口蹄疫
- 作者
- 林榮培
- 建立日期
- 96年01月11日
- 更新日期
- 96年01月11日
- 內容
口蹄疫病毒分離及鑑定標準操作程序 （以下簡稱本標準） 所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行口蹄疫實驗室診斷標準操作時所必須之程序，以確保檢驗水準之一致。目的 名詞定義 1. 口蹄疫： 口蹄疫 (Foot and mouth disease；FMD) 是一種極急性、高度傳染性疾病，感染對象為偶蹄類動物，以口、鼻、舌、趾、蹄冠、乳房及乳頭部皮膚產生水泡然後糜爛為其特徵，感染動物之產肉能力、產乳能力大幅下降，並會造成年幼動物之大量死亡。由於此病可藉接觸與空氣而傳播，可以說是世界上所有重要畜產國家高度嚴防的主要傳染性疾病，也是國際貿易中各國動物檢疫的首要傳染性疾病，國際畜疫會將之列為最重要的15種A表疾病之一，我國動物傳染病分類亦列為甲類疾病。 2. 口蹄疫病毒： 口蹄疫是由一種RNA病毒Picornaviridae之Aphthovirus所引起，共有 O 、 A 、 C 、 SAT1 、 SAT2 、 SAT3 、 Asia-1 等七種血清型，又可分為81種以上之亞型，各血清型別間無交叉免疫保護效果。病毒直徑約23nm，表面共有4種主要的結構蛋白質：VP1、VP2、VP3、VP4，已知VP1能產生中和抗體。本病毒一般不耐酸也不耐鹼，pH＜6或pH＞9的環境足以殺死病毒。低溫可存活很久 (0℃下可長達數年)，溫度越高抵抗性越低。肉類加熱處理超過攝氏80度很快可以把病毒殺死。 設施及材料 (1) 實驗室：符合國家安全標準III級實驗室 (2) 高速離心機：Kubota 1300 (3) 離心機：Hermle ZK364 , Jouan C412 (4) 桌上小型離心機：KM-15200, Kubota (5) 顯微鏡：Zeiss, Germany (6) 恆溫箱：SHEL LAB model TC2323 (7) 水浴槽：Hotech, water bath 810 (8) 口蹄疫病毒株：O / Taiwan / 97 ，1997年台灣分離株。 (9) ELISA kits：英國坡布萊口蹄疫世界參考實驗室供應。 (10) 豬水 
病病毒株:1997年高雄分離株(11) ELISA reader：MRX 美國出品。 (12) 振盪器：VORTEX GENIE-2 (13) 自動控溫循環機：Perkin Elmer Cetus 9600 (14) 酸鹼值測定器 (pH Meter)：Basic Model 321 (15) 乳缽和乳棒：台製 (16) 玻璃粉：台製 (17) 甘油：Merck (18) NaCl：Merck (19) 碳酸鈉：Merck (20) 碳酸氫鈉：Merck (21) ELISA 專用 96 孔盤：Nunc Immunoplate (22) 酵素結合免疫吸附試驗相關設備：1-20 mL 微量分注器、8 爪或12 爪微量分注器、未被覆抗原抗體之96 孔微量免疫盤 (23) 酵素結合免疫吸附試驗相關試劑：
Ortho-phenylenediamine (OPD)：Sigma
3,3'5,5'-Tetramethyl Benzidine (TMB)：PIERCE
雙氧水(Merck)、硫酸液 (Merck)、脫脂奶粉 (Marvel)(24) 核酸萃取相關試劑：
Trizol reagent (GIBCOBRL)、ethanol (Merck)、chloroform (Sigma)、isopropanol alcohol (Merck)、diethyl pyrocarbonate (Sigma)(25) PCR反應相關試劑：
2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate (Pharmacia)、DyNAzyme DNA Polymerase (FINNZYMES)、rRNasin (Promega)、AMV Reverse transcriptase (Promega)、primer、Template DNA(26) 細胞培養液：
每包 1 公升裝 MEM 鹽基粉末(Gibco)加入滅菌再製蒸餾水至 1 公升。經溶解後加入 2.3 gm 的 NaHCO3，以 0.22μM Millipore 過濾並分裝於 500 mL 血清瓶內，TSA Agar無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。(27) 細胞生長液每 100 mL MEM 細胞培養液內加入8 mL 胎牛血清(8 %) 及抗生素(Penicillin 100 U / mL 和Streptomycin 100 μg / mL)，供細胞增殖培養用。 (28) 細胞維持液係於每 100 mL MEM 細胞培養液內加入 2 mL 胎牛血清 (2 %) 及抗生素(同細胞生長液)，供細胞維持用。 (29) 磷酸緩衝食鹽溶液：
加蒸餾水至1,000mL 以121 ℃ 15 lb/CM2高壓滅菌20分鐘。並以T.S.A. Agar 作無菌檢定。NaCl (Merck) 8.0 gm KCl (Merck) 0.2 gm Na2HPO4.7H2O (Merck) 2.172 gm KH2PO4 (Merck) 0.2 gm 初代分離培養樣品採集與處理 1. 水泡液及水泡上皮之採取： 供診斷用之病材以未破或剛破不久之水泡上皮最好(最少要採1 gm)，水泡液(儘量採至1 mL) 也可。水泡上皮需置於5 mL可密封之塑膠無菌瓶，並加入輸送液2 mL (如附錄一之一)，如無輸送液，可以細胞培養液 (不加胎牛血清，如附錄一之七) 或磷酸鹽緩衝 (phosphate buffer saline； PBS)，最佳pH值需為7.2～7.6 (如附錄一之四) 代替。病材須馬上冷藏(8 ℃以下)，並於12小時內連同病歷表專人送達前述之負壓隔離密閉診斷實驗室。 2. 咽喉食道液之採取： 如果無法採到水泡上皮或水泡液時，例如發病前、恢復期或是可疑患畜，則必須採取咽喉食道液(oesophageal-pharyngeal fluid，簡稱OP液)，使用食管探子(probang) 採集，採取後，倒入20 mL廣口瓶，並檢查其內容，如混有反芻之食物或血液則必須丟棄並重新採取，取2 mL與等量之OP液用輸送液(如附錄一之二)混合，最終之pH值須在7.6左右為佳，咽喉食道液採取後必須馬上冷藏(8 ℃以下)或冷凍，如以乾冰冷凍須密封，以防止二氧化碳 (CO2) 之滲入而使酸度增加，因口蹄疫病毒對酸很敏感。 口蹄疫病毒之鑑定 1. 株化細胞分離病毒與同定： (1) 收到病材時先於登記簿上（如附錄二）登記，然後以試紙檢測其pH值並登記於登記簿上，無菌操作取出病材，瀝除輸送液，稱重後以乳缽研磨再以0.04 M PBS（如附錄一之四）製成10倍乳劑，1000 xg離心10分鐘，取上清液保存於4 ℃供病毒分離或酵素結合免疫吸附試驗用，但不可超過二天，長期保存則保存於-70 ℃。 (2) 上述病材上清液或水泡液，接種於已形成單層細胞之初代牛甲狀腺細胞，初代牛、豬、小羊之腎臟細胞，或是BHK-21、IB-RS-2、ESK等株化細胞，病毒量少時，初代細胞較株化細胞敏感。 (3) 細胞可用角瓶等培養，培養的方式是細胞以6孔組織培養盤增殖成單層細胞後，再接種1~2 mL的病材液進行吸著反應一小時。以PBS洗滌後然後再加入細胞維持液 3 mL，置入 37 ℃ 5 % CO2 恆溫箱中培養。 (4) 接種後每天以顯微鏡觀察其有無細胞病變 (cytopathic effect；CPE) 產生。產生細胞病變者，其特徵為折射(refractility)、細胞圓形化 (cell rounding)、細胞的延長細胞質橋(星狀細胞)回縮。可取病毒液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒，或以下述之酵素結合免疫吸附試驗，鑑定其是否為口蹄疫，並鑑定其血清型別。 (5) 若5天仍無CPE則須再繼代，而以第一代培養細胞經冷凍解凍、離心後，上清液用來繼續接種新的單層細胞。並以 (2) 之方法進行觀察與鑑定。 2. 酵素結合免疫吸附試驗 試劑由位於英國坡布萊的口蹄疫世界參考實驗室提供，可以用來檢測病材中之口蹄疫病毒並鑑定血清型別，目前由該實驗室所提供之試劑套組可以檢測鑑定的血清型包括O、A、C、Asia-1及豬水 病。其方法如下：
(1) 先將兔抗各種血清型口蹄疫病毒及豬水病病毒之血清依說明書，適當稀釋於被覆緩衝液 (coating buffer，如附錄一之八) 後，被覆於96孔ELISA免疫盤，每孔50 mL，密封後置37 ℃感作一小時或置4 ℃感作一夜，以清洗液（如附錄一之十一）清洗五次，甩乾。 (2) 加入病材乳劑50 mL、陽性對照及稀釋液A（如附錄一之九，作為空白對照）各50 mL。置37 ℃持續搖擺感作一小時（搖擺頻率每分鐘120次），感作後以清洗液清洗五次，甩乾。 注意： A. 所用的平台搖擺機，要有效的完全混合，且不得將內容物濺出。 B. 若沒有平台搖擺機時，可用手打方式，輕敲盤子四周，以使反應物均勻混合。 C. 如96孔ELISA盤在恆溫箱中的搖擺機上需重疊時，則僅蓋上最上面的一盤，而此種情形可能造成熱差度效應及蒸氣，最好不要重疊。 D. 從盤子中倒出的內容液及清洗液，必須倒入含0.2 % 枸椽酸之消毒液 (如附錄一之十二) 的桶或槽中消毒，而碰到盤中試藥的可丟棄式滴頭，也要以此法消毒。 (3) 再加入天竺鼠抗各血清型口蹄疫病毒及豬水病病毒之血清各50 mL，同樣置37 ℃感作一小時後，以清洗液清洗五次，甩乾。 (4) 加入酵素連結之兔抗天竺鼠血清50 mL，置37 ℃感作40分鐘，以清洗液充分清洗五次，甩乾。 (5) 加入受質及呈色劑（如附錄一之十四、一之十五，例如6 mL呈色劑加30 mL受質）50 mL，作用15分鐘，最後加入停止液50 mL。 (6) 置ELISA判讀機以 492 nm波長檢測其吸光值（OD值），平均吸光值扣除背景值後大於0.1者為陽性，接近0.1者，須再重測或以細胞培養觀察其有無細胞病變產生。有細胞病變者需再以酵素結合免疫吸附試驗確定其血清型。 參考文獻： Roeder P.L. & Le Blanc Smith P.M. (1987). The detection and typing of foot-and mouth disease virus by enzyme-linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis. Res. Vet. Sci., 43, 225-232. 3. 反轉錄聚合酶鏈反應 (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction；RT-PCR) 檢測病毒核酸： 反轉錄聚合酶鏈反應技術已被應用在口蹄疫的診斷上，利用特別設計的特異性引子對（pairs of primer）已能區別口蹄疫病毒中的O、A、C及Asia-1等四種血清型病毒，配合豬水疱病特異性引子，可從水疱性疾病中區別口蹄疫病毒及豬水疱病毒。 (1) 區別診斷口蹄疫四種血清型及豬水疱病毒之引子序列如下: 引子 P33序列為5'-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3' (antisense) 引子 P33序列為5'-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3' (antisense) 引子 P38序列為5'-GCTGCCTACCTCCTTCAA-3' (sense ) 引子 P87序列為5'-GTCATTGACCTCATGCAGACCCAC-3' (sense ) 引子 P40序列為5'-GTTTCTGCACTTGACAACACA-3' (sense ) 引子 P74序列為5'-GACACCACTCAGGACCGCCG-3' (sense) 引子 P7序列為5'-TGCAATCACACCTGGCAATGGT-3' (antisense) 引子 P8序列為5'-TGACTGAAGGGTAGGACAGAT-3' (sense) (a) 引子 對p33與 p32之組合為廣泛性引子，可增幅口蹄疫病毒中O、A、C及Asia-1四種血清型，並產生長度為131 bp之單一條RT-PCR產物，但無法增幅豬水疱病毒。 (b) 引子對p 33 與 p 38之組合為特異性引子，可增幅口蹄疫O型病毒，並產生長度為401 bp 之單一條 RT-PCR產物。 (c) 引子對p33 與 p87之組合為特異性引子，可增幅口蹄疫A型病毒，並產生長度為728 bp 之單一條RT-PCR產物。 (d) 引子對p33 與 p40之組合為特異性引子，可增幅口蹄疫C型病毒，並產生長度為593 bp之單一條 RT-PCR產物。 (e) 引子 對p33 與 p40之組合為特異性引子，可增幅口蹄疫Asia-1型病毒，並產生長度為293 bp之單一條 RT-PCR產物。 (f) 引子對p7與p8之組合為特異性引子，可增幅豬水 病毒，並產生長度為216bp之單一條RT-PCR產物，但無法增幅口蹄疫病毒。(2) 其試驗步驟如下： A. RNA之萃取 (a) 取100 μL 水疱液或上皮病材懸浮上清液置於1.5 mL微量離心管中，加入1 mL TRIzol RNA 萃取劑劇烈震盪 (vortex) 30秒後靜置室溫5分鐘。 註：每次反應皆須包括陽性對照及陰對照。 (b) 加入200 μL 氯仿 (chloroform) 以手壓住微量離心管頂蓋，劇烈震盪15秒後靜置室溫3分鐘，於4 ℃ 12,000 xg離心15分鐘。 陽性對照：口蹄疫病毒O型採O / Taiwan / 97 病毒株。A , C , Asia-1三型病毒，則採用英國坡布萊口蹄疫世界參考實驗室(Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, UK) 所提供的間接三明治式酵素結合免疫吸附試驗之口蹄疫抗原診斷盒中的標準抗原。豬水 病病毒株則採用1997年高雄分離株。陰性對照：不含病毒RNA，以12 μL蒸餾水代替，其餘皆與試驗組相同。 (c) 小心吸取上清液 (約500 μL) 與等量異丙醇 (isopropyl alcohol) 混合完全後靜置室溫10分鐘，於4 ℃ 12,000 xg離心15分鐘。 (d) 去上清液，加入1 mL 75 ﹪乙醇 (alcohol) 經搖動後於4 ℃ 7,500 xg離心5分鐘後去上清液。 (e) 經短暫離心後，以10 μL滴管頭 (Tip) 將殘餘液體吸乾(小心不要攪動RNA團塊)。靜置5至10分鐘風乾。 (f) 經乾燥之RNA團塊加入60 μL 經DEPC處理過之二次蒸餾水（如附錄一之十七）溶解RNA，可立即使用或保存於-70 ℃中備用。 B. 反轉錄聚合酶鏈反應(Reverse-transcription polymerase chain reaction；RT - PCR) 本試驗採一步反應 (one step reaction) 即反轉錄作用(reverse transcription；RT) 及聚合 
鏈作用 (polymerase chain reaction；PCR) 在同一支反應管內進行，所需的試劑同時加在同一支反應管內，其特點為操作簡便，可節省時間及人力。
(a) 配製反應液：(每一支反應管包含以下反應試劑)
反應總體積：100 μldNTP(1.25 mM) 16 μL 10X buffer (Prozyme buffer) 10 μL r RNasin 0.4 μL AMV (Reverse-transcriptase) 0.4 μL Dynazyme (DNA polymerase；2U /μL) 1 μL Primer (sense antisense mix 50 p mol/μL) 1 μL RNA template 12 μL DDW (RNase free) 59.2 μL (b) 反應條件： 反應液混合均勻後隨即放入熱循環器中，先以42 ℃進行40分鐘反轉錄作用後直接進行聚合 鏈反應，反應條件如下：
C. 瓊脂膠電泳 (a) 取2公克瓊脂膠 (Agarose) 加入100 mL之1 X TAE電泳緩衝液配製成2 ﹪瓊脂膠溶液，以微波爐加熱溶解瓊脂膠直到呈現完全透明狀態。 (b) 置於55 ℃恆溫水槽中，待內外溫度平衡後加入50 ng/ml之溴化乙醯液 (ethidium bromide) 並混合均勻。 (c) 將膠液倒入製膠台中，插入電泳梳 (comb) ，待膠液冷卻凝固後拔出電泳梳。 (d) 將膠片裝入塑膠袋密封後放入不透光紙袋內，置入4 ℃冰箱中保存。 D. 電泳分析 (a) PCR反應產物取出10 μL預先與2 μL之6倍載入緩衝液(loading buffer) 混合均勻後注入齒槽洞中，最後一孔加入5 μL之DNA梯形標誌。 (b) 將電極選定為"-"極到"+"極，以100伏特電壓泳動20分鐘。 (c) 電泳完畢後將膠片置於UV透視燈下觀察，陽性樣品及陽性對照組會因不同引子組合而出現不同長度之RT-PCR產物。其中引子p33，p32組合之產物長度為131 bp；引子p33，38組合之產物長度為401 bp；引子p33，p87組合之產物長度為728 bp；引子p33，p40組合之產物長度為293 bp；引子p7，p8組合之產物長度為216 bp。陰性樣品及陰性對照則無RT-PCR產物出現。 參考文獻： W. Vangrysperre and K. De Clereq (1996) Rapid and sensitive polymerase chain reaction based detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch Virol 141:331-344
檢測抗體可用中和抗體試驗及酵素結合免疫吸附試驗。酵素結合免疫吸附試驗有較為敏感、可大量檢測、時間較短、不需細胞培養系統等優點，適合無細胞培養設備之實驗室。証明抗體 1. 血液之採取： 以10 mL塑膠注射筒(不加抗凝劑)由頸靜脈採取5 mL的血液，裝於塑膠無菌試管連同病歷表送檢，血液只可冷藏不可冷凍。 2. 中和抗體檢測： 細胞可使用BHK-21、IB-RS-2株化細胞，或小牛、小羊或豬之初代腎臟細胞。96孔微量培養盤，加8 % 胎牛血清之細胞培養液（如附錄一之七）等為必需品。種毒 (K4)先接種於已形成單層細胞之BHK-21等細胞，產生細胞病變後收集之，加入50 %甘油。測定力價後，分裝保存於 -20℃，可維持約一年，如保存於-70 ℃，可維持更長。血清以56 ℃ 30分鐘不活化之，陽性對照血清採取21天恢復期之豬血清，並以無特定病原（Specific pathogen free；SPF）豬血清作陰性對照。 (1) 血清以細胞培養液稀釋，由1/4稀釋起，以2倍序列稀釋，每一稀釋做二重覆，每孔量50 mL。 (2) 加入100 TCID50 (50 % tissue culture infective dose) 之病毒每孔50 mL。 (3) 對照血清包括已知力價之陽性血清、陰性血清，尚須細胞對照、培養液對照及病毒對照。 (4) 蓋上蓋子置37 ℃感作一小時。 (5) 加入100 mL之細胞懸浮液 (細胞數為106 cells / mL)，置37 ℃二氧化碳培養箱靜置培養。 (6) 48小時後即可以判定其細胞病變現象並計算其力價。 (7) 1 / 45以上或等於1 / 45者為陽性反應，1 / 11以下或等於1 / 11者為陰性反應。 3. 酵素結合免疫吸附試驗抗體檢測： (1) 先將兔抗各種血清型口蹄疫病毒之血清溶於被覆緩衝液(血清與被覆緩衝液之比為1：1000) 後被覆於96孔ELISA盤每孔50 mL，密封後置4 ℃一夜。 (2) 測試血清與對照血清皆稀釋十六倍 (對照血清C++、C+、C-為15 mL之對照牛血清加入225 mL的稀釋液A(如附錄一之九)中，測試血清則為10 mL加入150 mL稀釋液A中，C++、C+、為各型陽性血清)。血清稀釋後各吸50 mL移入96孔U型微量盤。然後每孔加入口蹄疫抗原50 mL，輕敲盤緣與前述稀釋血清50 mL充分混合，置4℃一夜。 參考文獻： 1. Hamblin C., Barnett I.T.R. & Hedger R.S. (1986). A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods, 93, 115-121. 2. Van Maanen C. (1990). A complex-trapping-blocking (CTB) ELISA, using monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies directed against foot and mouth disease types A, O and C. 1. Method and characteristics. Vet. Microbiol., 24, 171-178. Van Maanen C. (1990). A complex-trapping-blocking (CTB) ELISA, using monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies directed against foot and mouth disease types A, O and C. 1. Method and characteristics. Vet. Microbiol., 24, 171-178. (3) 清洗：將(1)之96孔ELISA盤之內容物甩至容器槽，以吸水紙瀝除餘液，以清洗液（如附錄一之十一）將每個小孔注滿後，再將清洗液甩掉，以吸水紙瀝淨，共重複清洗三次。清洗時不得讓96孔ELISA盤之各孔乾凅。 (4) 將50 mL的血清抗原混合液轉置至ELISA盤 (轉置每個血清抗原混合液樣本時要換用新的滴頭)，並標記相對位置，接著把96孔ELISA盤封蓋起來，置37 ℃恆溫箱內的平台搖擺機上，持續搖擺感作1小時(搖擺頻率每分鐘120次)。 注意： A. 所用的平台搖擺機，要有效的完全混合，且不得將內容物濺出。 B. 若沒有平台搖擺機時，可用手打方式，輕敲盤子四周，以使反應物均勻混合。 C. 如96孔ELISA盤在恆溫箱中的搖擺機上需重疊時，則僅蓋上最上面的一盤，而此種情形可能造成熱差度效應及蒸氣，最好不要重疊。 D. 從盤子中倒出的內容液及清洗液，必須倒入含0.2 %枸椽酸之消毒液 (如附錄一之十二) 的桶或槽中消毒，而碰到盤中試藥的可丟棄式滴頭，也要以此法消毒。 (5) 利用此一小時空檔配製稀釋緩衝液B (如附錄一之十)以供下一步驟用。 (6) 在血清抗原混合液感作終止之前，先以稀釋液B將保存的同源偵測抗體(天竺鼠抗口蹄疫病毒各血清型抗體)稀釋100倍，其體積量要足夠所使用的96孔ELISA盤數。將剩下的偵測抗體立即放回4 ℃保存。 (7) 血清抗原混合液感作一小時後，依前述方法，以清洗液清洗三次。 (8) 在清洗後每孔立即加入50 mL的100倍稀釋偵測抗體，再輕輕拍打ELISA盤四周確定偵測抗體均已完全分佈於每孔底部，再將之封蓋後置於37℃恆溫箱的搖擺機上，持續搖擺一小時。 (9) 在偵測抗體感作終止之前，先以稀釋液B將酵素連結之兔抗天竺鼠血清稀釋200倍，其體積要足夠所用於檢測的96孔ELISA盤。剩下的酵素連結兔抗天竺鼠血清立即放回-20 ℃保存。 (10) 偵測抗體感作一小時後，以上述方法用清洗液清洗三次。 (11) 清洗後每孔立即加入50 mL之200倍稀釋酵素連結兔抗天竺鼠血清，並輕拍盤子四周，確定酵素連結兔抗天竺鼠血清都完全落於每孔之底部，再將盤子封蓋後置於37℃恆溫箱中搖擺感作一小時 (用剩之酵素連結兔抗天竺鼠血清液暫不要倒掉，受質／呈色劑製備液也暫不要丟棄，因若判讀出現問題時，這些剩餘試液將可用來檢查酵素及受質的活性) 。 (12) 在酵素連結兔抗天竺鼠血清感作終止之前，須先準備受質／呈色劑溶液，其量要足夠所檢測的盤數，OPD的濃度為3.3 mM，H2O2是4.4 mM (如附錄一之十四、一之十五，例如6 mL呈色劑加30 mL受質)。最後的受質／呈色劑溶液必須是無色的，且需存放於暗處，如有色澤呈現，則必須丟棄。 (13) 取一塊乾淨沒有被覆抗體的96孔ELISA盤，以之當作ELISA判讀機判讀時的背景盤(此盤用完後可清洗，並可留作往後測試時的背景盤用)。 (14) 於酵素連結兔抗天竺鼠血清感作1小時後，以前述方法清洗96孔ELISA盤三次，要確定所有孔洞均完全被清洗液沖洗，以清除無反應之酵素連結兔抗天竺鼠血清。 (15) 由空白對照盤開始每孔加入受質／呈色劑50 mL，並於加第一孔時即開始計時，置室溫15分鐘。 (16) 15分鐘後由空白對照盤開始加停止液(如附錄一之十六)，每孔50 mL，置搖擺機使混合均勻。 (17) 置ELISA判讀機以波長492 nm讀取其吸光值及計算其PI值，PI值大於50為陽性。