4~8 週或更久。用人造血脂 (lipsomes) 取代血清，培養黴漿菌，將有助於凝集抗原特異性的改善 (1)。況且，假陽性反應和培養基的成份有關，有黴漿菌種類或黴漿菌和細菌間也存有交叉反應抗原，應以血球抑制凝集試驗或其它可接受的血清學試驗，或藉助培養方式以證實陽性或陰性。有些實驗室喜歡用血清稀釋的 SPA　法來證實反應。血清用 PBS 作連續兩次稀釋，稀釋血清則用 SPA 來測試。血清若以 1：8 或 1：10 或更高倍稀釋仍有反應時，便為陽性反應。總之，SPA稀釋系統操作雖良好，但要注意的是弱而具特異性 SPA 反應者，在血清稀釋時，也可能是陰性，且強的假陽性在 1：8 或更高倍稀釋時仍有可能發生。
　　平板凝集反應陽性者通常需用HI試驗來證實。抗原製備時，可用離心的方式採收生長的培養液，並以少量的 PBS 打散菌塊，再與等量的甘油 (glycerol) 混合。並在 -70℃ 冷凍保存。MG、MS、MM 的 HI 試驗步驟和其它的 HI 步驟 (24) 不同，步驟如下：通常用微量盤 (microtiter plates) 操作，用 4HA 單位的抗原，並單 β 方式 ( 固定抗原 - 稀釋血清 ) 來進行，雖然在操作時，抗原的濃度可以減少，以增加敏感性 ( 只要陰性對照組血清一直保持陰性 )。首先用 PBS 作血清稀釋 (1：10)，並當作血清對照組。所有高血清稀釋液直接和抗原反應。有些批號的抗原和陰性血清 1：20 至 1：40 時，仍會有低力價反應。在這種例子，抗原強度應該增加使之足夠以降低其敏感性。同樣的，陽性結果判讀僅在血清凝集 100% 被抑制者，以減少非特異性反應。通常， HI 力價在 1：40 至 1：80 或更高時視為陽性，但結果的判定，應以一雞群為基礎。HI 試驗被認為是較 SPA 試驗的特異性高，但敏感性較低。雞隻在感染 3 週後或更久，仍呈非陽性反應。另外，MG 各株間，抗原性差異也可用 HI 測試。由一種 MG 菌株所製備的抗原有時並不能檢測出感染雞體中所有不同的菌株感染所形成的HI抗體 (7)。
　　酵性結合免疫試驗 (ELISA)，在許多實驗室已經被發展出來 (12.21)，且商業化的診斷 kit 也可購得。這種系統可檢測 MG 或 MS 的抗體。如同HI試驗。不幸的，和凝集試驗一樣有假陽性反應，但這可藉備抗原的改善而排除。
　　通常黴漿菌病之血清學試驗並不能作為鑑定診斷，特別是平板凝集反應陽緎，甚至 HI 試驗也是一樣，這時最好進行黴漿菌的分離和鑑定來確定之。MG、MS 和 MM 以外之家禽漿菌不能用血清試驗來做鑑定。

病理學診斷

(六)

確診依據：

　　家禽黴漿菌的感染容易和其它呼吸器疾病發生混淆，且呼吸疾病和 ND 或 IB 感染之後才會明顯的顯現出來。細菌二次感染常造成氣囊炎；而 E.coli 是細菌中最常被分離到的併發病原。當火雞有氣囊炎或呼吸器疾病出現時，首先必須澄清有無 MG 感染，因為感染症容易和流行性感冒、鸚鵡病、新城雞瘟、家禽霍亂或呼吸器隱孢子蟲症發生混淆。
　　水腫性關節炎病杜的產生被認為是由 MS 的感染。但應和傳染性關節腱炎、葡萄球菌症或其它細菌感染作區別。當幼齡火雞發現氣囊炎或生長遲滯或有骨骼問題時，應考慮是 MM 的感染。在火雞孵化率減低，且有胚胎晚期死亡時，M. iowae\A_；感染應予澄清，因為 M. iowae 與低孵化率有很高的關聯性。

(七)

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