假性狂犬病
- 作者
- 鄧明中
- 建立日期
- 96年01月11日
- 更新日期
- 96年01月11日
- 內容
假性狂犬病實驗室診斷標準操作程序（以下簡稱本標準）所制定之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行假性狂犬病病毒分離及鑑定操作時所必需之程序，以確實防止病原的外洩。目的 名詞定義 1. 假性狂犬病： 假性狂犬病（Pseudorabies）亦稱Aujeszky's disease，係由假性狂犬病病毒所引起之急性豬隻傳染病。自然感染常見於豬、牛、羊、犬及貓。病毒存在於唾液、分泌物及排泄物中，主要經由口鼻接觸感染。豬隻感染本病毒其臨床症狀及病變會隨著年齡層而不同。假性狂犬病主要引起中樞神經系統、呼吸系統與生殖系統障礙為主，發病率及死亡率均高，臨床上由甚急性至不顯性感染均有可能發生。 2. 病原： 病毒屬於阿爾發疱疹病毒（Alphaherpesvirus）所引起。具有完整封套，病毒顆粒直徑大小約為180 nm，封套中含有9種結構蛋白（Structural protein）；福馬林、苛性鈉及一般兩性消毒劑皆可有效殺死病毒。豬、草食獸及肉食獸為主要之感染動物，除了人以及大多數高等靈長類動物外，幾乎所有的動物均具有感受性。 3. 臨床診斷： 係依田間罹患豬隻之感染率和死亡率的高低以及發病症狀如：新生小豬大量死亡、患仔豬出現神經症狀、肥育豬呈現精神不濟及肺炎症狀以及母豬有流死產等繁殖障礙等作疾病初步之判定。假性狂犬病和豬瘟在臨床症狀上頗有相似之處，兩者都會產生中樞神經系統障礙及繁障之症狀。而與日本腦炎等則於母豬流死產之繁殖障礙方面則易混淆，因此必須有賴實驗室的區別診斷。 4. 實驗診斷： 可將病材乳劑接種於健康小白兔，或將病材乳劑接種於PK-15細胞株進行病毒分離；或者將送檢和採集臟器作抹片或冷凍切片的螢光標示抗體染色，檢測組織內之病毒抗原；或者以聚合酶鏈反應檢測病毒之去氧核醣核酸基因。 設施及材料 (1) 實驗室：符合國家安全標準之實驗室 (2) 高速離心機：最高速85,000 rpm、具低溫控制，如：Himac SCP 85H2, Hitachi或同級品。 (3) 離心機：最高速6,000 rpm、具低溫控制，如：Hermle Z360K, BHG或同級品。 (4) 桌上小型離心機：最高速15,000 rpm 如：KM-15200, Kubota或同級品。 (5) 顯微鏡：Zeiss, Germany或同級品。 (6) 螢光顯微鏡：Leitz, Germany或同級品。 (7) 乳缽和乳棒：台製或同級品。 (8) Cytospin：Fisher或同級品。 (9) 恆溫箱：Napco, Model 600或同級品。 (10) 水浴槽：Hotech, water bath 810或同級品。 (11) 自動控溫循環機：Perkin Elmer Cetus或同級品。 (12) 酸鹼值測定器 (pH Meter)：Basic Model 321或同級品。 (13) ELISA 光度比色判讀機 (ELISA Reader)：Dynex或同級品。 (14) 可調式供電器和電泳槽：電壓可自10~300伏特調整或同級品如：Gelman。 (15) 假性狂犬病病毒株：台灣分離株 (16) 乙烯二胺四醋酸鹽 (EDTA)：試藥級如：Sigma。 (17) 玻璃粉：台製或同級品。 (18) 磷酸緩衝液：
加蒸餾水至 1,000mLNaCl (Merck) 8.0 gm KCl (Merck) 0.2 gm Na2HPO4.7H2O (Merck) 2.172 gm KH2PO4 (Merck) 0.2 gm (19) 細胞培養液：
每包 10 公升裝 MEM 鹽基粉末(Gibco ) 加入滅菌二次蒸餾水至 10 L。經溶解後加入 23 gm 的 NaHCO3，以 0.22 μm Milipore 過濾並分裝於 500 mL 血清瓶內，無菌檢定後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。細胞生長液，係於每 100 mL MEM 細胞培養液內加入10 mL 胎牛血清(10 ﹪)及抗生素（Penicillin 100 U / mL 和Streptomycin 100 μg / mL），供細胞增殖培養用。細胞維持液：
係於每100 mL MEM細胞培養液內加入2 mL胎牛血清（2 ﹪）及抗生素（同細胞生長液），供細胞維持用。(20) 豬腎細胞株之培養：
於75平方公分塑膠培養瓶長滿後，將細胞生長液倒出，並於每支塑膠培養瓶加入 5-10 mL 胰蛋白酶細胞消化液（Trypsin-Versene）沖洗一次。如此，重複沖洗二次。第二次倒出胰蛋白酶細胞消化液時，留少許消化液於塑膠培養瓶內。將塑膠培養瓶置於 37 ℃ 消化三分鐘或直至細胞脫落後，以原塑膠培養瓶生長液三倍量之細胞生長液沖散細胞並作成細胞懸浮液供用。(21) Digestion buffer：
in TE bufferProteinase K 10 mg / mL SDS 10 ﹪ (22) 25：24：1 phenol/chloroform/isoamyl alcohol：分生級或同級品如：Amersco。 (23) Ammonium acetate：分生級或同級品如：Merck。 (24) 100 ﹪ethanol：分生級或同級品如：Merck。 (25) Sodium dodecyl sufate（SDS）：分生級或同級品如：Merck (26) DNase-free之RNase：分生級或同級品如：Sigma。 (27) Dextran 150：試藥級或同級品如：Hisons, UK。 (28) 丙酮：試藥級或同級品如：Merck。 (29) 甘油：試藥級或同級品如：Merck。 (30) Taq DNA 聚合酶和 10 X 聚合酶鏈反應緩衝液：（Protech）1.25 mM dNTP 混合溶液：在 360 μL 無菌蒸餾水中，各別加入 10 μL 濃度為 50 mM 的 dATP，dCTP，dGTP 和dTTP分生級或同級品如：Pharmacia。 (31) 引子序列及溶液濃度：50 pmol / μL引子1，序列為：5'-TACCCTGCCAGCGCCATGCTG -3'（正鏈）引子2，序列為 5'-GGAAGAAGATGTAGACGCACA -3'（負鏈）。 (32) 載入緩衝液（loading buffer）：為含 0.25 ﹪ Orange G 之 30 ﹪ 甘油溶液。 (33) 50 X TAE 緩衝液：供洋菜膠片配製用。配方：0.04 M Tris base； 0.04 M acetic acid； 0.001 M EDTA，pH 8.0。 (34) 標記 DNA（Marker DNA）：市售不同分子量的DNA 標記溶液，為 100 bp Ladder 標記 DNA。分生級或同級品如：Gen Sura Lab. Inc.。 (35) 蔗糖：試藥級或同級品如：Merck (36) Tris-HCl：分生級或同級品如：Sigma (37) Nonidet P-40：分生級或同級品如：Sigma (38) β-mercaptoethanol：分生級或同級品如：Sigma (39) NaCl：試藥級或同級品如：Merck (40) 碳酸鈉：試藥級或同級品如：Merck (41) 碳酸氫鈉：試藥級或同級品如：Merck (42) ELISA 專用 96 孔盤：Nunc Immunoplate (43) Tween 20：試藥級或同級品如：Merck (44) 山洋葵過氧化酶標幟蛋白 A：Caltag Lab. (45) Ortho-phenylenediamine(OPD)：試藥級或同級品如：Sigma (46) 雙氧水：試藥級或同級品如：Merck (47) 硫酸液：試藥級或同級品如：Merck (48) 抗豬免疫球蛋白螢光標示抗體：Jackson Immunoresearch (49) 標準分子量蛋白液：Bio-Rad (50) Acrylamide：試藥級或同級品如：Bio-Rad (51) N,N'-diallytartardiamide：試藥級或同級品如：Bio-Rad (52) 硝纖膜（Nitrocellulose membrane）：分生級或同級品如：Amersham (53) 甲醇：試藥級或同級品如：Merck (54) 甘胺酸（Glycine）：試藥級或同級品如：Merck脫脂奶粉：試藥級或同級品如：Marvel (55) 氯奈酚(chloranaphthol)：試藥級或同級品如：Merck (56) Whatman 1 號濾紙：Whatman (57) 疊氮鈉：Merck pH 8.6 Veronal acetate 緩衝液： Sodium barbital（Merck） 13.38 gm Sodium acetate（Merck） 8.83 gm 加入蒸餾水至 1.5 L 以濃鹽酸（HCl）調整 pH 至 8.6 (58) Agarose：試藥級或同級品如： Difco (59) 冰醋酸：試藥級或同級品如：Merck (60) Amido black：試藥級或同級品如： Leverkusen (61) 核酸萃取相關試劑：Trizol reagent (GIBCOBRL)、ethanol (Merck)、chloroform (Sigma)、isopropanol alcohol (Merck)、diethyl pyrocarbonate (Sigma) (62) PCR反應相關試劑：2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate (Pharmacia)、DyNAzyme DNA Polymerase (FINNZYMES)、rRNasin (Promega)、AMV Reverse transcritase (Promega)、primer、Template DNA 假性狂犬病病原的檢測 1. 病材的採集和輸送： 採假性狂犬病可疑病例之腦、肺臟、肝臟、扁桃腺和淋巴結等臟器一起於低溫冷藏情況下快速送抵診斷實驗室。輸送途中不宜冷凍。 2. 病材乳劑的製備及病毒分離： (1) 將病材剪切成小塊放置乳缽內，加入滅菌細沙或玻璃粉後以乳棒磨碎，再加入5-10 mL含抗生素之鹽類緩衝液或細胞培養液。 (2) 經 1,000 xg，離心5分鐘。取出上清液供病毒分離或試驗動物接種之用。 (3) 接種豬腎細胞株（PK-15）後，24至72小時之內會出現細胞病變作用（CPE），感染細胞一開始會出現細胞堆集，最後整個細胞層會全部脫落；有時可見細胞呈融合現象（Syncytia）。若無任何細胞病變出現，則需將病材盲目繼代。 3. 動物接種試驗： 將疑似病材的上清液先予以稀釋（否則可能因病毒力價太高而在未產生搔癢症狀前兔子即暴斃），再以肌肉接種兔子，若病材中含有假性狂犬病病毒，則於接種後的2至5日內於兔子的接種部位將呈現搔癢不止之症狀。 4. 假性狂犬病螢光標示抗體染色試驗： (1) 將送檢或試驗接種豬隻臟器作冷凍切片或抹片，或者將接種乳劑之豬腎細胞株（PK-15）培養於蓋玻片上，風乾後以丙酮於室溫固定10分鐘。 (2) 滴上經適當稀釋之假性狂犬病螢光標示抗體，於37 ℃保濕盒內進行螢光標示抗體染色1小時。 (3) 同時將陽性、陰性臟器作冷凍切片和以標準假性狂犬病病毒接種豬腎細胞株之蓋玻片，經螢光標示抗體染色後作為對照參考之用。 (4) 經磷酸緩衝溶液清洗三次後，再滴一滴磷酸緩衝溶液 / 甘油混合液並蓋上蓋玻片、然後於螢光顯微鏡下鏡檢。 (5) 判讀：細胞核內呈現顆粒狀特異性螢光者判為陽性。 5. 萃取病材之總去氧核醣核酸（DNA） (1) 剪取小塊臟器放置乳缽內，加入滅菌細沙並以乳棒磨碎後加入 5-10 mL 含抗生素之磷酸緩衝溶液作成 10 % 乳劑。 (2) 吸取 200 μL 已磨碎之臟器乳劑，放入有蓋之Eppendorf 試管內，加入1 mL之Digestion buffer混合後，置於55 ℃下作用1小時。 (3) 加入等量之phenol / chloroform / isoamyl alcohol至上述混合液中，震盪混合30秒。以8000 xg或12,000 rpm於室溫下離心10分鐘。 (4) 將上層水溶液吸取至另一乾淨滅菌之 Eppendorf 試管內，隨後加入1/2體積之7.5 M醋酸銨及兩倍體積之100 ﹪酒精，立即混合均勻後靜置10分鐘。 (5) 以8000 xg或12,000 rpm（Kubota, Japan）離心10分鐘。 (6) 吸去上清液後，再加入500 μL 之70 ﹪酒精清洗DNA團塊。 (7) 離心後去上清液，於室溫下倒置試管以風乾DNA。 (8) 再以適當量之TE緩衝液完全溶解DNA團塊後，保存於-20 ℃備用。 6. 聚合酶鏈反應： (1) 依需用試管數，於每支0.75 mL 之 Eppendorf 試管內，分別加入下列試劑：滅菌蒸餾水24.5 μL，10 X聚合酶鏈反應緩衝液5 μL， 1.25 mM dNTP 混合液8 μL，引子1溶液1 μL，引子 2 溶液1μL，組織上清液 10 μL 和 Taq DNA 聚合酶0.5μL 等。 (2) 不加萃取病材核酸之對照用試管：陰性對照：依上述萃取核酸步驟萃取豬腎細胞株（PK-15）細胞或豬睪丸細胞株（ST）細胞之DNA作為陰性對照組；陽性對照，則以 2 μL 標準假性狂犬病病毒DNA 和8 μL 蒸餾水取代病材萃取之總核酸。 (3) 於每支試管混合液之上端加入60 μL礦物油。 (4) 將全部試管放入DNA自動控溫循環機，並依序進行下述反應作用。94 ℃ 5 分鐘，50 ℃ 2 分鐘和 72 ℃ 3 分鐘，單一循環； 94 ℃ 1 分鐘， 50 ℃ 2 分鐘和 72 ℃ 3分鐘，三十次循環；最後為72 ℃ 10 分鐘，單一循環。然後保持在4 ℃。 (5) 反應結束後，從每支試管礦物油下層小心抽取 10 μL 反應液，放置在另一新試管內並加入 2 μL 載入緩衝液。 (6) 混合後，逐一載入以每mL含 0.5 μg 溴化乙基啶 TAE 緩衝液配製之 1 ﹪ 洋菜膠片孔洞內。每一膠片留一孔，載入標記 DNA 溶液。 (7) 100 伏特定電壓，電泳25分鐘。 (8) 判讀：將電泳後洋菜膠片放在紫外燈光源上方觀察結果。陽性病材之聚合酶鏈反應產物與陽性對照一樣會在同一位置呈現一特異影像帶（Band）。比照標準標記DNA推算出陽性PCR 產物大小，長度為1127個 bp（Base pairs）。而陰性對照和陰性病材則無此產物。 (9) 此外，若因時效緊迫可採以下方式：剪取小塊臟器放置乳缽內，加入滅菌細沙並以乳棒磨碎後加入 5-10 mL 含 1 ﹪ 胎牛血清和抗生素之磷酸緩衝溶液作成 10 ﹪乳劑。 (10) 以500 xg，於室溫下離心 5 分鐘。吸取500 μL上清液，放入有螺旋蓋之Eppendorf 試管內並煮沸 10 分鐘 (11) 在桌上小型離心機，13,000 xg，離心5分鐘。取出上清液後即可供聚合酶鏈反應用。 7. 豬隻接種試驗： (1) 將病材乳劑上清液混合後接種於四隻試驗豬隻，其中兩隻為假性狂犬病疫苗免疫豬，而另外兩隻則未免疫豬，每一豬隻肌肉接種2mL 混合液。 (2) 接種後每日觀察接種試驗豬隻之臨床症狀並量肛溫，至接種後第 21 天為止。觀察期間，每日採血接種於豬腎細胞株。 (3) 判定：若是假性狂犬病，未免疫組試驗豬隻應 於接種後發病，有熱反應(≧40 ℃)且有明顯症狀豬隻其體內各臟器均有高力價病毒的存在。試驗接種豬發病時，或在接種後第21天試驗結束時，至少犧牲一隻試驗接種豬並採集臟器作冷凍切片螢光標示抗體染色以檢測病毒抗原，同時將臟器乳劑接種於豬腎細胞株培養以分離病毒，並採血檢測血清內抗體。 (4) 結果若為疑陽性，應再重覆繼代接種。 註：接種試驗並非絕對需要，但可作為另一項診斷依據。 假性狂犬病血清學的檢測 1. 酵素結合免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immuno-sorbent assay；ELISA)：酵素結合免疫吸附試驗，可以直接檢測假性狂犬病感染豬體內的抗體，目前已成國際貿易上一項標準抗體檢測方法。 (1) 抗原的製備： (a) 豬源腎臟細胞株（PK-15 cell lines）經接種馴化之假性狂犬病病毒（10 MOI）後，以含8 % 胎牛血清的細胞培養液培養增殖。 (b) 細胞經感染 36-48 小時後出現大量細胞病變作用產生時，將感染細胞收集起來；以磷酸緩衝溶液沖洗過後，經650 xg，離心5分鐘。沉澱細胞再以含0.34 M 蔗糖之pH 8.0，5 mM Tris-HCl溶液清洗一次，以離心方式沉澱感染細胞。以下(c) 至(e) 等三項步驟請在冰浴中操作。 (c) 沉澱之感染細胞，以含67 mM蔗糖之 pH 8.0，5 mM Tris-HCl溶液沖散後靜置10分鐘。 (d) 加入 Nonidet P-40非離子清潔劑最終濃度為1﹪(W/V)。靜置10分鐘，以溶解細胞。 (e) 加入蔗糖至最終濃度為10 ﹪（W/V）後，以1,000 xg ，離心10分鐘沉澱核酸。 (f) 取出上清液，分別加入 EDTA、β-mercaptoethanol和NaCl （最終濃度分別為2 mM，50 mM和0.5 M）後於25 ℃作用15分鐘。 (g) 將含 20 ﹪ 蔗糖（W/V）之 pH 8.0，50 mM Tris-HCl 溶液先行加入離心管內，然後沿管壁慢慢加入上述混合溶液。4 ℃，100,000 xg，1 hr。離心後即刻取出蔗糖溶液上一層抗原液，放置 -20 ℃ 冰櫃，即可供酵素結合免疫吸附試驗抗原用。 (2) 試驗步驟 (a) 抗原先以pH 9.6，0.05 M碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液適當稀釋後，於 ELISA 專用 96孔微量盤每孔加入 100 μL，將抗原覆蓋 (Coat) 於孔底。 (b) 4 ℃，感作 16 小時 (過夜) 後，以 pH 7.2，磷酸緩衝溶液清洗五次。 (c) 將欲測血清以及陽性和陰性對照血清以含0.05﹪ Tween 20 之磷酸緩衝溶液稀釋30倍。然後於ELISA抗原盤每孔加入100 μL的稀釋血清，每一稀釋血清兩孔。若將陽性和陰性對照血清分別加入 ELISA 抗原盤四處不同部位，每處各兩孔，則每盤可檢測40個血清樣品，每樣品兩孔。 (d) 將盤子放置37 ℃搖擺器上感作一小時。然後，以磷酸緩衝溶液清洗五次。 (e) 山洋葵過氧化酶標幟蛋白A經含0.05 % Tween 20之磷酸緩衝溶液適當稀釋後於每孔分別加入100 μL。 (f) 將盤子放置 37 ℃ 搖擺器上感作一小時，然後以磷酸緩衝溶液清洗五次。 (g) 在25 mL受質溶液（含 0.04 ﹪OPD之磷酸-枸椽酸鹽緩衝液）內加入10 μL雙氧水後，每孔加入100 μL受質溶液。 (h) 放置室溫約作用10分鐘。所需呈色時間依當時加入之受質溶液溫度和室溫高低而定。 (i) 每孔加入100 μL之 1 M硫酸液，以停止反應作用。 (j) 判讀：陽性血清，呈黃顏色反應，可用肉眼直接判定。但為求判定標準的一致性，需藉ELISA光度比色判讀機以波長492 nm測定每孔吸光值。同一盤內，任何血清的吸光值只要超過陰性對照血清平均吸光值的兩倍以上即判為陽性。 2. 間接螢光抗體試驗(Indirect fluorescent antibody test)： 亦可以間接螢光抗體試驗再予以確認。 (1) 試驗步驟： (a) 將感染假性狂犬病病毒之豬腎細胞株作成每mL含5 ×105個細胞懸浮液。然後利用cytospin將細胞離心至玻片上，風乾後再以丙酮於室溫中固定10分鐘。感染細胞抹片可存放在-20 ℃冰櫃，以便隨時取用。 (b) 欲測血清經56 ℃ 處理30分鐘。 (c) 欲測血清、陽性和陰性對照血清先以食鹽緩衝液適當稀釋後分別滴於假性狂犬病病毒感染細胞抹片和未感染對照細胞抹片。放置37 ℃潮濕箱盒內感作一小時。 (d) 抹片經磷酸緩衝溶液清洗過後再以蒸餾水清洗一次。 (e) 在每一抹片上滴上稀釋50倍之抗豬免疫球蛋白螢光標示抗體，或異硫氰酸螢光素標幟蛋白 A 液體。放置 37 ℃ 潮濕箱盒內感作一小時。 (f) 抹片經磷酸緩衝溶液清洗過後再以蒸餾水清洗一次。 然後滴上一滴磷酸緩衝溶液 / 甘油混合液，蓋上蓋玻片後於螢光顯微鏡下鏡檢。 (g) 判讀：先觀察陽性和陰性對照血清，陽性對照血清只能於感染細胞抹片呈現特異性螢光，而其他均需為陰性。若欲測血清於感染細胞呈現特異性螢光時則判為陽性。 3. 病毒中和試驗（Virus neutralization；VN）： (1) 細胞：凡對假性狂犬病病毒具有感受性的細胞皆可使用，一般常用的細胞株包括：豬腎細胞株（PK-15）。 (2) 標準病毒株之製備及其力價測定：以十倍稀釋已製備完成之標準病毒後，接種於細胞已長成之九十六孔微量培養盤中，每一稀釋倍數至少接種四孔，連續觀察三天並紀錄細胞病變出現之情形，以Reed & Muench的公式，來計算標準病毒株之力價。 (3) 血清樣品：送檢之血清樣品必須先經56 ℃加熱感作三十分鐘以去除血清中之補體；陽性對照血清必須先行測驗其抗體力價，而陰性對照血清則採取自無特定病原（specific pathogen free；SPF）豬隻。 (4) 先於九十六孔盤內加入MEM 細胞培養液，每孔均加入50 μL。 (5) 將未稀釋之待測血清置於九十六孔盤最下層之H列，每個樣品加入鄰近兩孔，每孔均加入50 μL。（如附錄） (6) 以十二爪微量吸管（multichannel pipette）在H 列將血清與MEM 細胞培養液充分混合，吸出50 μL移注至G列，再以十二爪微量吸管與MEM充分混合，再吸出50 μL移注至F列，重複上述步驟將血清自H列以連續兩倍稀釋至A列，最後從A列吸取50 μL混合稀釋液丟棄。 (7) 將標準病毒以MEM 細胞培養液作適當稀釋，使病毒濃度為100 TCID50 / 50 μL（即2×103 TCID50 / mL），每孔加入50 μL 稀釋標準病毒液。 (8) 將消化下來的細胞配製成濃度為1.5×105 / μL的懸浮液，每孔加入100 μL 細胞懸浮液。 (9) 將已稀釋好之九十六孔盤置於震盪器上震盪一分鐘以混合均勻病毒及血清後，置於37 ℃ 5 ﹪二氧化碳培養箱中感作一小時。 (10) 每次試驗均需置對照組，包括病毒對照、細胞對照、陽性血清對照、血清對照（為測試該批血清是否具細胞毒性）、陰性血清對照等。 (11) 病毒對照：將已稀釋之標準假性狂犬病病毒（100 TCID50 / 50 μL）以MEM細胞培養液再進行1/10、1/100、1/1,000、1/10,000及1/100,000等連續稀釋，再取50 μL上述已稀釋好的病毒液加入九十六孔盤內，每一稀釋倍數至少加入五孔，每孔再加入50 μL MEM細胞培養液，震盪混合均勻後置於37 ℃細胞培養箱中感作一小時後，再加入100 μL上述已配製好之細胞懸浮液。 (12) 細胞對照：上述製備好的細胞懸浮液每孔加入100 μL至少要加入兩格，每格再加入最低必須培養液100 μL。 (13) 陽性對照：拿已知中和抗體力價的血清作為陽性對照，必須做5個稀釋倍數，例如該血清的力價已知為T，則必須做的5個稀釋倍數為T、T/2、T/4、2T及4T。加入病毒與細胞液的懸浮量與感作方式如前述。 (14) 血清對照：這是為了要測知該批測試血清是否有細胞毒性，將50 μL的血清加入50 μL的最低必須培養液，置於37 ℃恆溫箱中震盪感作1小時後，加入如上述製備好的細胞懸浮液100 μL，其餘步驟如前述。 (15) 陰性對照：無定病原豬隻的血清作為陰性對照血清，其操作方法與前述檢測血清的操作方法相同。 (16) 判讀:在作用48-72小時後於顯微鏡下觀察其細胞病變作用(CPE)，或以甲基藍固定液染色，尚有細胞附著的部分則可染上深藍色，而發生細胞病變作用的地方則不被染色。 4. 免疫墨漬試驗 (Immunoblotting test)： 免疫墨漬試驗可用以取代間接螢光抗體試驗確認疑陽性個體血清。 (1) 抗原條帶膜的製備： (a) 免疫墨漬試驗用之感染細胞質內可溶性病毒蛋白的製備與 ELISA 抗原的製備同。 (b) 利用已知分子量蛋白液作標準對照，將製備抗原與標準分子量蛋白液分別於17 ﹪ Acrylamide /N,N'-diallytartardiamide（DATD）膠體片上電泳。 (c) 電泳後，將膠體片與14 ×14平方公分大小的硝纖膜（Nitrocellulose membrane）一起放入含20﹪甲醇之 pH 8.3，196 mM甘胺酸，25 mM Tris-HCl 轉移溶液內（Transfer buffer）。以 5 mA/cm 定電流電泳，將膠體片上的蛋白轉移至硝纖膜上。 (d) 纖膜經乾燥後於蛋白面上作記號。 (e) 從邊緣切取出一條帶狀膜並進行下述免疫墨漬試驗步驟。與標準分子量蛋白比對，標出23-35 KDa分子量蛋白部位。然後橫切成寬0.5 cm條帶狀並於蛋白面上作記，即成抗原條帶膜。這些抗原條帶膜（長約4公分）上或耐過豬血清內的抗體相互作用。 (2) 試驗步驟： (a) 將抗原條帶膜浸入阻斷緩衝液（Blocking buffer；含 2 ﹪ 脫脂奶粉之 PBS 溶液）內。於37 ℃ 不停搖動，作用 30 分鐘。 (b) 將欲測血清以及陽性和陰性對照血清以阻滯緩衝液作 40 倍稀釋。 (c) 將抗原條帶膜浸入欲測血清稀釋液內，於37 ℃ 不停搖動，作用45分鐘。同樣將兩條抗原條帶膜分別浸入陽性和陰性血清稀釋液內，以供對照用。作用時間結束後將抗原條帶膜以阻滯緩衝液清洗四次，最後一次則將抗原條帶膜浸泡於阻滯緩衝液內並不停地搖動5分鐘。 (d) 經阻斷緩衝液適當稀釋後將山洋葵過氧化酶標幟蛋白A加入每一抗原條帶膜並於37 ℃不停搖動，作用45分鐘。然後，以阻滯緩衝液清洗四次，最後一次則將抗原條帶膜浸泡於阻滯緩衝液內並不停地搖動5分鐘。 (e) 配製受質溶液，加入每一抗原條帶膜後於室溫中不停地搖動作用5-15分鐘。 (f) 氯奈酚受質溶液的配製：受質溶液使用時才配製。將 2 mg 之 4-氯1-奈酚 (4-chloro -1- Naphthol) 溶解於 2 mL 甲醇內。然後，慢慢加入攪拌中之 10 mL PBS 溶液。再以Whatman 1 號濾紙過濾，除去白色沉澱物。然後在過濾液內加入 4 μL 之 30 ﹪雙氧水。 (g) 當病毒蛋白條紋呈現清楚黑色時以蒸餾水停止其反應作用。 (h) 判讀：陽性欲測血清會與抗原條帶膜上一種以上的病毒蛋白作用，其作用模式及呈色強度和陽性對照血清同。 附錄 1. 實驗室器械及廢棄物之處理 剩餘病材：可暫時密封冷凍保存於-70 ℃專用冰櫃待實驗流程圓滿完成後，取出經 120 ℃，20 分鐘之高壓蒸汽消毒後焚燬。 可重覆使用之器械如刀剪、鑷子等收集於密閉容器內經高壓蒸汽處理後清洗。 丟棄式之隔離實驗室衣帽和手套，收集於密閉袋內經高壓蒸汽處理後方可丟棄或焚燬。 2. 
A. 冷凍切片或抹片假性狂犬病螢光標示抗體染色檢查。細胞質內呈現顆粒狀特異性螢光者判為陽
性。8 小時確診。B. 10-20 % 乳劑 B1. 聚合酶鏈反應。電泳後有1127個 bp 產物者判為陽性。8 小時確診。 B2. 接種豬腎細胞株培養，有細胞病變作用者需作螢光標示抗體染色檢查。2-4 天確診。 B3. 動物接種試驗包括 1. 健康兔 2. 無特定病原豬。若接種兔其接種部位呈現搔癢症狀：假性狂犬病；接種無特定病原豬之未免疫組體溫超過40 ℃，而已免疫豬隻則無任何臨床症狀：假性狂犬病。所有接種豬隻皆須進行病理解剖和冷凍切片之假性狂犬病螢光標示抗體染色檢查，以及所有臟器之病毒分離。3-7 天確診。 C. 依據酵素結合免疫吸附試驗檢測血清中是否含有抗假性狂犬病毒抗體存在之結果做判定。
另外，亦可依據間接螢光染色法。若細胞核出現特異性螢光，判定感染假性狂犬病。